汪小桐 戴碗琴

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院（籌）檢驗科，上海 201600

細菌耐藥問題已成為世界性難題，新型移動性基因元件-整合子的發(fā)現(xiàn)為人類研究細菌耐藥帶來了新的方向和挑戰(zhàn)。整合子可通過位點特異性重組捕獲耐藥基因，使耐藥基因在細菌中水平播散［1］。因整合子在細菌耐藥機制中的重要作用，引起研究者的廣泛關(guān)注。

細菌耐藥現(xiàn)狀

抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致耐藥菌層出不窮，“超級細菌”的出現(xiàn)更是給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。新型抗菌化合物及增效劑的研發(fā)是應(yīng)對細菌耐藥的主要手段，然而細菌突變和自由轉(zhuǎn)換速度遠遠超過新藥研發(fā)速度，細菌耐藥形勢嚴(yán)峻。2014 年英國政府委托相關(guān)人員進行研究顯示，全球每年約70 萬人的死亡是與細菌耐藥性有關(guān)，如對現(xiàn)狀不加以控制，預(yù)計2050 年因細菌耐藥造成的經(jīng)濟損失將達100 萬億美元，死亡人數(shù)約1 000 萬人［2］。美國疾病預(yù)防控制中心研究報告稱，2019 年到2020 年新型冠狀病毒大流行高峰之后，美國抗菌藥物耐藥性總體上升15%［3］。為遏制細菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展，研究者們對引起細菌耐藥的機制及播散原因進行了大量及深入研究［4-6］。20 世紀(jì)70 年代，人們大致確定了細菌耐藥與可傳播質(zhì)粒有關(guān)，直到1989年Stokes和Hall［7］首次發(fā)現(xiàn)整合子，并通過研究認(rèn)識到整合子幾乎存在于所有環(huán)境中，是細菌獲得抗生素抗性基因的主要機制［8］。

整合子的結(jié)構(gòu)與功能

整合子是研究者在對耐藥質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進行相關(guān)研究時發(fā)現(xiàn)的一種移動性基因元件，其主要通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進行轉(zhuǎn)移［9］。整合子主要由5′保守區(qū)、3′保守區(qū)及中間的可變區(qū)組成。5′保守區(qū)主要包括編碼整合酶的基因intI及其啟動子Pint、重組位點attI和可變區(qū)的啟動子Pc［10］，3′保守區(qū)因整合子種類的不同而有所差異，可變區(qū)由數(shù)量不等的基因盒組成。

整合子主要根據(jù)整合酶氨基酸序列的不同進行分類，目前，常見的整合子可分為4 類：第1 類整合子因其獨特的進化優(yōu)勢，導(dǎo)致其在臨床菌株中分布最廣，與細菌耐藥性關(guān)系最為密切［11］；第2 類整合子整合酶基因intI2 與intI1 有40%的同源性，但大部分第2類整合酶在編碼第178個氨基酸后插入一個終止密碼子TAA，不能翻譯成完整的整合酶蛋白，為無功能性第2 類整合子，不具有整合與剪切耐藥性基因盒的能力［12］；第3 類整合子目前在臨床上較為少見，首次由Arakawa 等［13］于1995年在耐碳青霉烯類抗菌藥物的黏質(zhì)沙雷菌中的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)，2003 年在肺炎克雷伯菌中也分離出了第3 類整合子［14］；第4 類整合子可攜帶上百個基因盒，稱為超級整合子。目前，有研究認(rèn)為超級整合子是耐藥整合子上基因盒的主要來源［15］。

整合子可通過位點特異性重組捕獲與表達耐藥性基因盒，使耐藥基因水平轉(zhuǎn)移，在細菌耐藥性產(chǎn)生和播散中起到至關(guān)重要的作用。

基因盒的結(jié)構(gòu)與表達

基因盒是一種大小為500～1 000 bp 的游離環(huán)狀的可移動性基因元件，主要編碼耐藥基因，含有重組位點attC，該位點為整合酶識別位點。大部分基因盒不含有啟動子，其主要利用整合酶基因上的Pc 啟動子進行轉(zhuǎn)錄表達。整合子中基因盒通過不同的機制在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上進行調(diào)節(jié)，是一個嚴(yán)格而復(fù)雜的過程。

1.Pc啟動子在基因盒轉(zhuǎn)錄中的作用

基因盒一般以5′至3′的方向整合入整合子的attI位點，在上游整合子可變區(qū)啟動子Pc 的作用下得以表達，少數(shù)整合子啟動子Pc下游還存在啟動子P2［16］。

目前，在第1類整合子中發(fā)現(xiàn)13種Pc啟動子、4種P2啟動子以及多種Pc+P2 啟動子組合［17-18］。在臨床和自然環(huán)境中最常見的Pc 啟動子是強Pc 啟動子（PcS）、弱Pc 啟動子（PcW）、雜合Pc1 啟動子（PcH1）和雜合Pc2 啟動子（PcH2）。它們的分類基于相對轉(zhuǎn)錄強度，如PcH1 和PcS 在-35 區(qū)域的核苷酸序列分別為TGGACA 和TTGACA，二者僅有一個核苷酸不同，但轉(zhuǎn)錄強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PcS 強度約為PcH1 的6 倍［18-19］。具有不同活性的Pc 啟動子序列的多樣性表明，細菌中耐藥基因盒的表達因整合子中Pc 啟動子的不同存在明顯差異。

第2 類整合子attI2區(qū)域內(nèi)存在4 個潛在的Pc2 啟動子，分別為Pc2A、Pc2B、Pc2C 和Pc2D，分析Pc2 啟動子-35 和-10 區(qū)域的核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，Pc2A 與PcS 相似。第5 個Pc2 啟動子Pc2E 發(fā)現(xiàn)于intI2 編碼序列中［12，20］。通過對數(shù)百個第2 類整合子序列分析顯示，Pc2A 和Pc2B 啟動子具有多態(tài)性，Pc2變體介導(dǎo)基因盒轉(zhuǎn)錄時，效率低于典型的Pc2A和Pc2B。這一發(fā)現(xiàn)表明，Pc2 變體活性較弱，導(dǎo)致基因盒表達減少，這種現(xiàn)象可能與適應(yīng)性成本降低有關(guān)［20-22］。

第3類整合子基因盒的表達由啟動子Pc3介導(dǎo)，該啟動子位于intI3基因內(nèi)部，與第1 類整合子中啟動子Pc 位置相同，啟動子Pc3也存在變體。通過實驗測定第3類整合子中鏈霉素addA2的抗性進而反映啟動子Pc3強度，結(jié)果表明其強度與第1類整合子中啟動子PcW+P2的強度相當(dāng)［23］。

由于抗菌藥物的大量使用，細菌面臨更強的選擇壓力。Pc 啟動子序列通過隨機突變不斷出現(xiàn)新變體，使基因盒能夠有效表達，進而使細菌更好地適應(yīng)新的變化。

2.基因盒位置效應(yīng)對轉(zhuǎn)錄的影響

整合子中基因盒的位置對轉(zhuǎn)錄水平存在顯著影響，基因盒越靠近Pc 啟動子，其轉(zhuǎn)錄水平越高。早期研究者認(rèn)為基因盒的轉(zhuǎn)錄同樣受上游基因盒attC位點的調(diào)控。attC位點的特征是不完全反向重復(fù)序列，具有顯著保守的回文組織［24］，轉(zhuǎn)錄過程中當(dāng)其處于單鏈形式時，產(chǎn)生的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能在基因盒轉(zhuǎn)錄過程中起到轉(zhuǎn)錄終止子的作用，導(dǎo)致下游基因盒轉(zhuǎn)錄水平下降。后期通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并未影響轉(zhuǎn)錄本的總數(shù)量，認(rèn)為基因盒的轉(zhuǎn)錄并不受上游attC位點的影響［25］。

3.基因盒啟動子在基因盒轉(zhuǎn)錄中的作用

少數(shù)基因盒含有較長的5′未翻譯區(qū)域，這些區(qū)域可以為基因盒提供特定的啟動子，使基因盒即使遠離啟動子Pc，也能確保其有效表達［26］。第1 個被發(fā)現(xiàn)含有自身啟動子的基因盒為氯霉素耐藥基因cmlA1，實驗證實該啟動子PcmlA能有效介導(dǎo)cmlA1基因盒的轉(zhuǎn)錄并賦予載體氯霉素抗性［27］。

整合酶與整合子基因盒表達的相互作用

在第1 類整合子中，由于Pc 啟動子位于intI1編碼序列中［26］，其點突變導(dǎo)致intI1基因的非同義突變，從而引起整合酶氨基酸序列發(fā)生變化，影響第1 類整合子整合酶的重組活性。如前所述，第1 類整合子具有13 種Pc 啟動子，Pc 啟動子變體導(dǎo)致10 種IntI1編碼序列，其中3 種變體引起氨基酸序列改變，突變發(fā)生在第32 和39 位，分別為IntI1R32_H 39、IntI1R32_N39和IntI1P32_H39［17］。Jové等［17］研究整合酶變體活性時發(fā)現(xiàn)，第32 位殘基上由脯氨酸（P）替代精氨酸（R）、第39 位殘基由天冬酰胺（N）替代組氨酸（H）時，整合酶剪切效率顯著降低。通過對霍亂弧菌整合酶IntIA 的研究表明，這些氨基酸位于整合酶參與attC位點結(jié)合的α-螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)［28］，第32 和39 位點的氨基酸變化可能會干擾IntI1 與attC位點的結(jié)合，導(dǎo)致整合酶變體對基因盒的剪切效率降低。IntI1 變體對基因盒整合效率影響較小，表明對基因盒整合和剪切反應(yīng)所涉及的整合酶區(qū)域可能不同。整合酶活性與基因盒表達呈負(fù)相關(guān)，即整合子需要基因盒高表達以適應(yīng)外界環(huán)境時，可通過降低整合酶活性來維持整合子結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。這種調(diào)節(jié)機制代表了一種適應(yīng)性反應(yīng)，旨在降低適應(yīng)性成本，有助于整合子的穩(wěn)定。例如IntI1R32_H39 變體具有最有效的剪切活性，其啟動子為弱啟動子PcW+PcH1構(gòu)型。

第2 類整合酶基因啟動子PintI2位于intI2起始密碼子正向40 bp 處，其基因盒功能性啟動子Pc2A 和Pc2B 嵌入attI2中，Pc2 和PintI2尾對尾排列，不會發(fā)生轉(zhuǎn)錄干擾。大部分第2 類整合子并不能翻譯成功能性整合酶蛋白，僅少數(shù)第2 類整合子具有剪切和整合基因盒的功能，這些功能性第2 類整合子的基因盒啟動子類型常為弱啟動子Pc2A 和Pc2B 變體，基因盒轉(zhuǎn)錄效率較低，說明弱的Pc 啟動子決定了更有效的整合酶，這種負(fù)相關(guān)與第1 類整合子類似。第2 類整合子因此被分為兩類，一類為攜帶Pc2A 和Pc2B 啟動子，能有效表達有限的基因盒，但整合酶無活性，不能促進基因盒創(chuàng)新；另一類為少見的功能性第2 類整合酶，它可以捕獲新的基因盒，但基因盒轉(zhuǎn)錄效率低。

關(guān)于第3類整合子功能的研究較少，實驗證明第3類整合酶在attI3位點具有較低的識別和重組活性［23］。第3類整合子的啟動子PintI3位在attI3內(nèi)，基因盒啟動子Pc3 位于intI3基因內(nèi)，第3 類整合酶基因的表達可對基因盒的轉(zhuǎn)錄進行干擾［29］，從Pc3開始的轉(zhuǎn)錄也會影響第3類整合酶的表達，進而影響第3類整合酶的重組活性，兩者相互影響。

結(jié) 語

整合子-基因盒系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)是人類在細菌耐藥研究過程中的里程碑。大量研究顯示，整合子及基因盒的表達是一個復(fù)雜且精密的過程［7，18，20］。外界環(huán)境的不斷變化，使細菌處在一個選擇壓力下，為了快速適應(yīng)壓力，整合子-基因盒系統(tǒng)通過精細調(diào)節(jié)，為宿主細菌降低適應(yīng)性負(fù)擔(dān)，提供選擇優(yōu)勢，在創(chuàng)造細菌多樣性方面發(fā)揮重要作用。通過對整合子-基因盒系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)其為細菌耐藥防控帶來困難的同時也為相關(guān)研究提供了新思路。