石保旭　鄭夢霞　向云攀　王波　石嬌嬌　陳九江　唐杰　萬華蘭　張品荔

摘要：旺蒼縣茶樹種質(zhì)資源豐富，茶種業(yè)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)種質(zhì)資源圃收集保存了大量本地和國內(nèi)外代表性茶樹資源。本研究利用SSR分子標(biāo)記檢測技術(shù)對旺蒼縣茶樹資源圃保存的部分資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，為檢測資源建立了準(zhǔn)確的分子身份證；對17份本地古茶樹資源進(jìn)行了理化成分的全面測定，篩選鑒定出1份低咖啡堿種質(zhì)。研究結(jié)果對旺蒼縣茶樹種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析和新品種選育具有重要意義。

關(guān)鍵詞：茶樹；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；分子身份證

中圖分類號：S571.1；S330? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1000－3150（2023）07-46-8

Genetic Diversity Analysis and Molecular ID

Construction of Tea Resources in Wangcang County

SHI Baoxu1， ZHENG Mengxia2， XIANG Yunpan1*， WANG Bo1*， SHI Jiaojiao2，

CHEN Jiujiang1， TANG Jie3， WAN Hualan1， ZHANG Pinli3

1. Sichuan Wangcang County Tea Industry Technology Research Institute， Wangcang 628200， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Agricultural and Rural Bureau of Wangcang County， Sichuan Province， Wangcang 628200， China

Abstract： Wangcang County is rich of tea germplasm resources. A large number of local and abroad representative tea germplasm resources had been collected and preserved in the tea germplasm resource nursery of modern agricultural park. In this study， SSR molecular marker detection technology was used to analyze the genetic diversity of some tea resources preserved in the resource nursery in Wangcang County， and an accurate molecular identity system was established for the detection of germplasm resources. The physical and chemical components of 17 local ancient tea resources were comprehensively determined， and one low caffeine germplasm was identified. The results are of great significance for the identification， genetic diversity analysis of tea germplasm resources and new cultivar breeding in Wangcang County.

Keywords： tea plant （Camellia sinensis）， SSR molecular marker， genetic diversity， molecular identity card

茶樹是世界上最重要的飲料經(jīng)濟(jì)作物之一，被廣泛種植于全世界超過50個(gè)國家和地區(qū)。地處四川盆地北緣、米倉山南麓的旺蒼縣，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，土壤富硒富鋅，適宜茶樹生長。旺蒼縣茶樹種質(zhì)資源豐富，大兩鎮(zhèn)等地古茶樹分布較為集中且保存完善。2020年建設(shè)的茶種業(yè)園區(qū)，具有茶樹種質(zhì)資源保護(hù)、品種創(chuàng)新、種苗繁育等功能，在木門鎮(zhèn)三合村建成的茶樹資源圃收集保存本地和國內(nèi)外代表性資源350份。種質(zhì)資源是開展茶樹種質(zhì)創(chuàng)新和新品種開發(fā)的重要基礎(chǔ)，因此，對旺蒼縣境內(nèi)茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究具有重要意義。

20世紀(jì)80年代以來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)早已成為研究植物遺傳多樣性和遺傳演化的有效工具。其中，簡單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple sequence repeat，SSR），具有重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、通用性高、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，2005年起就被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UP-OV）推薦作為建庫優(yōu)選的標(biāo)記。Yao等[1]利用96對EST-SSR分子標(biāo)記研究了來自我國14個(gè)茶區(qū)的450份資源，發(fā)現(xiàn)來自廣西、云南和貴州的茶樹遺傳多樣性最高，距離這些茶樹起源中心越遠(yuǎn)，遺傳多樣性逐漸降低。毛娟等[2]發(fā)現(xiàn)樣本量在40個(gè)時(shí)，能夠較好地反映云南白鶯山茶樹資源的遺傳多樣性。羅亦紓等[3]通過21對SSR引物對35份重慶大茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行研究，結(jié)果顯示其中南川1號和南川2號的親緣關(guān)系最近。劉冠群等[4]利用SSR分子標(biāo)記為24份名山良種繁育場具有代表性的茶樹品種構(gòu)建二維碼身份證。李長樂等[5]利用SSR分子標(biāo)記對來自12個(gè)省份的地方群體品種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)供試種質(zhì)可劃分為四大類型，具有明顯的地域分布規(guī)律。

本研究利用15對SSR引物對旺蒼縣茶樹資源圃保存的資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，建立起保存資源的分子身份證，以期從分子生物學(xué)角度對茶樹資源快速準(zhǔn)確區(qū)分。同時(shí)在種質(zhì)資源豐富的大兩鎮(zhèn)選取了17份茶樹種質(zhì)資源，進(jìn)行理化成分（5項(xiàng)常規(guī)和兒茶素組成）的測定分析，為利用旺蒼本地資源進(jìn)行本土化優(yōu)質(zhì)品種選育提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究共采集種植于旺蒼縣茶樹種質(zhì)資源圃內(nèi)的160份茶樹資源的葉片組織，樣品采集后液氮迅速冷凍處理，保存在－80 ℃冰箱中備用。另在大兩鎮(zhèn)采集17份茶樹新梢，制成曬青干茶用于內(nèi)含物檢測。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取

將各份材料分別磨樣，使用艾德萊CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（DN14）提取樣品全基因組DNA，并用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用超微量分光光度計(jì)檢測其濃度，樣品檢測合格后－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

15對SSR熒光引物的信息（表1）參考Ma等[6]、譚禮強(qiáng)[7]和徐禮羿等[8]的文獻(xiàn)報(bào)道。PCR反應(yīng)體系為KAPA 2G Robust Mix 7 μL，模板DNA 1 μL，Primer-F、Primer-R（10 mmol/L）各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度根據(jù)所用引物確定），72 ℃延伸1 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用3730 xl DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測。

1.2.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用PowerMarker和PopGene統(tǒng)計(jì)每對引物在160個(gè)茶樹品種中擴(kuò)增等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、基因型數(shù)（Genetype）和多態(tài)性信息量（PIC）。運(yùn)用PowerMarker計(jì)算各品種間的Nei's遺傳距離，并基于Nei's遺傳距離進(jìn)行Neighbor-Joining聚類分析。

1.2.4? 茶樹SSR分子身份證構(gòu)建

根據(jù)每對引物在不同品種上擴(kuò)增的等位基因數(shù)進(jìn)行賦值，賦值方法參考張小雙[9]的方法：將每對引物在每個(gè)材料上擴(kuò)增出的等位基因從小到大排列，并用阿拉伯?dāng)?shù)字1～9進(jìn)行編碼，當(dāng)基因數(shù)大于9時(shí)，分別用a、b、c……進(jìn)行編碼，以此類推，即可得到由26位數(shù)字或字母組成的分子身份證。

1.2.5? 理化成分測定

水浸出物含量按照《茶 水浸出物測定》（GB/T 8305—2013）全量法測定；游離氨基酸含量按照《茶 游離氨基酸總量的測定》（GB/T 8314—2013）茚三酮比色法測定；咖啡堿含量按照《茶 咖啡堿的測定》（GB/T 8312—2013）紫外分光光度法測定；茶多酚和兒茶素類含量按照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）測定。

2? 結(jié)果與分析

2.1? SSR引物的多態(tài)性

15對SSR引物對160份供試材料的遺傳多樣性分析結(jié)果如表2所示。15對SSR引物共擴(kuò)增出144個(gè)等位基因（A），各引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為4～19個(gè)，平均9.6個(gè)；Ne為2.51～10.87個(gè)，平均5.31個(gè)；共檢測到441個(gè)基因型，平均每對引物為29個(gè)。Ho最大值為0.956 3，最小值為0.562 5，平均值為0.733 8；He最大值為0.910 9，最小值為0.604 0，平均值為0.777 2，Ho小于He，表明在群體內(nèi)存在非隨機(jī)交配現(xiàn)象。I變化范圍較大，為1.050 2～2.547 5，平均1.757 8。H為0.602 1～0.908 0，平均值為0.774 8。各引物擴(kuò)增的PIC為0.520 3～0.900 8，平均為0.742 4，15對引物均為多態(tài)性高（PIC>0.50）的引物，尤其以CsFM1823引物的PIC最高，為0.900 8，擴(kuò)增得到等位基因18個(gè)，基因型個(gè)數(shù)66個(gè)。

2.2? 基于SSR標(biāo)記的聚類分析

基于15對SSR引物等位基因出現(xiàn)的頻率計(jì)算Nei′s遺傳距離（D），并由此對160個(gè)供試材料進(jìn)行Neighbor-Joining聚類分析。聚類結(jié)果如圖1所示，160份材料可劃分為3個(gè)大的類群，類群間資源數(shù)量相當(dāng)，且類群內(nèi)部聚類分支多樣。已知龍井黃是龍井43芽變后代，二者聚于同一分支；白雞冠后代、極白茶等來自白化茶樹的資源均聚于同一分支。

2.3? 分子身份證編碼

根據(jù)前文提及的等位基因賦值標(biāo)準(zhǔn)，將15對SSR引物對每份茶樹樣品的擴(kuò)增結(jié)果按照從小到大的順序排列，將其轉(zhuǎn)換為字符進(jìn)行串聯(lián)排列，并用阿拉伯?dāng)?shù)字和英文小寫字母進(jìn)行賦值。例如，引物CsFM1068對全部供試材料擴(kuò)增共獲得19個(gè)等位基因，最小為188 bp，最大為257 bp。將全部等位基因從小到大進(jìn)行排列，即等位基因188 bp賦值為1，以此類推，等位基因257 bp賦值為j。根據(jù)以上方法，獲得了每份材料的分子身份證（表3）。

2.4? 旺蒼縣地方茶樹種質(zhì)資源主要理化成分分析

理化成分檢測結(jié)果（表4）表明，旺蒼縣大兩鎮(zhèn)收集的種質(zhì)資源樣品水浸出物含量為46.6%～53.2%（平均49.5%）；茶多酚含量為16.4%～23.0%（平均18.9%）；游離氨基酸含量為1.8%～3.9%（平均2.7%）；酚氨比為5.1～12.3（平均7.2），其中6個(gè)樣品（大兩1、大兩3、大兩8、大兩13、大兩16和大兩19）的酚氨比低于7，具有適制綠茶的物質(zhì)基礎(chǔ)；咖啡堿含量為0.7%～4.1%（平均2.6%），其中大兩11的咖啡堿含量極低，僅為0.7%，具有選育低咖啡堿品種的潛力；表沒食子兒茶素（EGC）為2.41%～5.67%、DL-兒茶素（DL-C）為0.18%～0.75%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）為4.83%～10.41%、表兒茶素（EC）為0.68%～1.73%、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）為1.10%～2.63%，兒茶素品質(zhì)指數(shù)為142.79～486.31（平均241.88），兒茶素品質(zhì)指數(shù)愈大，則鮮葉嫩度和品質(zhì)愈好。

3? 小結(jié)與討論

黃丹娟等[10]以13個(gè)湖北省優(yōu)良茶樹品種為供試材料，采用30對SSR熒光引物進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示平均等位基因數(shù)為4.83，平均PIC為0.58；劉冠群等[11]篩選出7個(gè)SSR標(biāo)記對24份名山茶樹進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)平均等位基因數(shù)為4，平均PIC為0.56；毛娟等[12]利用30對茶樹核心SSR引物在對3個(gè)代表性的野生和栽培大理茶居群中檢測到的平均等位基因數(shù)為5.9，平均PIC為0.491。本研究所用的15對引物在160份材料中共擴(kuò)增出144個(gè)位點(diǎn)，平均每對引物檢測到9.6個(gè)位點(diǎn)，平均PIC為0.742 4，所有引物的PIC>0.5，說明本研究選用的15個(gè)SSR標(biāo)記表現(xiàn)出很高的多態(tài)性和雜合性，保證了每份材料都具有獨(dú)特的分子身份證。本研究分析獲得的160份茶樹資源基因多樣性范圍在0.602 1～0.908 0，平均值為0.774 8，說明資源圃收集保存的茶樹具有較高的遺傳多樣性。將供試材料聚類分為3個(gè)類群，且與供試材料的原產(chǎn)地關(guān)系較小，下一步可以利用這些資源進(jìn)行人工雜交等創(chuàng)制新種質(zhì)和選育新品種。

分子身份證與指紋圖譜的功能相同，但指紋圖譜存在譜帶較多、人工比對低效和繁瑣等問題，限制了其在大規(guī)模品種鑒定中的使用。而分子身份證是將指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化得到字符串形式的結(jié)果，可以通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)比對，特別是條形碼身份證可以被掃碼器快速識別。目前，許多植物已利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子身份證。張梟等[13]將14對SSR引物獲得的相應(yīng)等位基因賦值編碼，串聯(lián)構(gòu)建山楂資源的分子身份證；李慧峰等[14]利用SSR熒光標(biāo)記繪制了41份山東省蘋果資源的分子身份證；苑克俊等[15]構(gòu)建了4個(gè)杏新品系的分子身份證，為利用分子鑒定進(jìn)行品種權(quán)保護(hù)提供了依據(jù)；武志江等[16]從200對EST-SSR引物中篩選出20對核心引物，成功構(gòu)建了145份火龍果種質(zhì)資源的分子身份證。在構(gòu)建分子身份證時(shí)，常采用的編碼方法有3種，本研究選擇將每對引物擴(kuò)增的等位基因按從小到大排列、依次編碼的方法，從而獲得數(shù)字與字母結(jié)合的分子身份證，然后再轉(zhuǎn)化為條形碼，可以快速高效地對茶樹資源進(jìn)行鑒定。

研究表明，過量攝入咖啡堿會使人體產(chǎn)生焦躁不安、失眠、血壓升高等不良反應(yīng)。通常，茶葉中咖啡堿含量在3%～5%，若咖啡堿含量低于1%，則屬于低咖啡堿茶樹資源。目前，研究低咖啡堿茶已成為茶葉資源利用、茶葉精深加工及有機(jī)食品開發(fā)等領(lǐng)域的重要課題。唐一春等[17]從保存在勐海國家茶樹種質(zhì)分圃的100份茶樹資源中篩選出2份咖啡堿含量分別為0.07%和0.06%的茶樹種質(zhì)。楊維時(shí)等[18]嘗試用茶樹與油茶嫁接選育低咖啡堿茶樹品種。本研究對17份來自旺蒼縣大兩鎮(zhèn)的種質(zhì)資源進(jìn)行理化成分測定，發(fā)現(xiàn)1份樣品的咖啡堿含量僅為0.7%，有望作為選育低咖啡堿茶樹品種的材料。

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作者簡介：石保旭，男，推廣研究員，主要從事茶園綠色防控、種質(zhì)資源保護(hù)等工作。*通信作者，E-mail：1078062045@qq.com；1403878669@qq.com