氣相色譜法測定保健食品中二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚

馮雪萍，張曉慶，楊子忠，李飄然，張慧婷，李亞軍

（酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安琪紐特股份有限公司,湖北宜昌 443003）

大蒜是一種草本植物,長期以來一直被用于各種食品和調(diào)味品等制劑中。許多研究表明,大蒜素主要來源于大蒜,是一種有效活性成分的統(tǒng)稱,又被稱為二烯丙基硫代亞磺酸酯,屬于天然抗生素藥物,它具有保護(hù)心臟、抗菌、提高免疫力等作用,在降壓降血脂方面也有重要功效[1-4],因此大蒜素也是研究較多的具有藥物學(xué)效應(yīng)的化合物。大蒜素一般是呈油狀的無色酯類化合物,伴有大蒜的強(qiáng)烈刺激性氣味和特有的辛辣味,易溶于乙醚、苯、正己烷等有機(jī)溶劑[5],在高溫、堿性環(huán)境中不穩(wěn)定,在偏酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定[6-7]。研究表明,新鮮大蒜中含有大量蒜氨酸和蒜氨酸酶[8],當(dāng)受到物理機(jī)械破碎后發(fā)生酶促反應(yīng),蒜氨酸被蒜氨酸酶催化分解成大蒜素等硫化物,但是大蒜素本身穩(wěn)定性也較差,又快速分解為揮發(fā)性的二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)等硫化物[9],DADS和DATS是大蒜素中重要的兩種有效活性成分[10],且DATS 是活性成分最高的有機(jī)硫化物,二者均具有較好的抗癌作用[11]。

隨著研究的深入,近年來大蒜素的生理功能備受關(guān)注,研究表明,大蒜素具有多種生物活性,除了具有抗氧化、抗炎及降壓降血脂等作用之外,還具有增強(qiáng)纖維蛋白溶解活性、護(hù)肝、抗腫瘤等作用[12-15],因此,大蒜素已應(yīng)用于食品、化妝品和養(yǎng)殖飼料等多個(gè)領(lǐng)域,例如,以大蒜素為原料制成的保健功能食品大蒜油軟膠囊深受國內(nèi)外中老年消費(fèi)者的喜愛,同時(shí)我國也是全球最大的大蒜生產(chǎn)國家,利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)開發(fā)含大蒜素的保健食品或者化妝品以及畜禽飼料添加劑也具有一定優(yōu)勢。目前市場上大蒜素類保健食品工藝參差不齊,可能會造成相關(guān)保健食品的質(zhì)量問題,而DADS 和DATS 是大蒜素中起作用的活性物質(zhì),其含量測定則是檢驗(yàn)保健食品的重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

目前,國內(nèi)外對大蒜中DADS 和DATS 多采用氣相色譜法[16]、高效液相色譜法[17]等方法進(jìn)行定量分析,但對于大蒜油軟膠囊類似產(chǎn)品含量測定方法的研究還鮮有報(bào)道,因DADS 和DATS 性質(zhì)不穩(wěn)定性,易揮發(fā)和分解,準(zhǔn)確測定其含量存在一定困難。少部分研究者采用氣相色譜-質(zhì)譜法對大蒜制品中的DADS 和DATS 組分進(jìn)行測定[18-19],雖然方法簡便,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,但不適用于普通實(shí)驗(yàn)室的日常檢測需求。鑒于大蒜素應(yīng)用日趨廣泛,準(zhǔn)確快速測定大蒜素含量極其重要,采用氣相色譜法測定不僅操作簡單,成本較低,也可廣泛用于準(zhǔn)確測定保健食品中大蒜素含量,達(dá)到既省時(shí)又節(jié)約成本的目的。依據(jù)GB 1886.272—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 大蒜油》[20],該方法可用于四種硫化物質(zhì)定性研究,且未進(jìn)行相關(guān)定量及方法學(xué)研究。為有效控制相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量、快速測定大蒜素含量,筆者利用氣相色譜儀對GB 1886.272—2016 中的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了簡便、快速、可用于準(zhǔn)確測定保健品中DADS 和DATS 含量的方法,可間接判斷樣品中大蒜素的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC 2030 型,配氫火焰離子化（FID）檢測器,日本島津公司。

分析天平：（1）XS 105 型,感量為0.01 mg；（2）ME 204 型,感量為0.1 mg；瑞士梅特勒-托利多公司。

超聲儀：KQ-400DE 型,昆山市超聲儀器有限公司。

二烯丙基二硫醚(DADS)標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不小于99.1%,壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

二烯丙基三硫醚(DATS)標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）不小于94.2%,中國食品藥品檢定研究院。正己烷：分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。大蒜油軟膠囊樣品：保健食品,安琪紐特股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為新制超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：SH-1型毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm, 0.25 μm,日本島津公司）；進(jìn)樣口溫度：210 ℃；檢測器：FID；檢測器溫度：210 ℃；載氣：氮?dú)?流量為1 mL/min；分流比：10∶1；進(jìn)樣體積：1 μL；升溫程序：初始溫 度 為100 ℃,保 持5 min,以20 ℃/min 升 至180 ℃,保持13 min。

1.3 溶液配制

稀釋劑、空白溶液：均為正己烷。

DADS 和DATS 對照品儲備溶液：質(zhì)量濃度均為25 mg/mL,分別精密稱取DADS 和DATS 對照品約250 mg,置于兩個(gè)10 mL 容量瓶中,用稀釋劑溶解、稀釋并定容至標(biāo)線,搖勻。

DADS 和DATS 混 合 對 照 品 溶 液：DADS 和DATS質(zhì)量濃度均為1 mg/mL,分別精密量取DADS和DATS 對照品儲備溶液0.4 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用稀釋劑稀釋并定容至標(biāo)線,搖勻,即得。

DADS 和DATS 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取DADS 和DATS 對照品儲備溶液適量,用正己烷逐級稀釋,得到DADS 和DATS 的質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

取大蒜油軟膠囊樣品10 粒,擠出內(nèi)容物并混勻,精密稱取1 g,置于25 mL容量瓶中,加入稀釋劑至三分之二位置處,超聲處理10 min,放至室溫,再用稀釋劑稀釋、定容至標(biāo)線,搖勻,即得樣品溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

移取DADS 和DATS 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,依照1.2 氣相色譜條件按照濃度由低到高的順序進(jìn)樣分析,以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算校準(zhǔn)曲線線性方程。精確稱取1 g 樣品于25 mL 容量瓶中,用稀釋劑定容至標(biāo)線,混勻,過濾,取1.5 mL 于樣品瓶中進(jìn)樣分析,以保留時(shí)間定性,以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

DADS 和DATS 均是揮發(fā)性物質(zhì),穩(wěn)定性較差,易揮發(fā)和分解。采用氣相色譜法測定時(shí),進(jìn)樣口和檢測器溫度以及升溫程序?qū)Υ笏庵破分蠨ADS 和DATS含量測定有重要影響。若溫度偏低則可能導(dǎo)致氣化不徹底；若溫度過高則可能造成DADS 和DATS 揮發(fā)和分解。采用GB 1886.272—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 大蒜油》[20]中色譜條件進(jìn)行分析,色譜圖如圖1 所示,DADS 和DATS 保留時(shí)間分別約為5.4、11.8 min,分析時(shí)間較長,不利于快速測定大蒜素含量。經(jīng)升溫程序優(yōu)化,確定以下色譜條件：樣口溫度為210 ℃；檢測器溫度為210 ℃；以氮?dú)鉃檩d氣,流量為1 mL/min；分流比為10∶1；進(jìn)樣體積為1 μL。采用以下升溫程序：初始溫度為100 ℃,保持5 min,以20 ℃/min 升至180 ℃,保持13 min。在該色譜條件下,色譜圖如圖2 所示,DADS 和DATS 分離度可滿足要求,其保留時(shí)間分別為3.9、7.8 min,整體運(yùn)行時(shí)間縮短一半,分析效率得到大幅提高。

圖1 GB 1886.272—2016方法DADS和DATS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 使用HP-5色譜柱時(shí)DADS和DATS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

色譜柱內(nèi)涂物質(zhì)不同也會對目標(biāo)物質(zhì)的分離度及含量準(zhǔn)確測定等有影響。在其它條件相同的情況下,根據(jù)化合物性質(zhì)選擇兩個(gè)不同品牌的非極性色譜柱HP-5和SH-1進(jìn)行比較,色譜圖分別如圖2、圖3 所示。結(jié)果表明,采用SH-1 色譜柱同樣能夠使DADS 和DATS 色譜峰完全有效分離,色譜峰對稱性好,且保留時(shí)間更短,DADS和DATS保留時(shí)間分別約為3.4、7.1 min,響應(yīng)值也相對較高,故選用SH-1型毛細(xì)管柱。

圖3 使用SH-1色譜柱時(shí)DADS和DATS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 線性關(guān)系

分別利用DADS和DATS對照儲備溶液配制成二者質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.2色譜條件測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）,色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）,進(jìn)行線性回歸,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。DADS 和DATS質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/mL 范圍內(nèi)線性方程分別為y=751 666x-125 748 和y=30 527x+1 699.3,相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999 9,表明二者線性良好,滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[21]要求。

2.3 方法檢出限

依據(jù)檢出限定義[22],以S/N大于等于3時(shí)所進(jìn)樣濃度為檢出限,經(jīng)逐步稀釋對照品儲備液后DADS和DATS 的S/N值分別為6 和5,符合檢出限實(shí)驗(yàn)信噪比法的要求,此時(shí)DADS 檢出限為0.001 240μg/mL,DATS檢出限為0.000 820 0 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

稱取6 份大蒜油軟膠囊樣品,按照1.4 制備6 份樣品溶液,過濾,注入氣相色譜儀進(jìn)行分析測定。結(jié)果見表1。由表1 數(shù)據(jù)可知,6 份樣品溶液DADS 和DATS測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%和1.3%,表明方法精密度良好,滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取已用本法測定DADS和DATS含量的同一批次的大蒜油軟膠囊樣品6 份于6 只25 mL 棕色容量瓶中,用稀釋劑溶解,每份分別加入DADS 25 mg、DATS 11 mg,用稀釋劑定容,混勻后過濾,按1.2色譜條件測定,結(jié)果見表2,加標(biāo)樣品色譜圖見圖4。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

圖4 加標(biāo)大蒜油軟膠囊樣品色譜圖

由表2可知,6份加標(biāo)樣品中目標(biāo)物的回收率為95.5%～105.3%,平均回收率分別為102.8% 和96.2%,滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》準(zhǔn)確度要求。

3 結(jié)語

建立了一種氣相色譜法對保健食品大蒜油軟膠囊中DADS 和DATS 的含量進(jìn)行測定。對GB 1886.272—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 大蒜油》中程序升溫步驟進(jìn)行優(yōu)化,既可達(dá)到使樣品中各組分在整個(gè)分析時(shí)間段能夠有效分離的目的,又可以節(jié)省分析時(shí)間。該檢測方法將檢測效率提高一倍且通用性強(qiáng)。與其它同類檢測方法如定量分析采用的氣相色譜-質(zhì)譜法相比,該方法作為產(chǎn)品常規(guī)檢測使用,成本大大降低。該方法準(zhǔn)確可靠,具有較高的精密度,可以快速、高效、準(zhǔn)確的檢測保健食品中大蒜素的含量。