崔均花，郭心怡，張寶獻(xiàn)，滕世超，楊 柳，張 穹

（華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 408100）

人血白蛋白用于臨床已有幾十年的歷史，其有效性、安全性已通過長期的臨床實(shí)踐得到證明[1]。人血白蛋白注射液系水溶性膠體無菌制劑。其特點(diǎn)是既易溶于水又存在自發(fā)性絮凝的趨向，并易受多種理化因素影響而變性，從而失去生理活性[2]。在生產(chǎn)過程中，加入適量的穩(wěn)定劑，可使蛋白遇熱不致變性[3]，而辛酸鈉的加入不僅使加熱滅活病毒成為可能，同時也提高了貯存期的穩(wěn)定性[2]。但需要控制其加入的量，如果加入的量不夠，會使蛋白受熱不穩(wěn)定，不能起到穩(wěn)定制品的作用；加入的量過多，則將成為制品的雜質(zhì),從而影響制品的純度[3-4]。辛酸鈉含量的常用測定方法為《中華人民共和國藥典》2020 年版通則中的“3111辛酸鈉測定法”，其中對人血白蛋白辛酸鈉含量的測定有質(zhì)量要求，即每1 g 蛋白質(zhì)中辛酸鈉的含量應(yīng)為0.14 ～0.18 mmol[5]。該測定法中對1.5 mol/L 高氯酸溶液的加入方式?jīng)]有作詳細(xì)規(guī)定，通過在長期檢測過程中發(fā)現(xiàn)，辛酸鈉含量測定平行性不理想，容易出現(xiàn)實(shí)驗室偏差，同時發(fā)現(xiàn)辛酸鈉含量測定供試品制備中離心后蛋白層存在不同形態(tài)。經(jīng)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，蛋白層存在不同形態(tài)的原因為加入1.5 mol/L 高氯酸溶液所致。在本文中，筆者主要是分析兩種供試品制備方式對氣相色譜法測定人血白蛋白辛酸鈉含量結(jié)果的影響，旨在為提高辛酸鈉含量測定的準(zhǔn)確性、規(guī)范辛酸鈉含量測定方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

人血白蛋白樣品為華蘭生物工程重慶有限公司產(chǎn)品，批號：201901001，規(guī)格：10 g/ 瓶（20%，50 mL）。

1.2 主要試劑與儀器

辛 酸（級 別：GC，批 號：MKCB9218，純 度≥99%）購自SIGMA ；庚酸（級別：GC，批號：BCBJ6352V，純度≥99.0%）購自SIGMA；高氯酸（級別：GR，批號：20211130）購自國藥集團(tuán)；三氯甲烷（色譜級，批號：20181113，純度≥99.5%）購自國藥集團(tuán)；GC-2014 氣相色譜儀、LabSolutions 工作站及氫火焰檢測器（FID）均購自日本島津；色譜柱HP-FFAP（0.53 mm×30 m×1.0 μm）購自Agilent。

1.3 供試品制備

取人血白蛋白適量，用純化水稀釋成每升含蛋白質(zhì)40 ～50 g 的溶液。精密量取0.5 mL 此溶液, 共取12 份。分別加庚酸內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，其中6 份直接加1.5 mol/L 高氯酸0.2 mL，然后于振蕩器上混合1 分鐘；另外6 份在振蕩器上邊混合邊加1.5 mol/L 高氯酸溶液0.2 mL。于振蕩器上混合1 分鐘后，分別加三氯甲烷4 mL，于振蕩器上混合2 分鐘，以每分鐘3000 轉(zhuǎn)離心20 分鐘，除去上層水相，小心地將三氯甲烷層傾入10 mL 試管中，即得供試品溶液。

1.4 實(shí)驗操作

辛酸對照品溶液、庚酸內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線處理、色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗、測定均參照《中華人民共和國藥典》2020 年版通則中“3111 辛酸鈉測定法”進(jìn)行，但加入三氯甲烷離心后不進(jìn)行揮干處理，直接注入1 μL 于氣相色譜儀中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

通過實(shí)驗得出，辛酸峰與庚酸峰的峰面積分離度（R）為7.119 ～7.218，滿足大于1.5 的要求，辛酸峰的拖尾因子（T）為0.987 ～1.015，滿足0.95 ～1.20的要求。辛酸對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，所得辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.05%，滿足小于5% 的要求。測定結(jié)果見表1。

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以各辛酸對照品溶液峰面積與庚酸內(nèi)標(biāo)峰面積之比對各辛酸對照品溶液加入量（μL）作直線回歸分析，求得直線回歸方程。通過實(shí)驗得出，辛酸鈉含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0573445X-0.0851292，相關(guān)系數(shù)為0.9999494。滿足大于0.99 的要求。實(shí)驗結(jié)果見圖1。

圖1 辛酸鈉含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 供試品制備方式不同對辛酸鈉含量測定的影響

2.3.1 供試品制備方式 方式一：直接加1.5 mol/L 高氯酸0.2 mL，然后于振蕩器上混合1 分鐘。供試品離心后的蛋白層如圖2 所示。方式二：在振蕩器上邊混合邊加1.5mol/L 高氯酸溶液0.2mL, 于振蕩器上混合1 分鐘。供試品離心后的蛋白層如圖3 所示。

圖2 供試品離心后的蛋白層

圖3 供試品離心后的蛋白層

由圖2、圖3 可知，加入1.5mol/L 高氯酸溶液方式的不同對供試品離心后的蛋白層有影響（供試品離心后的蛋白層有明顯差異）。圖2 的蛋白層不平整，有凝塊；圖3 的蛋白層平整，無凝塊。

2.3.2 測定 按1.4 實(shí)驗操作中的方法進(jìn)行辛酸鈉含量的測定（兩種不同供試品制備方式所得供試品的檢測方法保持一致）。將測得的人血白蛋白的辛酸峰與庚酸內(nèi)標(biāo)峰的峰面積之比代入已得直線回歸方程后，再乘以辛酸對照品溶液濃度，即得人血白蛋白的辛酸絕對量（μg）。按下面公式計算人血白蛋白的辛酸鈉含量：辛酸鈉含量（mmol/g）=。式中A 為供試品溶液辛酸絕對量（μg）；0.5（mL）為取樣量；n 為供試品稀釋倍數(shù)；c 為供試品蛋白質(zhì)含量（g/mL）；144.22 為辛酸的分子量（1 mmol 辛酸相當(dāng)于1 mmol 辛酸鈉）。通過表2 可知，供試品制備方式的不同對辛酸鈉含量測定結(jié)果有明顯的影響。供試品處理時直接加入1.5 mol/L 高氯酸溶液后，于振蕩器上混合1 分鐘這一處理方式所得供試品的辛酸鈉含量結(jié)果偏小，且超出人血白蛋白辛酸鈉含量測定質(zhì)量的要求范圍（每1 g 蛋白質(zhì)中應(yīng)含0.14 ～0.18 mmol）；供試品在振蕩器上邊混合邊加入1.5 mol/L 高氯酸溶液，混合1 分鐘這一處理方式所得供試品的辛酸鈉含量結(jié)果穩(wěn)定，且與理論辛酸鈉投料量0.168 mmoL/g較接近。

表2 不同供試品制備方式所得供試品的辛酸鈉含量結(jié)果

對兩組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，雙樣本t檢驗P＜0.05，有顯著性差異（對結(jié)果的影響較大）。見表3。

表3 t- 檢驗: 雙樣本等方差假設(shè)

3 結(jié)論

通過分析兩種供試品制備方式對氣相色譜儀測定人血白蛋白辛酸鈉含量的影響得出以下結(jié)論：供試品加1.5 mol/L 高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì)時，不同的處理方式對辛酸提取有明顯的影響，直接加入1.5 mol/L高氯酸會使供試品溶液中局部高氯酸濃度過高，使蛋白質(zhì)快速變性沉淀產(chǎn)生凝塊，導(dǎo)致部分辛酸包裹在蛋白質(zhì)沉淀中，影響供試品溶液中辛酸的提取。采用在振蕩器上邊混合邊加入1.5 mol/L 高氯酸沉淀蛋白質(zhì)的方式，可有效避免供試品溶液中高氯酸局部濃度過高，使蛋白質(zhì)變性沉淀過程均一，避免凝塊，供試品溶液中的辛酸能夠完全提取并轉(zhuǎn)移至三氯甲烷中，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。