安清明 楊馳 宋興超 趙園園 陳敏 申建江 高偉

摘要：篩選貴州白山羊FHL3基因單核苷酸變異位點(diǎn)（SNPs），并分析基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，為培育貴州白山羊優(yōu)良品系提供參考依據(jù)，也為進(jìn)一步研究FHL3基因生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。通過混合池測(cè)序?qū)?16只不同地區(qū)貴州白山羊FHL3基因進(jìn)行SNPs鑒定，以188只貴州白山羊進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。采用PopGene32.0軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），應(yīng)用PIC軟件計(jì)算群體多態(tài)性信息含量（PIC），以卡方（χ2）檢驗(yàn)分析基因Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；應(yīng)用MINTAB軟件中的一般線性混合效應(yīng)模型分析核苷酸變異與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，貴州白山羊FHL3基因的6個(gè)檢測(cè)區(qū)域中，僅在P3區(qū)域檢測(cè)到1個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)g.215 C/T，且該位點(diǎn)的Ho低于He，PIC檢測(cè)為中度多態(tài)，χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P<0.05）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，貴州白山羊FHL3基因g.215 C/T位點(diǎn)變異構(gòu)成的不同等位基因和基因型在體高、體長(zhǎng)和胸圍方面表現(xiàn)出顯著差異性（P<0.05），存在等位基因C的群體和CC基因型群體具有更高的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。貴州白山羊FHL3基因具有一定的多態(tài)性，且g.215 C/T位點(diǎn)變異與體高、體長(zhǎng)和胸圍具有顯著相關(guān)性，可作為培育貴州白山羊優(yōu)良品系的候選基因分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：貴州白山羊；FHL3基因；生長(zhǎng)性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S827.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0049-05

LIM是3種轉(zhuǎn)錄因子Lin-11、Lsl-1和Mec-3的縮寫，是一類富含特征性氨基酸保守序列的蛋白超家族，該家族基因中含有一類介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路蛋白及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白之間相互作用的一個(gè)重要區(qū)域，是LIM蛋白與其他蛋白互作調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架形成等重要生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［1-3］。4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白3基因（FHL3）屬于FHL（Four and a half LIM domain）基因家族，該家族共有5個(gè)成員，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT［4］。FHL3基因的cDNA序列全長(zhǎng)為843 bp，共編碼281個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為31 181.92 ku，F(xiàn)HL3基因位于人1號(hào)染色體短臂的末端，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子［5］。FHL家族在不同組織中存在表達(dá)特異性，如FHL1在骨骼肌中表達(dá)水平最高，并參與肌球蛋白絲的合成以及肌小結(jié)的排列，F(xiàn)HL2在心臟中表達(dá)量最高，但在骨骼肌中微表達(dá)，F(xiàn)HL4和FHL5目前僅在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)具有一定表達(dá)量［6］。較長(zhǎng)時(shí)間，學(xué)者將研究目標(biāo)主要集中于FHL1和FHL2基因上，對(duì)FHL3基因的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3也主要在骨骼肌中表達(dá)，但在心肌中表達(dá)匱乏［7］。FHL3蛋白可通過和肌動(dòng)蛋白（actin）結(jié)合負(fù)向調(diào)控肌動(dòng)蛋白成束，且在遷移的成肌細(xì)胞中，過表達(dá)FHL3可增加并誘導(dǎo)應(yīng)力纖維解聚［8］。Han等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3是衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞肌管分化和融合的負(fù)調(diào)控因子，Cottle等研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3可負(fù)向調(diào)控肌肉發(fā)育、損害MYOD基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制肌細(xì)胞分化過程［9-10］。Zhang等研究也發(fā)現(xiàn)，在生肌過程中FHL3蛋白能與CREB蛋白互作形成復(fù)合體，通過介導(dǎo)CREB基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)MyHCⅡα的表達(dá)，進(jìn)而抑制MyoD基因的轉(zhuǎn)錄活性［11］。以上研究表明，F(xiàn)HL3是調(diào)節(jié)骨骼肌分化、生成及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要調(diào)控基因。

在畜牧生產(chǎn)中，研究發(fā)現(xiàn)豬FHL3基因在第2外顯子處第313堿基處存在1個(gè)A/G錯(cuò)意突變，且該突變與豬的肉質(zhì)性狀和眼肌面積具有顯著相關(guān)［12-13］。亦有研究表明，F(xiàn)HL3基因表達(dá)量與豬肉的肉質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)具有一定關(guān)聯(lián)性，如豬肉的肌肉色澤、吸水力、pH值、肌肉嫩度、肌內(nèi)脂肪含量等［14-15］。在羊中，張?chǎng)瓮ㄟ^轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響寒泊羊肉品質(zhì)和產(chǎn)肉量的重要候選基因［16］。課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響貴州白山羊生長(zhǎng)和產(chǎn)肉量的重要候選基因［17］。但目前，在畜牧生產(chǎn)中關(guān)于FHL3基因變異與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析的研究極少，山羊中更鮮見研究報(bào)道，鑒于FHL3基因是動(dòng)物生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的重要候選基因，因此，本研究擬分析FHL3基因的核苷酸變異及其與貴州白山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，以期能夠篩選出可用于指導(dǎo)貴州白山羊生長(zhǎng)性狀遺傳改良的分子標(biāo)記位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年2—6月在銅仁學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。課題組2021年6月至2022年2月收集貴州白山羊試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中，貴州省銅仁市德江縣2家養(yǎng)殖合作社36只、沿河縣2家養(yǎng)殖合作社42只、遵義市務(wù)川縣3家養(yǎng)殖合作社38只，共116只白山羊血液用于多態(tài)性檢測(cè)，以銅仁市沿河縣、遵義市務(wù)川縣2家養(yǎng)殖合作社的188只貴州白山羊（2周歲齡及以上）作為研究對(duì)象用于生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析。所有山羊頸靜脈采血約5.0 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用于測(cè)定生長(zhǎng)性狀的所有羊在禁食24 h后，測(cè)定個(gè)體的生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)，包括體質(zhì)量、體高、體長(zhǎng)、胸圍。采用試劑盒提取（北京天根生化科技有限公司）DNA，所有DNA -20 ℃保存?zhèn)溆?。其中，用于多態(tài)性檢測(cè)的116個(gè)樣本DNA用TE調(diào)整至相同濃度，每管DNA取5 μL制成混合DNA，以備后續(xù)PCR混合池測(cè)序篩選核苷酸變異位點(diǎn)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank山羊的FHL3基因序列（登錄號(hào)：NC_030810.1），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)6對(duì)引物，包括FHL3基因的5′UTR區(qū)，外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和3′UTR區(qū)，引物位置詳見圖1，不同引物序列信息見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中，DNA模板1.0 μL，上下游引物各1.25 μL，2 Master Mix試劑12.5 μL，滅菌超純水9.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（各引物退火溫度見表1），72 ℃延伸60 s，37 個(gè)循環(huán)；最后延伸10 min。待反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，120 V電壓條件下電泳15 min，在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察試驗(yàn)結(jié)果。將目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物樣品純化后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用Lasergene中的MegAlign程序進(jìn)行序列比對(duì)并判定基因型；利用PopGene 32.0計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne），平衡χ2檢驗(yàn)；利用PIC軟件計(jì)算群體多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。應(yīng)用MINTAB（Version 16，Minitab Inc.，Pennsylavania）一般線性混合效應(yīng)模型（General Liner Mixed-effect Models，GLMMs）評(píng)估特定等位基因的存在/缺失、基因型是否對(duì)貴州白山羊生長(zhǎng)性狀存在影響。

對(duì)某一特定基因性狀進(jìn)行存在、缺失分析模型中，等位基因或基因型、性別、年齡為固定因素，遵從下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析：

Yijmn=μ+Gi+Cj+Fm+Xn+eijmn。

其中，Y為相應(yīng)性狀，μ為群體均值，Gi為年齡效應(yīng)，Cj為性別效應(yīng)，F(xiàn)m為基因型、等位基因效應(yīng)，Xn為因素間互作效應(yīng)，eijknm為隨機(jī)誤差。所有結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州白山羊FHL3基因核苷酸變異分析

以貴州白山羊混合DNA為模板擴(kuò)增6段FHL3基因片段，由測(cè)序結(jié)果（圖2）可知，引物P1、P2、P4、P5和P6擴(kuò)增目的片段基因中未發(fā)現(xiàn)核苷酸變異位點(diǎn)，但在P3引物擴(kuò)增片段中發(fā)現(xiàn)1處變異，為g.215 C/T突變。

2.2 貴州白山羊FHL3基因多態(tài)性分析

對(duì)188份貴州白山羊進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果（表2）表明，F(xiàn)HL3基因P3片段中g(shù).215處存在1處核苷酸變異位點(diǎn)，形成等位基因T和C，其頻率分別為47.07%、52.93%；構(gòu)成3種基因型，分別是TT、CT、CC，其頻率分別21.28%、51.60%、27.13%；多態(tài)信息含量表明，該位點(diǎn)雜合度高于純合度，且屬于中度多態(tài)（0.25

2.3 山羊FHL3基因變異與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析

在FHL3基因P3片段上鑒定出的2個(gè)等位基因C和T，兩者頻率均>5%，可用于生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析。等位基因存在與缺失分析結(jié)果（表3）表明，等位基因?qū)Τ赡臧咨窖蝮w質(zhì)量影響不顯著（P>0.05），而對(duì)白山羊體高、體長(zhǎng)和胸圍均有顯著影響（P<0.05），且存在等位C的群體生長(zhǎng)性狀均顯著高于缺失群體；基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表4）表明，CC基因型的群體在體高、體長(zhǎng)和胸圍3個(gè)生長(zhǎng)性狀中均顯著高于TT型群體，因此等位基因C可作為貴州白山羊生長(zhǎng)性狀的優(yōu)勢(shì)標(biāo)記基因。

3 討論

貴州白山羊是著名的地方白山羊品種之一，是貴州當(dāng)前群體數(shù)目最大的山羊品種，是發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源。但存在個(gè)體小、生長(zhǎng)速度慢、飼料轉(zhuǎn)化率低缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了白山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，本研究以前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出與貴州白山羊生長(zhǎng)相關(guān)候選基因FHL3為研究對(duì)象，分析其遺傳變異及對(duì)貴州白山羊生長(zhǎng)性能的影響。目前，已有部分學(xué)者對(duì)FHL3進(jìn)行了一定的研究，如Cottle等研究表明，F(xiàn)HL3基因在骨骼肌中表達(dá)最為顯著［10］。李文濤采用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因?qū)Σ煌±w維類型形成的存在一定影響［18］。許海洋對(duì)轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠骨骼肌進(jìn)行分析，結(jié)果表明高度表達(dá)FHL3基因能夠促進(jìn)肌肉量增多，且FHL3基因可能對(duì)肌肉損傷修復(fù)、肌萎縮造成的肌肉消瘦起到一定的修復(fù)作用［19］。Meeson等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3能夠協(xié)助性調(diào)節(jié)肌原細(xì)胞群和骨骼肌再生，且發(fā)現(xiàn)FHL3和SOX15在調(diào)節(jié)肌肉的數(shù)量和骨骼肌的再生中共同發(fā)揮作用［20］。從已有研究來看，F(xiàn)HL3能與其他基因互作參與肌細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)、骨骼肌的形成等相應(yīng)的生物學(xué)過程，而骨骼肌是影響動(dòng)物生長(zhǎng)性狀的一個(gè)重要因素，因此本研究針對(duì)FHL3基因變異對(duì)山羊生長(zhǎng)性狀的影響具有理論支持。

本研究采用PCR擴(kuò)增直接測(cè)序法，在不同群體白山羊中篩選FHL3基因變異位點(diǎn)，在所選取的6個(gè)目的片段中僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)，且該位點(diǎn)PIC為中度多態(tài)水平，表明該基因在群體內(nèi)的多態(tài)水平具有進(jìn)一步提升的空間。家畜的遺傳多態(tài)性是長(zhǎng)期選擇與進(jìn)化的結(jié)果，豐富的多態(tài)性有利于進(jìn)化的多向性，是人工選擇和育種的基因基礎(chǔ)。已有研究表明，貴州白山羊在多種與生長(zhǎng)相關(guān)的基因中均有不同程度的多態(tài)性，表明貴州白山羊具有很好的選育潛能［21-24］。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)處于 Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)，這可能是群體在養(yǎng)殖過程中，自然或人工選擇導(dǎo)致的結(jié)果。而貴州白山羊在養(yǎng)殖過程中自繁自育情況較嚴(yán)重，這也是可能是導(dǎo)致群體多態(tài)性不高，變異位點(diǎn)處于偏離 Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)的一個(gè)原因。

在家畜生產(chǎn)中，有關(guān)FHL3基因的研究報(bào)道較少，僅有報(bào)道主要針對(duì)豬的生產(chǎn)性狀。Zuo等研究發(fā)現(xiàn)，豬FHL3基因第2外顯子上存在的A/G突變對(duì)眼肌面積和肉質(zhì)性狀具有重要影響［12-13］。亦有研究發(fā)現(xiàn)FHL3基因與豬肉的色澤、吸水力、嫩度、肌內(nèi)脂肪含量等性狀具有一定影響［14-15］。但目前在山羊中未見相關(guān)報(bào)道，筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)不同體質(zhì)量的貴州白山羊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因是影響山羊生長(zhǎng)的重要候選基因。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因g.215 C/T突變白山羊體高、體長(zhǎng)和胸圍均有顯著影響，但未發(fā)現(xiàn)與體質(zhì)量具有顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，胸圍是影響山羊體質(zhì)量的直接因素，體高、體長(zhǎng)是影響山羊體質(zhì)量的間接因素［25］。本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因核苷酸變異對(duì)胸圍、體高和體長(zhǎng)均有顯著影響，但卻對(duì)體質(zhì)量影響差異不顯著，在生產(chǎn)實(shí)際中，體尺和胸圍性狀通常與群體體質(zhì)量呈正相關(guān)，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因變異與體質(zhì)量相關(guān)性不顯著，但在不同基因型分析中發(fā)現(xiàn)，CT型群體的體質(zhì)量值最高，因此推測(cè)，等位基因C和T可能在體質(zhì)量上存在互作影響，雜合型群體的體質(zhì)量較純合型高。另外本研究選取研究對(duì)象均為成年個(gè)體，體尺指標(biāo)在后續(xù)養(yǎng)殖過程中變化不大，貴州牧區(qū)的白山羊養(yǎng)殖主要以半舍飼為主，且白山羊的生長(zhǎng)速度較為緩慢，本研究結(jié)果表明，F(xiàn)HL3基因變異對(duì)體質(zhì)量影響不顯著，可能是觀測(cè)群體育肥效應(yīng)還未達(dá)期望值，表明后期養(yǎng)殖群體還具有很好的育肥增質(zhì)量空間。但在FHL3基因不同基因型關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，基因型CC的群體在體高、體長(zhǎng)和胸圍3個(gè)體尺性狀中均顯著高于TT型群體，因此FHL3基因可作為貴州白山羊生長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記基因，值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究在不同地區(qū)貴州白山羊FHL3基因中6個(gè)不同區(qū)域發(fā)現(xiàn)，1個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)g.215 C/T，且該變異位點(diǎn)與貴州白山羊的體高、體長(zhǎng)和胸圍生長(zhǎng)特征顯著相關(guān)，存在等位基因C的群體和CC基因型群體具有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

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