彭 雪，邵洪江，候春梅，趙 永，陳 鶴

哈爾濱醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

損傷時間推斷是法醫(yī)病理檢驗過程中需要解決的一個關鍵問題，準確的損傷時間不僅能夠重建案件過程，并且有助于判斷損傷與死因之間的關系。在很多刑事案件中，骨骼肌挫傷出現(xiàn)的頻率非常高。然而，目前大多數(shù)關于法醫(yī)損傷時間推斷的研究都集中在人和小鼠皮膚損傷愈合過程中，有關骨骼肌挫傷時間的推斷研究相對較少［1］。

鈣敏感受體（calcium sensing receptor，CaSR）作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，已證實其能夠通過感應細胞外Ca2+濃度變化來調(diào)控胞漿內(nèi)Ca2+濃度，從而影響細胞增殖、凋亡等。CaSR最主要的生理功能是參與體內(nèi)Ca2+及其他金屬離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，同時還參與細胞增殖、分化、凋亡、離子通道活化、基因表達以及炎癥反應等過程［2］。當前，CaSR 的研究主要集中在腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、肺動脈高壓、缺血性腦卒中以及甲狀旁腺功能亢進等，很少有研究涉及CaSR 與骨骼肌挫傷修復。已有研究［3］證實，骨骼肌再生與Ca2+關系密切。據(jù)此，研究者推測CaSR可能參與了骨骼肌挫傷修復。

因此，本實驗建立大鼠骨骼肌挫傷修復模型，采用HE 染色方法觀察大鼠骨骼肌損傷后的形態(tài)學變化，檢測骨骼肌挫傷后鈣離子濃度變化，并應用免疫組織化學染色和實時熒光定量PCR 技術檢測各組CaSR 的表達變化，為法醫(yī)學損傷時間的推斷提供新的思路和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

取SD 大鼠（180～220 g）50 只，動物等級：SPF 級，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，SYXK （黑）2019-001。隨機分為10組：對照組1組、實驗組9組，每組又分為3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d時間段，每個時間段使用5只大鼠。每個時間段的大鼠以消毒飼料及蒸餾水分籠飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢。

1.2 大鼠骨骼肌挫傷模型的制作

用10%水合氯醛（25 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用重500 g的自制打擊器，從54 cm高處自由垂直落下打擊動物右側(cè)腓腸肌，重力為4.9 N，動能為2.646 J，打擊面積約0.785 cm2。按時在損傷后不同時間將大鼠脫頸椎致死，取損傷處骨骼肌，迅速放入4%多聚甲醛/PBS 中固定12 h 后用石蠟包埋，切片。余下骨骼肌4 ℃蒸餾水中洗凈，液氮凍干，-80 ℃保存用于實時熒光定量PCR檢測。

1.3 HE染色

二甲苯、梯度酒精對組織切片脫蠟至水；蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水返藍、伊紅染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學染色

組織切片后，脫蠟，透明。切片分別加入兔抗大鼠CaSR 多克隆抗體（1∶100，PB9924，武漢博士德公司），4 ℃過夜孵育后，沖洗。滴加生物素化羊抗兔二抗，室溫孵育，沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶，室溫，沖洗。DAB顯色。在×400倍鏡下，每張切片分別于挫傷中心區(qū)及周邊區(qū)各隨機選擇10個視野進行CaSR陽性細胞計數(shù)。挫傷周邊區(qū)限定范圍為挫傷中心區(qū)邊界至其外200 μm 內(nèi)。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行形態(tài)學觀察和分析，計算各挫傷組陽性細胞數(shù)平均值。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

肌肉組織低溫充分勻漿后，按照PrimeScriptTM RT 試劑盒［DRR037S，寶生物工程（大連）有限公司］操作說明書，抽提總RNA，取總RNA 5 μL，在20 μL 逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以5 μL cDNA 為模板加入靶基因上下游引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用ABI 7500 Real-Time PCR System PCR 儀進行擴增。最后，用2-ΔΔCT統(tǒng)計學方法分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌挫傷后形態(tài)學變化

骨骼肌經(jīng)HE 染色后在100 倍光鏡下觀察，評估肌肉損傷后的形態(tài)變化。對照組大鼠骨骼肌細胞胞質(zhì)呈粉紅色，肌細胞核呈卵圓形、藍色，多個細胞核位于骨骼肌細胞邊緣。骨骼肌挫傷后6 h 可見骨骼肌肌纖維間大量出血；12 h 可見出血伴炎細胞浸潤；挫傷后1 d 炎細胞繼續(xù)增多；挫傷3 d 可見壞死肌纖維伴逐漸增多的炎性細胞浸潤；挫傷后5 d，少量新生肌細胞出現(xiàn)，肌細胞核位于細胞中央；挫傷后第7～10 d，新生肌細胞增多，炎性細胞逐漸減少；挫傷后第14 d，肌細胞大都位于肌纖維的邊緣，肌細胞境界分明，排列規(guī)則，中央成核肌細胞幾乎消失，見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌HE染色結(jié)果（×400，標尺=50 μm）

2.2 正常對照組與挫傷組大鼠骨骼肌CaSR 的免疫組織化學染色結(jié)果

CaSR 在骨骼肌挫傷后1 d 表達增加，挫傷后3 d 表達進一步增加，挫傷后5 d 表達至頂峰，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨后CaSR表達開始減少，挫傷后14 d恢復至正常對照組水平（圖2、圖3）。

圖2 各組大鼠骨骼肌不同時間點CaSR的表達（×400，標尺=50 μm）

圖3 挫傷骨骼肌CaSR蛋白水平檢測

2.3 正常對照組與挫傷組大鼠骨骼肌CaSR mRNA的表達

CaSR mRNA 在骨骼肌挫傷后6 h 開始呈規(guī)律性增加，挫傷后5 d 至高峰，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨后表達減少，挫傷后14 d恢復至正常對照組水平，見表1。

表1 肌肉挫傷后不同時間點CaSR mRNA表達量（±s）

表1 肌肉挫傷后不同時間點CaSR mRNA表達量（±s）

組別對照組挫傷后3 h組挫傷后6 h組挫傷后12 h組挫傷后24 h組挫傷后3 d組挫傷后5 d組挫傷后7 d組挫傷后10 d組挫傷后14 d組CaSR mRNA 1.000±0.235 1.211±0.145 2.402±0.423 3.766±0.045 4.523±0.409 6.298±0.321 9.586±0.576 7.020±0.214 3.562±0.478 1.298±0.607

3 討論

損傷時間推斷是法醫(yī)病理工作者實踐中重要的工作內(nèi)容之一。在法醫(yī)學實踐中，損傷時間推斷涉及不同器官組織，但現(xiàn)有研究主要集中在皮膚和腦，其他器官組織的研究較少，部分器官組織甚至為空白。由于不同器官組織結(jié)構(gòu)不同，損傷修復機制存在顯著差別，不能將某種器官組織損傷時間推斷的研究成果用于其他器官組織［1］。而本研究報道了大鼠骨骼肌挫傷后不同時間點的形態(tài)學變化以及骨骼肌中CaSR 蛋白和mRNA 水平動態(tài)變化趨勢，為法醫(yī)學損傷時間推斷的研究提供了全新的依據(jù)。

骨骼肌挫傷后肌肉纖維因為受損，處于靜止的衛(wèi)星細胞被激活并形成新的成肌細胞。隨后，成肌細胞與現(xiàn)有的損傷肌纖維融合，最終形成新的肌管或者修復受損肌纖維。HE 染色結(jié)果顯示：骨骼肌挫傷后的早期可見明顯出血及以中性粒細胞、單核細胞等為主的炎細胞浸潤；挫傷后3 d，可見明顯壞死肌纖維伴逐漸增多的炎性細胞浸潤；挫傷后5 d，少量新生肌細胞出現(xiàn)，肌細胞核位于細胞中央；挫傷后第7～10 d，新生肌細胞增多，炎性細胞逐漸減少；挫傷后第14 d，肌細胞大都位于肌纖維的邊緣，肌細胞境界分明，排列規(guī)則，中央成核肌細胞幾乎消失。該結(jié)果與相關文獻報道具有一致性［4-5］，且規(guī)律呈現(xiàn)骨骼肌損傷后修復的3 個病理進程，即急性損傷炎癥期、修復期和組織塑形期［6-7］。

鈣敏感受體是鈣穩(wěn)態(tài)的關鍵系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑［8］，作為細胞外Ca2+濃度的調(diào)節(jié)劑，已被證明是生理學和病理學中的重要分子［9］。它屬于G蛋白偶聯(lián)受體，可感知細胞外的分子并激活內(nèi)部信號轉(zhuǎn)導通路，并最終激活細胞反應［10］。

CaSR 主要在甲狀旁腺內(nèi)表達，并調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的分泌，從而通過作用于腎臟、骨骼和腸道來將Ca2+濃度維持在生理范圍內(nèi)，進而控制鈣穩(wěn)態(tài)［8］。最初，CaSR 的研究集中在促鈣組織，如甲狀旁腺、腎臟和骨骼，這些組織在維持鈣穩(wěn)態(tài)方面具有明顯的作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CaSR 在許多其他細胞和器官（如神經(jīng)元、肺、皮膚、胎盤、乳房和血管）中表達，在維持鈣穩(wěn)態(tài)方面沒有任何明顯作用［2］。此外，最近的一些研究［11-14］已經(jīng)觀察到CaSR在細胞（如角質(zhì)形成細胞、心肌細胞和神經(jīng)元）的生理分化以及平滑肌收縮和增殖中發(fā)揮重要作用。

最近，在一項探索健康人類骨骼肌中CaSR 的研究中，有學者發(fā)現(xiàn)CaSR不參與肌纖維的生成［15］。然而，本研究免疫組織化學染色結(jié)果以及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果均證實，挫傷后CaSR呈規(guī)律性表達。挫傷早期CaSR表達開始增加，挫傷修復期CaSR 表達達到頂峰，隨后開始下降至正常水平。還有一項最近的研究報道，運動所致的局部肌肉損傷會激活一種不依賴于肌肉干細胞的肌纖維自我修復機制，小鼠的肌肉損傷觸發(fā)了涉及鈣離子和磷酸激酶C的信號級聯(lián)反應［16］。

同時，通過免疫組化染色結(jié)果，研究者還發(fā)現(xiàn)在挫傷后的炎癥期內(nèi)，CaSR 主要定位于中性粒細胞和單核細胞。挫傷進入修復期后，在成纖維細胞以及新形成的成肌細胞中均可見CaSR 蛋白大量表達。同時，諸多研究已證實，CaSR 能夠參與炎癥細胞的調(diào)控［17］。而骨骼肌挫傷修復與炎癥細胞關系密切，因此，CaSR 參與的骨骼肌挫傷修復，很可能有多條途徑，可能通過調(diào)控炎癥細胞進而促進肌纖維再生，或者直接作用于肌纖維，這需要進一步的研究證實。

綜上所述，研究者認為CaSR 參與了骨骼肌挫傷后修復愈合的過程，并在挫傷后的不同階段發(fā)揮了不同作用。同時，CaSR 的表達與骨骼肌損傷時間具有一定的相關性，可以為骨骼肌損傷時間推斷提供參考依據(jù)。