粉葛不同外植體的誘導(dǎo)與松散型愈傷組織增殖研究

袁名遠(yuǎn)，羅凱，劉玉，吳麗雯，孫慧茹，趙苓云，李宇，何美軍

(1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

粉葛[Pueraria montanavar.thomsonii(Bentham) M.R.Almeida]是豆科(Leguminosae)葛屬(Pueraria)多年生藤本蔓生植物，又名甘葛藤，是國家認(rèn)定的藥食同源植物之一，主要分布于廣西、江西、湖北以及安徽等地，且多為人工栽培[1，2]。粉葛含有大量的淀粉以及豐富的葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮成分[3，4]，具有解酒、抗氧化、降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種功效，被譽(yù)為“南葛北參”“亞洲人參”[5-9]，鑒于粉葛特殊的藥用功效，高效、規(guī)?；a(chǎn)粉葛活性成分具有巨大的市場前景。 目前，粉葛市場正逐漸擴(kuò)大，對粉葛資源的需求也日漸迫切。

粉葛的傳統(tǒng)繁殖方式主要是葛頭繁殖、塊根繁殖、扦插繁殖和壓條繁殖[10，11]，這些繁殖方式雖然能提供一定量的粉葛資源，但受季節(jié)、氣候、病蟲害等自然條件影響，種苗成活率不高、繁殖系數(shù)低且繁殖周期較長[12]，限制了粉葛資源的發(fā)展。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速、高效的繁殖技術(shù)，它的發(fā)展為解決粉葛上述問題提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐[13]。 愈傷組織誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)的重要階段，是建立組織培養(yǎng)體系的前提，培養(yǎng)的愈傷組織不僅能用于異黃酮等次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，還可用于優(yōu)良品種的快速繁殖、多倍體誘變育種以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究[14，15]。

目前，關(guān)于粉葛愈傷組織培養(yǎng)的研究還不夠系統(tǒng)，對其次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的研究很少[16，17]。本研究從粉葛的不同外植體入手，利用不同處理組合的外源激素對其進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選出誘導(dǎo)愈傷組織的最適外植體及松散型愈傷組織繼代增殖的條件，運(yùn)用響應(yīng)面法對增殖條件進(jìn)行優(yōu)化，并檢測愈傷組織中主要次生代謝產(chǎn)物的含量，以期為建立系統(tǒng)、高效的粉葛組織培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)體系提供科學(xué)依據(jù)，以緩解粉葛資源的短缺問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑、儀器

試驗(yàn)材料為半年生粉葛全株，采集于湖北省恩施市三岔鎮(zhèn)(109.64′E，30.28′N，平均海拔910 m)，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定。

試劑:次氯酸鈉(NaClO)、無水乙醇、吐溫-80、無水碳酸鈉(Na2CO3)、福林酚、MS 培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂等均購于國藥集團(tuán)；6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、葛根素、沒食子酸購于阿拉丁試劑公司；氯化汞(HgCl2)領(lǐng)取于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所。

儀器:UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；DL-CJ-2NDI 超凈工作臺(上海東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；FA2004B 電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；JZ-100-B接種器具殺菌器(上海稼豐園藝用品有限公司)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粉葛幼苗培育 剪去粉葛植株的地上部分，切下葛頭，栽入裝有混合基質(zhì)的栽培盆中，用自來水澆透，瀝去多余水分后放入26℃組培室中培養(yǎng)(培養(yǎng)所需環(huán)境條件見表1)，2 ～3 d 澆水一次，并除去雜草，當(dāng)形成株高10 ～20 cm 的粉葛苗后即可用于組織培養(yǎng)。

表1 愈傷組織培養(yǎng)條件

1.2.2 無菌外植體制備 從粉葛苗上采下粉葛葉片、葉柄(帶小葉柄)以及莖段(帶莖段節(jié))并分類；先用自來水洗去表面的泥土和雜物，隨后置于含有適量吐溫-80 的無菌水中浸泡5 ～10 min；取出，在超凈工作臺上繼續(xù)用無菌水清洗3 次，隨后依次用75%乙醇浸泡30 s 左右、0.1%的升汞溶液處理5 ～15 min、2%的次氯酸鈉溶液處理5 ～15 min(每次更換消毒劑時均使用無菌水清洗3 ～5次)；使用無菌濾紙吸干表面水分，然后將葉片剪成0.5 ～1.0 cm2的小塊，葉柄和莖段切成0.5 ～1.0 cm長的小段，作為3 種無菌外植體。

1.2.3 粉葛不同外植體的誘導(dǎo)效果比較 基于前期試驗(yàn)，設(shè)置不同濃度6-BA(0.1、1.0、2.0 mg·L-1)與NAA(0.1、0.5、0.9 mg·L-1)組合處理及不含激素的空白對照，共10 個處理(表2)，對3 種外植體分別進(jìn)行誘導(dǎo)，每個組培瓶接種6 ～8 個外植體，每個處理接種3 瓶，重復(fù)接種3 批，25 d 后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。

表2 不同濃度6-BA 與NAA 組合下的外植體誘導(dǎo)方案 (mg·L-1)

1.2.4 莖段松散型愈傷組織的增殖條件篩選參考1.2.3 中由莖段誘導(dǎo)出較松散愈傷組織的條件，設(shè)置不同濃度6-BA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)與NAA(0.25、0.50、0.75 mg·L-1)組合處理及不含激素的空白對照，共10 個處理(表3)，對松散型愈傷組織的增殖條件進(jìn)行篩選。 每個組培瓶接種3～5塊大小為(0.2±0.02)g 的愈傷組織，每個處理接種3 瓶，25 d 后統(tǒng)計(jì)增殖結(jié)果。

表3 不同濃度6-BA 與NAA 組合下的松散型愈傷組織增殖方案 (mg·L-1)

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化松散型愈傷組織的增殖條件 在1.2.4 篩選的增殖條件基礎(chǔ)上引入生長素2，4-D，結(jié)合響應(yīng)面法對松散型愈傷組織的增殖條件進(jìn)行改善。 利用Design-Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以增殖率為響應(yīng)值，按表4 方案設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，25 d 后統(tǒng)計(jì)相關(guān)指標(biāo)。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平 (mg·L-1)

1.2.6 總黃酮與總酚含量測定 (1)愈傷組織甲醇提取液制備:將愈傷組織取出，去除表面培養(yǎng)基等雜質(zhì)，放入60℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過80目篩。 稱取1 g 粉末加入50 g·mL-1甲醇混勻，200 W 超聲萃取30 min，萃取3 次后合并濾液，于250 mL 容量瓶定容，得到樣品母液，密封后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)總酚含量測定:取上述母液1 mL 定容于10 mL 容量瓶作為檢測樣，參考郭剛軍等[18]的方法進(jìn)行沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和樣品總酚含量檢測。

(3)總黃酮含量測定:取上述母液1 mL 定容于100 mL 容量瓶作為檢測樣，參考張靜等[19]的方法進(jìn)行葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和樣品總黃酮含量檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性分析，Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，Origin 9 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，統(tǒng)計(jì)0.05、0.01 水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉葛不同外植體的誘導(dǎo)效果比較

在不同濃度6-BA 與NAA 組合處理下，葉片、葉柄以及莖段3 種外植體在誘導(dǎo)期內(nèi)均有萌動現(xiàn)象，但對激素的敏感能力差異顯著(圖1)。 葉柄在靠近葉片的小葉柄部位最為敏感，第4 天即有膨大現(xiàn)象產(chǎn)生，而近莖端稍晚，于第7 天開始膨大；莖段在培養(yǎng)第6 天開始從兩端膨大，且?guī)o段節(jié)處發(fā)生較早；葉片外植體先發(fā)生卷邊現(xiàn)象，隨之變厚，第10天從葉片邊緣處出愈，少部分從葉脈處隆起出愈。

圖1 外植體材料和誘導(dǎo)中的外植體

如圖2 所示，葉片主要產(chǎn)生黃綠色和綠色的愈傷組織，質(zhì)地較為緊實(shí)；葉柄和莖主要產(chǎn)生黃綠色的愈傷組織，其中莖段多個處理組的愈傷組織質(zhì)地較為松散。

圖2 誘導(dǎo)完成的愈傷組織

由表5—表7 可見，在本試驗(yàn)條件下，6-BA濃度較高時愈傷組織的長勢較好，低濃度時易導(dǎo)致外植體和愈傷組織褐化；6-BA 濃度一定時，葉片、葉柄和莖三種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率在0.5、0.9 mg·L-1NAA 時較高，最高分別達(dá)到42.86%、95.83%和96.30%，低濃度NAA 處理下外植體誘導(dǎo)不完全，出愈率低；無植物激素的處理組均沒有愈傷組織產(chǎn)生，而且外植體多數(shù)褐化死亡。綜合誘導(dǎo)率、褐化程度以及愈傷組織的量考察三種外植體的誘導(dǎo)情況，Y8(2.0 mg·L-16-BA ＋0.5 mg·L-1NAA)、Y7(2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA)和Y7(2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA)處理分別為葉片、葉柄和莖段的最適誘導(dǎo)條件。 其中，莖段愈傷組織在多個處理組表現(xiàn)出松散狀態(tài)，因此將莖段用于松散型愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

表5 不同濃度6-BA 與NAA 組合下葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果

表6 不同濃度6-BA 與NAA 組合下葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)效果

表7 不同濃度6-BA 與NAA 組合下莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果

2.2 粉葛松散型愈傷組織的增殖條件篩選

以較松散的莖段愈傷組織為原料進(jìn)行增殖試驗(yàn)，結(jié)果(表8)顯示，不同濃度6-BA 與NAA 作用下增殖情況差異顯著。 愈傷組織主要為黃綠色和黃色，少量呈現(xiàn)綠色，Z3 ～Z7 處理的愈傷組織具有比較松散的結(jié)構(gòu)。 其中，Z4(1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA)處理的愈傷組織增殖系數(shù)最高，達(dá)到7.41±0.58；其次為Z7 處理，達(dá)到7.36±0.29；Z1 處理的最低，僅為4.93±0.48；無激素處理組Z0 對愈傷組織沒有增殖效果。 綜合表明，Z4 處理(1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA)為松散型愈傷組織培養(yǎng)的初步條件。

表8 不同濃度6-BA 與NAA 處理下莖段愈傷組織的增殖狀況

2.3 粉葛松散型愈傷組織增殖條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與方差分析 以增殖系數(shù)為響應(yīng)值，利用BBK 法設(shè)計(jì)2，4-D、6-BA 和NAA 組合方案，對粉葛松散型愈傷組織的增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果(表9)顯示，愈傷組織主要為黃綠色和黃色，少量為綠色，大部分處理組呈現(xiàn)出比較松散的狀態(tài)。 通過響應(yīng)面法優(yōu)化后，愈傷組織的增殖系數(shù)整體是上升的，最高能達(dá)到9.01，這說明2，4-D、6-BA、NAA 組合對松散型愈傷組織增殖存在一定程度的協(xié)同作用。

表9 響應(yīng)面優(yōu)化后的增殖結(jié)果

經(jīng)回歸分析得到回歸方程Y ＝8.67＋0.27A-0.054B-0.18C＋0.18AB＋0.018AC-0.37BC-0.85A2-0.35B2-0.83C2。 方差分析結(jié)果(表10)顯示，模型F 值為16.79，P＜0.01，說明模型達(dá)到極顯著水平；模型失擬項(xiàng)F 值僅為0.090，P＞0.05，說明失擬項(xiàng)未達(dá)顯著水平；此外，模型決定系數(shù)R2為0.9557，預(yù)測R2pred(0.8988)與校正R2adj(0.8902)接近。 綜上說明，該模型有意義，可行度高，適用于對愈傷組織增殖結(jié)果的分析和預(yù)測。

表10 響應(yīng)面回歸方差分析結(jié)果

同時，方差分析也顯示，A2、C2對愈傷組織增殖的影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)，A、BC 以及B2對愈傷組織增殖的影響達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)。 3 種植物外源激素對愈傷組織增殖的影響大小為6-BA＞2，4-D＞NAA。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 交互作用是考察因素之間的疊加效應(yīng)對響應(yīng)值的影響，通常用響應(yīng)面的3D 圖和等高線圖呈現(xiàn)。 圖中從藍(lán)色往紅色轉(zhuǎn)變越快，坡度越陡峭，說明響應(yīng)值的變化越快，響應(yīng)結(jié)果就越顯著，橢圓形的中心點(diǎn)即為響應(yīng)面的最高點(diǎn)，反之則不顯著。 由圖3 可知，增殖系數(shù)受2，4-D 和NAA 交互作用影響較大，隨著2，4-D 和NAA 濃度的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其3D 圖坡度表現(xiàn)較為陡峭，等高線圖也呈明顯的橢圓形。 增殖系數(shù)受6-BA 與NAA、6-BA與2，4-D交互作用影響較弱，響應(yīng)結(jié)果不顯著。說明2，4-D 和NAA 濃度過高和過低都不利于愈傷組織的增殖。

圖3 響應(yīng)面各因素交互作用3D 圖和對應(yīng)等高線圖

2.3.3 最適增殖條件的預(yù)測與驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面模型預(yù)測結(jié)果，粉葛松散型愈傷組織的最優(yōu)增殖條件為1.08 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.94 mg·L-12，4-D，在此條件下所預(yù)測松散型愈傷組織的增殖系數(shù)為8.70。 考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的簡便原則，將該條件近似優(yōu)化為1.10 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.95 mg·L-12，4-D。 經(jīng)過驗(yàn)證，該條件下愈傷組織以黃綠色為主，呈現(xiàn)明顯的松散狀態(tài)(圖4)，實(shí)際的增殖系數(shù)達(dá)到9.34±0.49。 說明該模型能夠合理地預(yù)測松散型愈傷組織的增殖結(jié)果，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

圖4 松散型愈傷組織

2.4 總黃酮與總酚含量檢測結(jié)果

由表11、圖5 可見，葛根素和沒食子酸分別在0～10 μg·mL-1和0～50 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y ＝0.0744x＋0.0015(R2＝0.9994)、y ＝0.0071x＋0.0047(R2＝0.9992)。 在此條件下，采用紫外分光光度法對粉葛愈傷組織的總黃酮和總酚含量進(jìn)行檢測，總黃酮和總酚含量分別為(25.07±0.30) mg·g-1和(27.44±0.68) mg·g-1。

圖5 葛根素與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表11 總黃酮與總酚檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物的組織培養(yǎng)受外植體、外源激素、溫度、光照、培養(yǎng)基養(yǎng)分等多方面因素影響，合適的外植體和激素處理是組織培養(yǎng)成功的先導(dǎo)條件之一[20]。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度的6-BA 和NAA 作用下，粉葛三種外植體表現(xiàn)出了明顯不同的誘導(dǎo)效果，莖段和葉柄對激素的敏感度和誘導(dǎo)率顯著高于葉片，較早出愈；葉片愈傷組織的最適激素組合為2.0 mg·L-16-BA＋0.5 mg·L-1NAA，莖段和葉柄的最適激素組合均為2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA，其中莖的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到96.30%。 這可能與組織的分化程度有關(guān)，分化程度越高，外植體對激素的敏感度越低，這一結(jié)果在北美海棠[21]與五味子[22]等的研究中也有相同體現(xiàn)。 此外，從大田采集的粉葛由于長期生長在野外，所帶微生物較多，而且較長的生長年限使得其木質(zhì)化程度增加，不利于外植體的消毒和誘導(dǎo)，因此，本試驗(yàn)采取在組培室中培育粉葛幼苗以提供幼嫩的外植體材料，降低了組培的污染率，明顯提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率，優(yōu)于馬崇堅(jiān)等[12]的誘導(dǎo)結(jié)果。

松散型愈傷組織因結(jié)構(gòu)相對疏松、細(xì)胞團(tuán)顆粒相對較小，適用于作為懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)材料，且其較薄的細(xì)胞壁也給活性次生代謝產(chǎn)物提取提供了巨大的優(yōu)勢[23，24]。 本試驗(yàn)從粉葛莖段所誘導(dǎo)的愈傷組織中，選擇松散狀態(tài)的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，篩選出1.0 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA 作為松散型愈傷組織增殖的初步條件，隨后基于該條件引入生長素2，4-D，通過響應(yīng)面法系統(tǒng)優(yōu)化了松散型愈傷組織的增殖條件，發(fā)現(xiàn)三種激素的組合作用對松散型愈傷組織增殖具有積極影響，最適條件為1.10 mg·L-16-BA＋0.25 mg·L-1NAA＋0.95 mg·L-12，4-D，此條件下愈傷組織以黃綠色為主，呈現(xiàn)明顯的松散狀態(tài)，增殖系數(shù)達(dá)到9.34。

次生代謝產(chǎn)物是藥食同源植物發(fā)揮生物活性的主要成分，譚梔恩等[25]對廣西地區(qū)數(shù)十種葛根的主要活性成分進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中16 種粉葛的總黃酮含量僅為3.35 ～15.83 mg·g-1；黃再強(qiáng)等[26]在川產(chǎn)的多種粉葛中也僅檢測出1.4 ～6.2 mg·g-1的總黃酮。 本試驗(yàn)對培養(yǎng)的粉葛松散型愈傷組織中的主要次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行檢測，總黃酮和總酚含量分別達(dá)到(25.07±0.30) mg·g-1和(27.44±0.68) mg·g-1，總黃酮含量明顯高于粉葛植株中的，說明愈傷組織可以一定程度地積累總黃酮等次生代謝產(chǎn)物，通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立高效的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)體系是可行的。