miR-361-3P調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導成骨細胞凋亡的研究

王帆，王鵬皓

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

人體骨骼的正常代謝依靠成骨細胞與破骨細胞的動態(tài)平衡維持。這種動態(tài)平衡受骨組織周圍微環(huán)境中存在的多種細胞因子調(diào)節(jié)，其中，轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 作為骨組織局部微環(huán)境中至關重要的調(diào)節(jié)因子，在成骨活動中發(fā)揮十分重要的作用［1］。細胞凋亡使細胞在基因控制下程序性死亡，進而維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡，影響組織周圍內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定。研究［2］證明，微RNA （micro RNA，miRNA） 對成骨細胞的再生、轉(zhuǎn)化、分化等代謝過程起至關重要的作用。目前對miR-361-3P在骨代謝相關疾病中的研究較少見，且其對成骨細胞自我程序性死亡的作用機制尚未清楚。因此，本研究擬通過分子生物學技術檢測人成骨細胞內(nèi)miR-361-3P對TGF-β1和細胞凋亡標志分子caspase 3蛋白活性表達的影響，以探討miR-361-3P/TGF-β1通路在人成骨細胞凋亡中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

用DMEM培養(yǎng)液 （含10 % 胎牛血清、300 mg/L G418） 于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人成骨細胞系hFob1.19 （北京307-青藤轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心）。

1.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染

miR-361-3p mimic （mimic）、miR-361-3p inhibitor（inhibitor） 和 TGF-β1 siRNA （si-TGF-β1） 均購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。將hFob1.19細胞隨機分為control組、mimic組及其陰性對照組 （mimic-NC組）、inhibitor 組及其陰性對照組 （inhibitor-NC組）、si-TGF-β1及其陰性對照組 （si-NC組）。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng) （北京中杉金橋生物有限公司），于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下行細胞轉(zhuǎn)染8 h。

1.3 CCK-8實驗

將hFob1.19細胞轉(zhuǎn)移至6孔板，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 （5 mg/mL，北京中杉金橋生物有限公司），孵育2 h，450 nm 處檢測吸光度。

1.4 實時PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol試劑提取細胞總RNA。采用Nanodrop 2000測定RNA樣品的濃度和純度。用primematipt混合RT 隨機引物對mRNA行逆轉(zhuǎn)錄。用TRIzol reagent行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。采用PrimeScript RT Master Mix及ABI Prism7500序列檢測系統(tǒng)進行cDNA擴增。以GAPDH和U6作內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法分析miRNA和mRNA的相對表達量。采用不同引物檢測環(huán)狀RNA的后剪接，采用聚合引物檢測線性mRNA。miRNA和mRNA引物見表1。

表1 miRNA和mRNA引物設計 （5’-3’）Tab.1 Primer design for the miRNA and mRNA expression assays （5’-3’）

1.5 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取細胞總蛋白，用8%或10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入TGF-β1一抗（稀釋1 ∶250，美國賽默飛公司），37 ℃孵育過夜。用PBS洗膜后，加入過氧化物酶偶聯(lián)的二抗 （美國賽默飛公司），37 ℃孵育2 h。PBS洗膜，采用增強化學發(fā)光法顯色。用GAPDH （稀釋1 ∶2 500） 作內(nèi)參照。

1.6 報告基因熒光素酶活性測定

將miR-361-3p和TGF-β1的3’-UTR插入pmirGLO質(zhì)粒，獲得熒光素酶報告載體 （pmirGLO-miR-361-3p-wt，pmirGLO，TGF-β1-wt）。構建突變質(zhì)粒 （pmirGLOmiR-361-3p-mut和pmirGLO-TGF-β1-mut）。96孔板中培養(yǎng)hFob1.19細胞24 h，分別轉(zhuǎn)染上述pmirGLO質(zhì)粒48 h，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng) （美國Promega公司） 測定熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用Prism7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示。采用Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)分布，Levene檢驗分析方差齊。采用未配對的Student’st檢驗 （正態(tài)分布和方差齊數(shù)據(jù)）、Welcht檢驗 （方差不齊數(shù)據(jù)） 或Mann-WhitneyU檢驗 （非正態(tài)分布數(shù)據(jù)） 進行組間比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-361-3p對成骨細胞內(nèi)TGF-β1的調(diào)節(jié)作用

miR-361-3p mimic作用成骨細胞48 h后，細胞內(nèi)miR-361-3p mRNA表達水平明顯升高 （圖1A），TGF-β1mRNA表達水平顯著下調(diào)，TGF-β1蛋白表達水平受到明顯抑制 （圖1B、1C），差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05）。

圖1 miR-361-3p 對成骨細胞內(nèi)TGF-β1表達的影響Fig.1 Effects of miR-361-3p on TGF-β1 expression in osteoblasts

2.2 miR-361-3p對成骨細胞增殖及凋亡的影響

miR-361-3p mimic作用成骨細胞48 h后，CCK-8結果顯示細胞增殖被顯著抑制 （圖2A）；同時，酶聯(lián)免疫吸附實驗和Western blotting均發(fā)現(xiàn)，成骨細胞內(nèi)caspase 3蛋白表達水平明顯升高 （圖 2B、2C），差異均有統(tǒng)計學意義 （均P＜ 0.05）。

圖2 miR-361-3p對成骨細胞增殖及caspase 3 活性的調(diào)控作用Fig.2 Regulation of miR-361-3p on osteoblast proliferation and caspase 3 activity

2.3 miR-361-3p負向調(diào)控靶基因TGF-β1對成骨細胞增殖和凋亡的影響

miR-361-3p與TGF-β1mRNA的3’-UTR區(qū)域存在多個結合位點 （圖3A）。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，miR-361-3p mimic組中 WT-TGF-β1的熒光素酶活性明顯降低 （圖3B），證實miR-361-3p可與TGF-β1mRNA結合并干預其表達；與control組和inhibitor-NC組比較，miR-361-3p inhibitor可明顯抑制成骨細胞內(nèi)miR-361-3p mRNA的表達和caspase 3的蛋白活性 （圖 3C、3F），顯著增強成骨細胞增殖效應 （圖3E）；si-TGF-β1可顯著抑制成骨細胞增殖，而顯著增強caspase 3的蛋白活性 （圖3D、3F），差異均有統(tǒng)計學意義 （均P＜0.05）。以上均證實miR-361-3p/TGF-β1對成骨細胞增殖和凋亡具有調(diào)控作用。

圖3 miR-361-3p/TGF-β1調(diào)控成骨細胞增殖和凋亡的作用Fig.3 Role of miR-361-3p/TGF-β1 in regulating osteoblast proliferation and apoptosis

3 討論

miRNA是基因表達調(diào)控的重要組成部分，通常由20～24個核苷酸組成，通過多種途徑 （包括直接抑制翻譯過程，或通過烯基化使mRNA靶點降解） 參與細胞增殖、凋亡、遷移等過程及炎癥、感染、固有免疫的調(diào)控，在機體的免疫應答、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用［3］。近年來，miRNA對骨代謝的影響受到廣泛關注。研究表明，miR-150-3p 通過β-catenin對間充質(zhì)干細胞的成骨分化產(chǎn)生影響［4］；miR-23b通過影響Smad3抑制MC3T3-E1細胞的成骨化［5］；miR-103a通過在轉(zhuǎn)錄過程后調(diào)控Runx2，抑制成骨細胞的活性，從而降低細胞外基質(zhì)的礦化［6］；miR-204和miR-211通過抑制Runx2蛋白在成骨活動中的負反饋調(diào)節(jié)，增加人骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)的脂肪生成［7］。本研究結果顯示，miR-361-3p可能通過抑制靶基因TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和蛋白活性，抑制成骨細胞的增殖，并促進成骨細胞凋亡。

miRNA通過與靶基因相關序列位點結合發(fā)揮作用。此序列通常僅包含6～8個堿基，因此，1個miRNA可能對多個mRNA產(chǎn)生作用，而1個 mRNA可能受多個miRNA調(diào)控［8］。某些miRNA的缺失可能不會影響機體正常的生長發(fā)育，但可能引發(fā)疾病，很多慢性疾病的發(fā)生均與miRNA特殊的作用方式有關。miR-361-3p作為一種抗炎mi-RNA，可通過靶向抑制活化性T淋巴細胞核因子5調(diào)節(jié)核因子κB［9］；miR-361-3p在肺組織中存在表達，通過抑制癌細胞的生成、轉(zhuǎn)移，加速癌細胞的凋亡，發(fā)揮抗癌的功能［10］；miR-361-3p過量表達可抑制高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞凋亡，降低乳酸脫氫酶含量，提高腎小管上皮細胞存活率，降低細胞內(nèi)丙二醛和caspase 3 的表達水平［11］。miR-361-3p能調(diào)控多種靶基因，如胰島素樣生長因子1、TNF、p73和促卵泡激素等［12］。本研究表明，人成骨細胞內(nèi)的miR-361-3P與靶基因TGF-β1的啟動區(qū)有8個堿基結合位點，可靶向抑制TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄，參與成骨細胞凋亡。

TGF-β1具有多效性及多向性，通過自分泌或旁分泌等方式與細胞表面受體信號結合，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及凋亡。研究［13］表明，TGF-β1對心肌細胞增殖、凋亡及成纖維化等有調(diào)控作用；TGF-β1高表達通過旁分泌機制使心臟成纖維細胞的膠原形成增加，導致心肌肥厚、心肌收縮功能降低［14］。骨組織微環(huán)境中，TGF-β1由成骨細胞產(chǎn)生，通過控制成骨細胞調(diào)節(jié)骨代謝活動，在骨組織形成和骨組織吸收的動態(tài)平衡中發(fā)揮至關重要的作用。對小鼠成骨細胞的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可通過降低RANKL、增加OPG的表達，減少破骨細胞的生成和骨吸收降低［15］。本研究通過檢測凋亡蛋白caspase 3的活性表達，探討miR-361-3p/TGF-β1和成骨細胞凋亡間可能存在的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，當阻斷miR-361-3p/TGF-β1通路時，成骨細胞凋亡和caspase 3蛋白活性明顯增強，表明miR-361-3p/TGF-β1可負向調(diào)控成骨細胞的凋亡。

綜上所述，本研究探討了miR-361-3p通過TGF-β1影響成骨細胞增殖及凋亡的作用機制，發(fā)現(xiàn)TGF-β1是miR-361-3p的靶基因，且miR-361-3p通過下調(diào)TGF-β1的表達，促進成骨細胞增殖，抑制成骨細胞凋亡。