不同種植年限及覆膜栽培防風(fēng)根際土壤微生物多樣性研究

寇佩雯 劉長(zhǎng)樂(lè) 李鉑 王楠 宋忠興 張永生 黃文靜 唐志書

摘要：為探究防風(fēng)生長(zhǎng)發(fā)育及栽培方式對(duì)其根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)非根際土壤（CK）、1年生（F1）、2年生（F2）和覆膜栽培1年（FM）的防風(fēng)根際土壤中細(xì)菌16SrRNA和真菌18S序列進(jìn)行測(cè)序分析。研究發(fā)現(xiàn)各處理的微生物總數(shù)、菌群豐富度和復(fù)雜程度表現(xiàn)為1年生組>非根際土壤組，1年生組>2年生組、覆膜組。覆膜栽培后微生物α多樣性以及小囊菌科和叢赤殼科真菌豐度整體下降，假球殼科真菌豐度急劇增加。各處理土壤樣品中微生物的群落組成雖存在差異，但其優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)菌豐度最大的2個(gè)門始終是放線菌門和變形菌門，真菌豐度最大的門為子囊菌門和擔(dān)子菌門。Venn分析和UPGMA聚類分析顯示，F(xiàn)2處理中獨(dú)有細(xì)菌的OTU數(shù)少于F1處理，獨(dú)有真菌的OTU數(shù)則多于F1處理，F(xiàn)2和FM處理在菌落結(jié)構(gòu)組成上較為相近。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤全鉀、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量是驅(qū)動(dòng)根際微生物群落的主要因子，但其與各優(yōu)勢(shì)菌群的相關(guān)性不顯著。利用PICRUSt2進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，2年生組較其余組菌群功能差異最大。綜上可知，生長(zhǎng)年限和覆膜均會(huì)影響防風(fēng)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能，而生長(zhǎng)年限對(duì)其影響更加明顯，該結(jié)果可為防風(fēng)栽培技術(shù)體系的構(gòu)建提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：防風(fēng)；根際土壤；微生物群落；多樣性；功能預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0221-11

根際是植物-微生物-土壤三者相互作用并緊密影響的局域生態(tài)系統(tǒng)，其在生物和化學(xué)特性上與周圍的大塊土壤不同［1］。在此系統(tǒng)中，根際微生物參與了眾多生化反應(yīng)，在促進(jìn)植物礦質(zhì)元素吸收、刺激根系生長(zhǎng)、加速土壤腐殖質(zhì)形成和有機(jī)物分解等方面起到至關(guān)重要的作用［2-3］。因此，根際微生物常被認(rèn)為是衡量土壤肥力和土壤健康的生物學(xué)指標(biāo)，被譽(yù)為“植物的第二個(gè)基因組”［4］。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所產(chǎn)生的萜類、黃酮和生物堿等次生代謝物常通過(guò)根系的分泌作用釋放至土壤中，在改變根際土壤理化性質(zhì)的同時(shí)也影響著根際微生物群落的結(jié)構(gòu)特征［5］。研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主要受2方面因素影響：在生物因素中，以植物種類、生長(zhǎng)階段和次生代謝差異［6-7］為主；在非生物因素中，土壤類型［8］、礦質(zhì)元素［9］、溫度及栽培方式［10］等對(duì)其影響較大。近年來(lái)，細(xì)菌 16S rRNA 和真菌 18S基因測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，利用第三代Illumina 高通量測(cè)序系統(tǒng)可同時(shí)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)并獲得其生物群落結(jié)構(gòu)特征。該方法獲得的數(shù)據(jù)量大，能夠產(chǎn)生覆蓋深度較高的測(cè)序數(shù)據(jù)用來(lái)估計(jì)微生物群落的組成，由于其時(shí)間短和精準(zhǔn)度高等特點(diǎn)，在微生物群落多樣性研究等方面的應(yīng)用越來(lái)越多。

藥材防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)［Saposhnikovia divaricata （Turcz.） Schischk.］的干燥根，具有解表祛風(fēng)、勝濕、止痙等作用，在我國(guó)歷代本草文獻(xiàn)中均有詳細(xì)記載，屬常用大宗藥材［11］?，F(xiàn)已從防風(fēng)中得到色原酮、香豆素、多糖和揮發(fā)油類成分，臨床常用其治療風(fēng)濕、風(fēng)疹、炎癥引起的急癥，外感風(fēng)寒引起的感冒頭疼和脾胃等方面的相關(guān)疾病，因市場(chǎng)需求量大，現(xiàn)流通的防風(fēng)多為人工栽培品［12］。內(nèi)蒙古東部地區(qū)是目前我國(guó)防風(fēng)的主產(chǎn)區(qū)之一，通過(guò)遙感影像解譯防風(fēng)的分布范圍及種植面積發(fā)現(xiàn)，僅2019年內(nèi)蒙古通遼市奈曼旗的防風(fēng)種植面積就超過(guò) 35.33 hm2［13］。在之后的2年中通遼市科爾沁區(qū)及開(kāi)魯縣的防風(fēng)種植面積也在不斷擴(kuò)大，目前全市的防風(fēng)在地面積預(yù)計(jì)已超666.67 hm2。種植防風(fēng)通常2年采收，但在其主產(chǎn)區(qū)也有栽培1年便收獲的現(xiàn)象，而不同生長(zhǎng)年份的防風(fēng)在根生物產(chǎn)量及有效成分積累上有一定差異［14-15］。此外，蒙東地區(qū)冬季凍土期長(zhǎng)，常年晝夜溫差較大，春季干旱少雨且時(shí)常伴有大風(fēng)，土壤肥力低、沙化現(xiàn)象較為嚴(yán)重。因此，確定合理的栽培制度及采取相關(guān)保墑、提溫的栽培措施對(duì)于確保防風(fēng)的產(chǎn)量與質(zhì)量顯得至關(guān)重要。本研究以1年生、2年生和覆膜栽培的防風(fēng)根際土壤為樣本，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)根際細(xì)菌和真菌多樣性的變化進(jìn)行系統(tǒng)分析，探討防風(fēng)生長(zhǎng)發(fā)育、栽培措施以及土壤理化性質(zhì)對(duì)其根際微生物群落組成和多樣性的影響，旨在為防風(fēng)栽培技術(shù)體系的建立提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品的采集與處理

土壤樣品于2021年9月11日采自內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)慶和鎮(zhèn)林場(chǎng)3號(hào)地的防風(fēng)試驗(yàn)田（121°55′17″E、43°43′56″N，海拔140 m），前茬作物為玉米。采用多點(diǎn)混合取樣法，分別采集從未種植過(guò)防風(fēng)的非根際土壤（CK，距防風(fēng)試驗(yàn)田采樣點(diǎn) 50 m 左右）和1年生（F1）、2年生（F2）、覆黑膜栽培1年（FM）的防風(fēng)根際土壤。每種處理在其小區(qū)隨機(jī)選3個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)選取生長(zhǎng)健康、大小一致的防風(fēng)5株，除去落葉和表層土（3 cm）后，收集附著于根系表面0～0.5 cm的土壤作為根際土。將混勻后的土壤分為2份，一份裝入無(wú)菌自封袋中經(jīng)液氮速凍后放入干冰盒，由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行根際土壤分離、DNA提取和高通量測(cè)序，剩余土壤稱量后帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干，研磨過(guò)篩后進(jìn)行土壤含水量（WC）、pH值、總有機(jī)碳（TOC）、全氮（TN）、全磷（TP）、全鉀（TK）、硝態(tài)氮（N）和銨態(tài)氮（A）等土壤理化因子的測(cè)定。

1.2 土壤微生物DNA提取、PCR擴(kuò)增和文庫(kù)制備

采用土壤DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取總DNA，使用Nanodrop 2000對(duì)DNA進(jìn)行定量，并通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。PCR擴(kuò)增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行，利用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌 V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；采用SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）對(duì)真菌V5-V7區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化回收后采用Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例等摩爾混合?；旌虾蟮臄U(kuò)增產(chǎn)物以Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)。

1.3 高通量測(cè)序及土壤微生物組成分析

對(duì)制備好的文庫(kù)在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，合格的文庫(kù)采用Illumina? MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序，原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查后按照index和Barcode信息，進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分。按照QIIME2 dada2分析流程和Vsearch軟件的分析流程進(jìn)行序列去噪及操作分類單元（operational taxonomic unit，OTUs）聚類，對(duì)比Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132，http：//www.arb-silva.de）進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，并采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)在97%相似水平下的OTU進(jìn)行豐度分析，揭示樣品的物種組成。根據(jù)OTU在不同樣本中的分布，評(píng)估每個(gè)樣本的α多樣性水平，包括覆蓋度（Coverage指數(shù)）、豐富度（Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)）和香農(nóng)指數(shù)（Shannon指數(shù)）等分析。

1.3 根際土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定按照《土壤農(nóng)化分析》［16］進(jìn)行：土壤含水量采用稱重法測(cè)定；土壤pH值使用浸提法利用ORP-3000酸度計(jì)測(cè)定；土壤有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀水合加熱法測(cè)定；全氮含量采用濃硫酸消解-凱式定氮法測(cè)定；全磷含量采用鉬銻顯色法測(cè)定；全鉀含量采用火焰光度法測(cè)定；硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸比色法測(cè)定；氨態(tài)氮含量采用KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用新復(fù)極差法（Duncans）比較數(shù)據(jù)組間差異。使用R語(yǔ)言包vegan等進(jìn)行群落Alpha多樣性分析、PICRUSt2（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）分析和主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA） 等分析，并利用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和制表。采用R語(yǔ)言stat包的uclust函數(shù)計(jì)算β多樣性距離矩陣，計(jì)算結(jié)果以平均連接聚類法 （unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)行分析。物種差異分析使用VennDiagram包進(jìn)行，所有結(jié)果采用R腳本進(jìn)行可視化。采用Spearman相關(guān)系數(shù)對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，將獲得的數(shù)值矩陣通過(guò)Heatmap圖直觀展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 防風(fēng)根際土壤微生物群落多樣性分析

對(duì)4種處理下的12份土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序，共得到有效序列794 495條，對(duì)其進(jìn)行聚類共獲得屬水平上的OTU樣本35 745個(gè)。由表1可知，各樣本OTU覆蓋度均在0.975以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能反映樣品中的絕大部分信息。在4種處理中，F(xiàn)1、F2和FM處理下的OUT均高于CK，F(xiàn)1處理組顯著高于CK，可見(jiàn)F1處理下細(xì)菌的物種總數(shù)較多。α多樣性指數(shù)是反映樣本內(nèi)微生物群落豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，其中ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)能夠反映物種的豐富度，指數(shù)越高說(shuō)明物種數(shù)量越多；Shannon指數(shù)反映群落物種的多樣性，該指數(shù)越大說(shuō)明物種的多樣性越高［17］。F1處理下3種α多樣性指數(shù)均高于其他處理，其中Chaol指數(shù)與CK差異顯著。F2處理下ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著低于F1處理，其中Shannon指數(shù)顯著低于CK。FM處理下細(xì)菌群落ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)較F1處理均顯著降低，其中ACE指數(shù)和Chaol指數(shù)分別為F1處理的89.73%和89.27%。可見(jiàn)防風(fēng)根際土壤（F1、F2和FM）細(xì)菌的OTU數(shù)均高于非根際土壤（CK），在防風(fēng)根際土壤各處里組中，2年生（F2）和覆膜（FM）較1年生（F1）細(xì)菌多樣性指數(shù)降低。

對(duì)測(cè)序后防風(fēng)根際土壤真菌進(jìn)行聚類OTU分析，結(jié)果（表2）表明，各樣本的覆蓋度均在0.999以上，各樣本組間OTU數(shù)差異不顯著。F1處理組真菌群落的ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于F2處理、FM處理和CK組，其與F2處理組和CK組在Shannon指數(shù)中差異顯著，其與F2和FM處理組在Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)中差異顯著。可見(jiàn)，防風(fēng)根際土壤各處理組（F1、F2和FM）中真菌較非根際土壤（CK）真菌在物種種類上豐富度更高，防風(fēng)根際土壤各處理組中1年生（F1）較2年生（F2）組和覆膜（FM）組真菌多樣性高。

2.2 防風(fēng)根際土壤微生物群落組成分析

測(cè)序后在非根際土壤中共獲得23門120綱220目705科2 883屬的細(xì)菌，在防風(fēng)根際土壤中共獲得25門122綱248目898科3 063屬的細(xì)菌。從細(xì)菌門水平上分析，WPS-2門和FBP門僅在防風(fēng)根際土壤中檢測(cè)到。由圖1-A可知，總體來(lái)看在所有樣本中放線菌門（Actinobacteria）豐度最高（36.91%～50.36%），其次是變形菌門（Proteobacteria）（22.95%～39.11%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（4.53%～12.25%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（5.69%～10.01%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.07%～5.72%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.79%～5.10%）。這6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門所占相對(duì)比例均在5%以上，約占細(xì)菌總豐度的90%左右。在不同樣本中各個(gè)菌門的占比不同，變形菌門在CK組的相對(duì)豐度為27.8%，在F1和FM處理中占比分別上升至29.94%和34.18%，在F2處理中的占比（38.28%）超過(guò)放線菌門的占比（28.13%），變形菌門成為F2處理組中豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌群。F2和FM處理較F1處理酸桿菌門和擬桿菌門的占比增加，放線菌門和綠彎菌門的占比降低。從細(xì)菌科水平上分析（圖1-B），防風(fēng)根際土壤細(xì)菌主要由Subgroup-6、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）、微單孢菌科（Micromonosporaceae）、念珠藻科（Nocardioidaceae）和鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）等組成。其中Subgroup-6在F2處理中豐度最高，為6.63%，分別是F1和FM處理的2.29倍和1.66倍。F2和FM處理較F1處理伯克氏菌科、鞘脂單胞菌科、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）和亞硝化單胞菌科 （Nitrosomonadaceae）的占比增加，微球菌科、微單孢菌科、念珠藻科、地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）和紅色桿菌科（Rubrobacteraceae）的細(xì)菌豐度則有所下降。FM處理較F1處理黃桿菌科（Flavobacteriaceae）和鏈霉菌科（Streptomycetaceae）細(xì)菌豐度分別增加了5.98倍和5.4倍?？梢?jiàn)覆膜能夠使原本豐度極低的一些細(xì)菌占比迅速增加。

4種處理的土壤樣本中共檢測(cè)到真菌12門17綱19目36科43屬116種，其中芽枝霉門（Blastocladiomycota）僅在防風(fēng)根際土壤中被檢測(cè)到。由圖2-A可知，從真菌門分類水平上看，平均相對(duì)豐度較高的菌門為子囊菌門（Ascomycota）（67.66%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（10.09%）和被孢霉門（Mortierellomycota）（2.53%），其他門的豐度均在1%以下。子囊菌門在FM處理中的豐度最高，為78.25%，其次是F1和CK處理，在F2處理中的豐度最低，為49.12%，較FM處理的占比下降了37.22%。擔(dān)子菌門在CK中的豐度最高，分別是F1、F2和FM處理的3.13倍、3.76倍和2.76倍。被孢霉門真菌在F2處理中較F1處理占比更高，在FM處理中較F1處理增加了2.53倍。由圖2-B可知，從真菌科分類水平上看，小囊菌科（Microascaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、假球殼科（Pleosporaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、小雙腔菌科（Didymellaceae）和暗殼腔菌科（Phaeosphaeriaceae）為優(yōu)勢(shì)真菌科，各科在不同處理中的豐度不同。小囊菌科在各處理中的占比由大到小依次為CK、F1、F2和FM，各根際土壤處理組分別為CK的73.11%、69.4%和40.15%。赤殼菌科在F2和FM處理中較F1處理的豐度降低。鬼傘菌科（Psathyrellaceae）在CK中豐度為13.59%，在FM和F1處理中豐度下降，F(xiàn)M處理中的豐度（3.77%）是F1處理中豐度（0.04%）的94倍。假球殼菌科在FM處理中豐度較高，分別是F1、F2處理的6.05、9.85倍。

2.3 防風(fēng)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性和差異性分析

去除各處理組中未明確分類（unclassified）的微生物群落OTU后，以科一級(jí)水平細(xì)菌和種一級(jí)真菌的OTU制作韋恩圖。由圖3-A可知，不同處理土壤中共有的細(xì)菌OTU數(shù)為405個(gè)，分別占CK、F1、F2和FM處理的59.47%、61.64%、69.83%和63.88%。1年生和對(duì)照組共有510個(gè)，2年生和對(duì)照組共有469個(gè)，覆膜組和對(duì)照組共有503個(gè)，1年生和覆膜組共有506個(gè)。各處理獨(dú)有OTU數(shù)由高到低依次為：對(duì)照組（101個(gè)）、1年生（76個(gè)）、覆膜組（58個(gè)）、2年生（38個(gè)）?？梢?jiàn)，共有OTU數(shù)在CK、F1、F2、FM處理中占59.47%～70.19%，每2組處理的共有OTU數(shù)在469～510個(gè)，對(duì)照組獨(dú)有的OTU數(shù)最多。2年生獨(dú)有OTU數(shù)最少，僅分別為F1和FM處理的50.00%和65.51%。

由圖3-B可知，不同處理土壤中共有的真菌OTU數(shù)為85個(gè)，分別占CK、F1、F2和FM的44.04%、45.70%、45.45%和47.49%。與土壤中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)在F2處理中最低相反，F(xiàn)2處理中獨(dú)有的真菌OTU數(shù)在4個(gè)處理中最高，為28個(gè)，其次為CK、F1和FM處理。整體看來(lái)，F(xiàn)2與F1相比，無(wú)論在細(xì)菌還是真菌的總OTU數(shù)上都逐漸減小，說(shuō)明土壤中微生物群落的整體多樣性在不斷減少。F2中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)遠(yuǎn)小于F1，而獨(dú)有真菌的OTU數(shù)則高于F1，從側(cè)面說(shuō)明了土壤有從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。

為探明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性，對(duì)不同處理土壤樣品的細(xì)菌和真菌群落組成相似度進(jìn)行UPGMA聚類分析。由圖4-A可以看出，4個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落大致可分成3類：非根際土壤CK歸為一類，與其他3個(gè)防風(fēng)根際土壤的細(xì)菌群落組成相似度最低；F2和FM歸為一類，表明2年生和覆膜栽培防風(fēng)根際土壤中細(xì)菌群落組成相似度最高；1年生防風(fēng)則介于前兩類之間。由圖4-B可以看出，土壤真菌群落的組成也可大致分為3類：CK和F1歸為一類，兩者的組成相似度最高；F2和FM各歸為一類，其中FM的真菌群落結(jié)構(gòu)相似度距離與其他3個(gè)處理的最遠(yuǎn)，表明覆膜栽培后其土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了比較劇烈的變化。

2.4 防風(fēng)根際土壤理化因子分析

通過(guò)對(duì)各處理土壤的理化因子分析發(fā)現(xiàn)（表3），除總有機(jī)碳（TOC）、含水量（WC）和pH值外，作為對(duì)照的非根際土壤各項(xiàng)理化因子均與1年生和2年生防風(fēng)有顯著差異。除全氮（TN）外，CK土壤中的全磷（TP）、全鉀（TK）、硝態(tài)氮（N）和銨態(tài)氮（A）的含量均高于F1和F2，隨著生長(zhǎng)年限的增加防風(fēng)根際土壤中的TK和A含量顯著減少，TP和N含量無(wú)顯著變化。雖然覆膜組較1年生組對(duì)土壤的TOC和TN無(wú)顯著影響，但其能夠在一定程度上增加土壤的TP、TK、N和WC，其中對(duì)TP和WC的影響達(dá)顯著水平。此外覆膜后土壤的pH值降低，與非根際土壤組、1年生組和2年生組處理差異顯著。土壤TOC含量在各處理間的差異均不顯著，TN含量雖然在防風(fēng)根際土壤中無(wú)顯著差異，但其在F1、F2、FM處理中的含量卻遠(yuǎn)高于CK，分別為CK的1.71、1.76、2.03倍。

2.5 土壤微生物群落種類與理化因子的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探明不同處理土壤微生物群落種類與其理化因子之間的關(guān)系，對(duì)土壤中相對(duì)豐度前15的細(xì)菌和全部真菌（門水平）與土壤理化因子進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析。如圖5-A所示，在土壤中為優(yōu)勢(shì)菌群的幾個(gè)細(xì)菌門中除變形菌門（Proteobacteria）的豐度與TK、A和N達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)或顯著負(fù)相關(guān)外，其他幾個(gè)菌門如放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌豐度受土壤理化因子影響不顯著。與變形菌門相反，厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌的豐度與N和A呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與TP和TK呈顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，硝化螺菌門（Nitrospirae）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）細(xì)菌的豐度分別與A、TOC和TK呈顯著正相關(guān)關(guān)系；髕骨門（Patescibacteria）細(xì)菌的豐度與TK呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。整體來(lái)看，對(duì)細(xì)菌豐度影響最大的理化因子是TK，其次是A和N，而TN、WC和pH等對(duì)各門細(xì)菌的豐度影響不明顯。

由圖5-B可知，土壤中優(yōu)勢(shì)菌群子囊菌門（Ascomycota）真菌的豐度與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）真菌的豐度和TN呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而被孢霉門（Mortierellomycota）真菌的豐度受土壤理化因子的影響不顯著。各土壤理化因子中，TP、TK、N和A對(duì)一些門類的真菌影響較大，一些未分類的真菌門類（unclassified Fungi）和球囊菌門（Glomeromycota）真菌的豐度均與其呈顯著負(fù)相關(guān)或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；而N和A則與捕蟲霉門（Zoopagomycota）真菌的豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。在14類真菌中，TOC和TN各對(duì)其中一類真菌產(chǎn)生了顯著或極顯著的負(fù)面影響；TP對(duì)其中兩類產(chǎn)生了顯著的負(fù)面影響；TK對(duì)其中3類產(chǎn)生了顯著或極顯著的負(fù)面影響；N、A和pH對(duì)其中至少3類產(chǎn)生了顯著的正面或負(fù)面影響；WC對(duì)土壤真菌的豐度影響不明顯。

2.5 微生物群落功能分析

本研究利用PICRUSt2對(duì)所有樣本基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其代謝通路可歸為6大類，包括代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular processes）、生物體系統(tǒng)（organismal systems）和人類疾?。╤uman diseases），其中富集到代謝過(guò)程的數(shù)目最多，由高到低依次為異生素生物降解和代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、萜類化合物和聚酮化合物的代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）、輔因子和維生素的代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、其他次生代謝物的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）。

基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其功能可以劃分為生物合成（biosynthesis）、退化/利用/同化（degradation/utilization/assimilation）、前體代謝物和能量的產(chǎn)生（generation of precursor metabolite and energy）、聚糖途徑（glycan pathways）和代謝簇（metabolic clusters）五大類，其中聚集在生物合成過(guò)程的基因數(shù)目最多，特別在輔因子、輔基、電子載體和維生素生物合成（cofactor，prosthetic group，electron carrier，and vitamin biosynthesis），脂肪酸和脂質(zhì)生物合成（fatty acid and lipid biosynthesis），核苷和核苷酸生物合成（nucleoside and nucleotide biosynthesis），碳水化合物降解（carbohydrate degradation），氨基酸生物合成（amino acid biosynthesis），碳水化合物生物合成（carbohydrate biosynthesis），氨基酸降解（amino acid degradation），次生代謝物生物合成（secondary metabolite biosynthesis）中。

如圖6所示，對(duì)各樣本的細(xì)菌和真菌功能分別進(jìn)行PCoA分析，當(dāng)2點(diǎn)在坐標(biāo)軸上的投影距離越近，表明這2個(gè)樣本在相應(yīng)維度中的功能組成越相似。結(jié)果顯示77.6%的PCoA軸1和2組合解釋了功能類別變化，除F2處理組外其他組的投影距離較為接近，由此可見(jiàn)，防風(fēng)根際土壤微生物的功能差異受種植年限的影響較為明顯。

在不同生長(zhǎng)年限和不同栽培模式下的防風(fēng)，盡管其各樣品所含根際微生物代謝通路有相似性，但不同樣本所囊括的代謝通路的豐度值不同。如圖7所示，對(duì)不同樣本有顯著差異（P<0.05）的通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌功能注釋中各樣本差異通路由大到小依次為F1與F2（30條）、CK與F2（19條）、F2與FM（6條）、CK與F1（5條）、F1與FM（3條）、CK與FM（3條）；與其類似，各真菌功能注釋有顯著差異（P<0.05）的主要表現(xiàn)在F1與F2、CK與F1和F2與FM間，分別有29條、17條和4條。可見(jiàn)，F(xiàn)1與F2間所囊括的差異性功能注釋條目數(shù)最多，其次是CK與不同年份（F1、F2）間和F2與FM間?？梢?jiàn)相較于覆膜處理，生長(zhǎng)年限對(duì)微生物功能的影響更加明顯，特別是對(duì)于生長(zhǎng)2年的防風(fēng)其根際土壤微生物功能變化最為顯著。

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，植物-根際微生物-環(huán)境因子之間存在著彼此依賴、往復(fù)調(diào)控和相互制約的復(fù)雜關(guān)系。植物根際有著豐富的微生物，這些微生物可以直接或間接的影響藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成［1］。根際微生物群落是植物性能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，根際微生物群落是由農(nóng)業(yè)管理和宿主選擇過(guò)程相互作用決定的［17］。因此，研究植物根際土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)特征以及與周圍環(huán)境因子之間的相互關(guān)系，有利于解析植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制，尤其對(duì)藥用植物栽培生產(chǎn)具有十分重要的意義。土壤微生物的多樣性水平一直被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)功能的重要指標(biāo)。武睿等研究發(fā)現(xiàn)，隨著生長(zhǎng)年限的增加，甘肅貝母根際土壤中的細(xì)菌群落多樣性會(huì)顯著降低，5年生貝母細(xì)菌群落的OTU分類單元、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)均低于對(duì)照和1年生貝母［18］。不同種植年限牡丹根際土壤中真菌群落多樣性之間有顯著差異，隨著生長(zhǎng)年份的增加，真菌多樣性總體上呈先上升后降低的趨勢(shì)，特別是在種植10年的土壤中真菌的ACE指數(shù)和Sobs指數(shù)降至最低［19］。在對(duì)高溫覆膜栽培的韭菜根際土壤研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，覆膜前后細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Shannon指數(shù)等并無(wú)顯著差異［20］。程茂高等通過(guò)稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法對(duì)防風(fēng)根際土壤研究發(fā)現(xiàn)，隨著防風(fēng)生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，土壤中微生物總量逐漸下降，其中1年生和2年生防風(fēng)根際土壤的細(xì)菌和真菌總量分別是對(duì)照的91.78%、55.31%和79.45%、67.12%［21］。與其研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)，1年生防風(fēng)根際土壤中無(wú)論是細(xì)菌還是真菌的α多樣性指數(shù)均高于作為對(duì)照的非根際土壤，說(shuō)明栽培防風(fēng)后土壤中微生物的多樣性在一定時(shí)期內(nèi)是增加的；F2和FM處理的ACE等指數(shù)低于CK和F1處理，說(shuō)明隨著種植時(shí)間由1年變?yōu)?年和覆膜栽培的實(shí)施，根際土壤中微生物的多樣性降低?？傮w來(lái)看，微生物的總數(shù)、菌群豐富度和復(fù)雜程度在測(cè)定樣本中的大小為：1年生組>非根際土壤組；1年生組>2年生組、覆膜組。這與前人在華重樓［22］、太白貝母［23］、三七［24］和枸杞［25］等藥用植物中的研究一致。

植物的種類和生長(zhǎng)發(fā)育階段直接影響著土壤微生物的群落組成結(jié)構(gòu)。大多數(shù)植物，如大豆、玉米、花生、豇豆的根際土壤中，細(xì)菌以變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢(shì)菌群［26］。而在種植辣椒的土壤中以變形菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌［27］，變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門則是香蕉園土中的主要細(xì)菌類群［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)土壤樣品中細(xì)菌豐度最大的2個(gè)門始終是放線菌門和變形菌門，真菌豐度最大的也一直是子囊菌門和擔(dān)子菌門，由此不難看出，這些門類的細(xì)菌和真菌不但在土壤中廣布存在，還能極好地適應(yīng)各種植物的根際環(huán)境。不同處理下防風(fēng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定差異，2年生組和覆膜組較1年生組中細(xì)菌的變形菌門和酸桿菌門占比增加，放線菌門細(xì)菌豐度占比減小。程茂高等在其研究中發(fā)現(xiàn)，2年生防風(fēng)根際放線菌門細(xì)菌的豐度是不斷增高的，推測(cè)可能是因防風(fēng)品種及種植地條件不同所致［21］。胡志娥等對(duì)長(zhǎng)期覆膜條件下的農(nóng)田土壤微生物群落研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期覆膜使土壤真菌共生網(wǎng)絡(luò)變得簡(jiǎn)單而脆弱，其關(guān)鍵物種僅有糞殼菌目（Sordariales）中的未知菌屬一種，而這種菌種的單一性會(huì)對(duì)農(nóng)田土壤生態(tài)環(huán)境帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)［29］。從門水平上看，覆膜栽培增加了防風(fēng)根際土壤中子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌的占比，但對(duì)二者的影響并不顯著。從科一級(jí)水平看，覆膜不但顯著的降低了在物質(zhì)和能量循環(huán)中起重要作用的小囊菌科真菌豐度，而且極大地增加了假球殼科等植物病原真菌群落占比。很多藥用植物在長(zhǎng)期種植后，根際土壤細(xì)菌的多樣性會(huì)逐漸降低，土壤微生物區(qū)系也會(huì)由高肥力的“細(xì)菌型”向低肥力的“真菌型”過(guò)渡［23，30-32］。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，2年生和覆膜栽培防風(fēng)土壤樣品，無(wú)論是細(xì)菌還是真菌在群落的組成上都比對(duì)照和1年生防風(fēng)更為接近。結(jié)合土壤微生物群落多樣性在F2中的整體降低以及F2中獨(dú)有真菌種類的增多不難看出，防風(fēng)生長(zhǎng)年限由1年增長(zhǎng)到2年時(shí)其根際土壤微生物區(qū)系有從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。

除植物種類等生物因素外，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)還受氣候和土壤理化因子如pH值、含水量、有機(jī)碳、全氮等多方面影響。在甘肅貝母根際土壤中，除TN、TK和TP外，pH值、有機(jī)質(zhì)、水解氨、速效磷和速效鉀是驅(qū)動(dòng)其根際土壤細(xì)菌群落的主要因子［18］。野生北蒼術(shù)土壤的pH值、有機(jī)質(zhì)、有效鉀是AM真菌多樣性和豐度的主要影響因子［33］。柴胡、黨參和遠(yuǎn)志根際土壤的TN、總碳、pH值、脲酶、過(guò)氧化氫酶等分別影響了硝化螺旋菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門細(xì)菌類群的豐度［34］。在以上研究中，pH值是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子，通常情況下pH值與土壤中酸桿菌的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系［35］，但在本研究中，pH值對(duì)酸桿菌門細(xì)菌的豐度無(wú)顯著影響，甚至所有檢測(cè)到的細(xì)菌門類都不受pH值影響，而酸桿菌門細(xì)菌與所檢測(cè)的8種土壤理化因子之間也無(wú)明顯相關(guān)性。pH值對(duì)防風(fēng)根際土壤細(xì)菌門類的影響不顯著，但子囊菌門、一些未分類門和捕蟲霉門（Zoopagomycota）真菌的豐度卻與其顯著相關(guān)。李毳等研究發(fā)現(xiàn)，土壤環(huán)境因子對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著影響，但植物種類本身對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響更為重要［34，36］。也有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門細(xì)菌更偏好于在高養(yǎng)分的土壤環(huán)境中生存，其菌群豐度與土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量顯著相關(guān)［37］。在本研究中，變形菌門細(xì)菌的豐度受TOC和TN影響并不顯著，而是和TK、N和A顯著相關(guān)。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，TK、N和A不僅是防風(fēng)根際土壤細(xì)菌群落的主要驅(qū)動(dòng)因子，也是影響真菌組成的主要因子，但特別的是，本研究中幾個(gè)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門類和真菌門類（除未分類門）均與TK、N和A無(wú)顯著相關(guān)性。土壤微生物通過(guò)參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和礦化等過(guò)程來(lái)影響土壤養(yǎng)分循環(huán)，并調(diào)節(jié)土壤的功能［38］。利用PICRUSt方法基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)細(xì)菌和真菌菌群代謝功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌功能主要集中在異生素生物降解代謝和碳水化合物代謝，真菌功能主要集中在生物合成。在甘蔗和水稻上研究發(fā)現(xiàn)此類功能對(duì)植物生長(zhǎng)、生存具有積極作用［39-40］。PCoA分析表明微生物功能差異主要表現(xiàn)在2年生組。對(duì)差異性功能注釋條目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)也表明，2年生組較1年生組顯著差異條目數(shù)最多。再結(jié)合各樣本OTU數(shù)和Chao1指數(shù)對(duì)比來(lái)看，2年生組和覆膜組根際微生物較1年生豐富度減小、微生物功能減弱。綜合來(lái)看，土壤理化因子和各處理均對(duì)防風(fēng)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響，各個(gè)處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響更大，特別是生長(zhǎng)年份的影響作用尤為明顯，覆膜影響次之。

本研究初步揭示了不同生長(zhǎng)年限和覆膜栽培防風(fēng)根際土壤中微生物群落的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)年份是影響防風(fēng)根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成的重要因子。研究結(jié)果提示我們?cè)诜里L(fēng)的田間管理中，尤其是在栽培的第2年應(yīng)適量增施農(nóng)家肥和生物肥，以保證其土壤微生物的多樣性。在今后的研究中我們還將繼續(xù)開(kāi)展其余年份和其他類型的覆膜實(shí)驗(yàn)，為防風(fēng)合理栽培措施的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

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