段超群，鄧星，彭偉，劉珍，張露，李清，解興興，韓艷

(宜春市婦幼保健院輔助生殖科,宜春 336000)

體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI)技術(shù)迅速發(fā)展,臨床妊娠率不斷提高,可達50%,但抱嬰回家率仍只有30%左右[1]。胚胎移植后可能出現(xiàn)胚胎丟失包括生化妊娠、流產(chǎn)等不良結(jié)局,因此如何選擇最有發(fā)育潛能的胚胎移植是改善臨床妊娠率、降低流產(chǎn)率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。囊胚階段的胚胎具有與子宮內(nèi)膜更為同步,并且能更好地判斷胚胎發(fā)育潛能等優(yōu)勢[2-3]。囊胚移植雖然提高了臨床妊娠率,但是胚胎丟失的情況并未見明顯下降[4],這可能與我們在移植時選擇的胚胎質(zhì)量有關(guān)。形態(tài)學評分系統(tǒng)依然是目前應用最廣泛的胚胎選擇方法[5],然而胚胎發(fā)育是一個動態(tài)過程,單一時間點的觀察并不能準確反映胚胎的發(fā)育潛能[6]。本研究通過回顧性分析IVF/ICSI助孕患者行單囊胚移植后,妊娠丟失發(fā)生與移植囊胚及其對應卵裂期胚胎評分、卵裂模式的關(guān)系,希望能指導臨床挑選更適合的胚胎進行移植,從而改善臨床結(jié)局。

一、資料與方法

1.研究對象及分組:回顧性分析2017年7月至2022年7月于宜春市婦幼保健院輔助生殖科行單囊胚移植且移植后β-HCG陽性的患者的臨床資料。納入/排除標準:女方年齡<40歲;受精方式為IVF或ICSI;單囊胚移植且移植后HCG陽性的周期;甲狀腺、腎上腺功能等未見明顯異常;排除子宮畸形(如縱膈子宮、雙角子宮等)以及嚴重的輸卵管積水、宮腔粘連、復發(fā)性流產(chǎn)、反復植入失敗患者。本研究通過宜春市婦幼保健院倫理委員會批準。

共收集單囊胚移植后HCG陽性周期196個。根據(jù)臨床妊娠結(jié)局將研究對象分為3組:生化妊娠組(34個周期)、早期流產(chǎn)組(22個周期)和持續(xù)妊娠組(140個周期)。

2.單囊胚移植周期資料回顧:促排卵方案采用早卵泡期長效長方案或拮抗劑方案,并在扳機后36～38 h行陰道超聲監(jiān)測下取卵術(shù),取卵術(shù)后給予常規(guī)黃體支持。受精后第3天(D3)卵裂期胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃、6%CO2及5%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至D5或D6囊胚期,行鮮胚移植或凍融胚胎移植(FET)。FET周期采用自然周期或激素替代周期準備內(nèi)膜:月經(jīng)規(guī)律有排卵患者行自然周期準備內(nèi)膜,于排卵日后第5天進行單囊胚復蘇移植;無排卵或月經(jīng)周期不規(guī)律患者行激素替代周期準備內(nèi)膜,根據(jù)B超檢查提示的子宮內(nèi)膜情況來擬定單囊胚復蘇移植時間。

妊娠結(jié)局的判斷:囊胚移植后第9天測定β-HCG水平≥20 U/L但移植后第28天行陰道B超監(jiān)測未見孕囊者為生化妊娠;移植后第28天行陰道B超監(jiān)測存在孕囊者為臨床妊娠;臨床妊娠但于12周前流產(chǎn)者為早期流產(chǎn);臨床妊娠且胎兒心管搏動維持至12周后者為持續(xù)妊娠。

3.連續(xù)性觀察胚胎質(zhì)量方法:對受精后D2和D3卵裂期胚胎、D5和D6囊胚期胚胎進行連續(xù)性觀察并記錄評分。D2和D3卵裂期胚胎評分參考Istanbul共識[7],根據(jù)卵裂球數(shù)量、碎片程度、卵裂球均勻度等進行評分,評分分為Ⅰ～Ⅳ級,其中Ⅰ和Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。囊胚期胚胎評分參照Gardner囊胚評分法[8]進行,根據(jù)囊胚的擴張和孵出程度分成1～6期,3～6期囊胚進一步對內(nèi)細胞團(ICM)和滋養(yǎng)層細胞(TE)分級為A～C,3BB及以上為優(yōu)質(zhì)囊胚?；谶@一標準,將ICM評級或TE評級為A、B的歸為優(yōu)質(zhì)ICM或TE(A+B)。胚胎評分均由兩位實驗室人員進行,一人評分,另一人核對,以減少主觀差異。

4.觀察/分析指標:患者的基礎資料以及促排卵、受精/胚胎培養(yǎng)和囊胚移植相關(guān)指標。包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、不孕類型、基礎卵泡刺激素(bFSH)水平、基礎黃體生成素(bLH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、竇卵泡計數(shù)(AFC);獲卵數(shù)、成熟卵數(shù);授精方式、D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚比例、D2優(yōu)質(zhì)卵裂胚比例、D2～D3胚的4細胞(4C)到8細胞(8C)卵裂模式占比、優(yōu)質(zhì)ICM囊胚占比和優(yōu)質(zhì)TE囊胚占比;移植類型、內(nèi)膜厚度、移植胚胎的優(yōu)質(zhì)囊胚比例。將D2卵裂至4C、D3卵裂至8C的D2～D3卵裂模式歸為優(yōu)質(zhì)卵裂模式。

二、結(jié)果

1.患者基礎資料比較:本研究共納入196個單囊胚移植周期,其中生化妊娠組34個周期,早期流產(chǎn)組22個周期,持續(xù)妊娠組140個周期。3組間患者年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、LH、AMH水平、AFC比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);生化妊娠組原發(fā)不孕比例顯著低于早期流產(chǎn)組和持續(xù)妊娠組(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者基礎臨床資料比較[(-±s),n(%)]

2.患者促排卵、受精及單囊胚移植周期各參數(shù)比較:3組間獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、IVF受精比例、新鮮周期比例、移植日內(nèi)膜厚度比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵、受精及移植周期相關(guān)指標比較[(-±s),n(%)]

3.胚胎發(fā)育實驗室指標比較:3組間囊胚評分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM評分、囊胚TE評分、囊胚形成時間比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其中,生化妊娠組的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著低于其他兩組(P<0.05);生化妊娠組優(yōu)質(zhì)卵裂模式(D2～D3的4C～8C卵裂模式)占比顯著低于早期流產(chǎn)組(P<0.05);生化妊娠組囊胚ICM和TE的A+B評分占比、D5囊胚占比均顯著低于持續(xù)妊娠組(P<0.05);而3組間D2、D3卵裂期胚胎評分比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者胚胎發(fā)育實驗室指標比較[n(%)]

4.影響單囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回歸分析:因年齡、BMI為常見影響生化妊娠的因素,故納入年齡、BMI、不孕類型、ICM評分、TE評分等構(gòu)建多因素Logistic回歸方程。調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn),繼發(fā)不孕、囊胚TE評分、囊胚形成時間對單囊胚移植生化妊娠的影響具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表4)。

表4 單囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回歸分析

三、討論

在IVF/ICSI治療中,由于對患者妊娠結(jié)局的密切關(guān)注,生化妊娠的發(fā)生往往被捕捉到,其發(fā)生率為20%～30%;同時,輔助生殖技術(shù)助孕患者仍存在10%～20%的自然流產(chǎn)率,這無疑給不孕不育夫婦帶來了巨大的心理創(chuàng)傷和經(jīng)濟壓力[9]。如何降低生化妊娠率和流產(chǎn)率、提高活產(chǎn)率是輔助生殖領(lǐng)域一直備受關(guān)注的問題。而生化妊娠、流產(chǎn)與胚胎質(zhì)量密切相關(guān),隨著單胚胎移植臨床應用的增加,選擇“最佳”胚胎進行移植并達到活產(chǎn)一直是臨床的迫切需求?？赡艿姆椒ㄖ皇茄娱L胚胎培養(yǎng)時間至囊胚階段。盡管囊胚選擇的形態(tài)學標準具有一定的主觀性,但它排除了8細胞期后發(fā)育受損的胚胎,并降低了移植染色體異常的優(yōu)質(zhì)胚胎的風險[10]。

形態(tài)學評分仍是目前應用最廣泛的胚胎評分方法。由于囊胚發(fā)育是一個階段連續(xù)性的過程,從D2、D3卵裂期胚胎至D5、D6囊胚發(fā)育的各階段我們都進行了形態(tài)學觀察,主要觀察指標為卵裂球細胞數(shù)目及其均勻度、胚胎碎片比例、囊胚擴張狀態(tài)及TE、ICM情況等。郭映純等[11]研究發(fā)現(xiàn),移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的優(yōu)質(zhì)囊胚相較于移植非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來源的優(yōu)質(zhì)囊胚,可獲得較高的臨床妊娠率和較低的流產(chǎn)率。Xia等[12]研究表明,相較于高質(zhì)量卵裂胚來源的囊胚,低質(zhì)量卵裂胚來源的囊胚移植組流產(chǎn)率較高。而Herbemont等[13]研究顯示,D2和D3卵裂期胚胎質(zhì)量的好壞并不影響囊胚的種植率和流產(chǎn)率。方璐等[14]研究發(fā)現(xiàn),來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚復蘇移植后的流產(chǎn)率并無顯著差異。以上研究顯示不同卵裂期胚胎評分對囊胚移植妊娠結(jié)局的影響存在爭議。那么囊胚評分及其對應的卵裂期評分對單囊胚移植患者的妊娠結(jié)局究竟有多大的參考價值呢?本研究通過比較單囊胚移植周期生化妊娠組、早期流產(chǎn)組和持續(xù)妊娠組的囊胚質(zhì)量及其對應的D2、D3卵裂期胚胎質(zhì)量參數(shù),探究胚胎發(fā)育不同時期的評分對妊娠丟失的影響,為選擇最具發(fā)育潛能的囊胚提供可能依據(jù)。

本研究共納入196個單囊胚移植周期,其中生化妊娠組34個周期、早期流產(chǎn)組22個周期、持續(xù)妊娠組140個周期。3組間基礎資料包括年齡、BMI、不孕年限、基礎性激素水平、AMH水平、AFC、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精方式、移植周期類型及移植日內(nèi)膜厚度等比較均無統(tǒng)計學差異;生化妊娠組的繼發(fā)不孕比例(88.2%)較早期流產(chǎn)組(59.1%)和持續(xù)妊娠組(65.7%)更高。同時我們探討了移植囊胚評分、對應的D2/D3卵裂期胚胎評分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM評分、囊胚TE評分、囊胚形成時間(D5/D6)與生化妊娠和早期流產(chǎn)的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),生化妊娠組的優(yōu)質(zhì)囊胚率(70.6%)較早期流產(chǎn)組(100.0%)和持續(xù)妊娠組(93.6%)顯著降低;與持續(xù)妊娠組相比,生化妊娠組的囊胚ICM和TE的A+B評分占比、D5囊胚占比均顯著降低。

為排除混雜因素影響,本研究進一步以生化妊娠組為病例組、持續(xù)妊娠組為對照組進行了多因素Logistic回歸分析。因為年齡、BMI為常見影響生化妊娠的因素,將其也納入回歸方程。調(diào)整混雜因素后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)繼發(fā)不孕、TE評分、囊胚形成時間對單囊胚移植生化妊娠的影響具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。生化妊娠組移植TE評級為A/B的囊胚所占的比例較持續(xù)妊娠組顯著降低(P<0.05),這意味著囊胚TE評分與持續(xù)妊娠相關(guān)。Honnma等[15]也發(fā)現(xiàn)TE的形態(tài)學評分與持續(xù)妊娠率呈顯著正相關(guān)?？赡苁窃u分更高的TE細胞分泌HCG的時間更早且分泌量更多,而HCG能夠刺激黃體生成,調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性,在維持妊娠中發(fā)揮重要作用[16]。此外,本研究中生化妊娠組移植D6囊胚比例顯著高于持續(xù)妊娠組,這可能與D6囊胚中非整倍體率高于D5囊胚有關(guān)[17]。然而,多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)移植囊胚對應的卵裂期評分并非單囊胚移植妊娠丟失的獨立影響因素(P>0.05),這與Herbemont等[14]的研究結(jié)果一致,即D2和D3卵裂胚質(zhì)量的好壞并不顯著影響囊胚移植的流產(chǎn)率。此外,Poulain等[18]發(fā)現(xiàn),移植D3質(zhì)量較差胚胎來源的優(yōu)質(zhì)囊胚后,植入率為29.4%,研究認為D2或D3胚胎形態(tài)學評估的預測價值有限。根據(jù)目前的研究結(jié)果,如果采取囊胚移植策略,可以建議胚胎學家在第2天不再評估胚胎質(zhì)量,這樣可以避免非必要地從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿,從而減少胚胎培養(yǎng)環(huán)境變化對后續(xù)植入率等的潛在影響[19]。

綜上所述,無論卵裂階段的胚胎質(zhì)量如何,我們建議優(yōu)先選擇D5優(yōu)質(zhì)囊胚進行移植,并優(yōu)先考慮TE評分級別高的囊胚,以期減少IVF/ICSI治療中胚胎丟失的發(fā)生。但因本研究樣本量較小,后續(xù)還需進一步擴大樣本量加以探討,以驗證囊胚評分及其對應的卵裂期評分對妊娠丟失的影響。