朱俊，汪晨曦

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，上海 200240）

鞣酸，又稱單寧酸，是從植物五倍子中提取的一種多酚類化合物。其含有的大量的酚羥基，可以與蛋白、多肽發(fā)生絡(luò)合形成懸浮液或沉淀。因此在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，如鞣酸軟膏、鞣酸蛋白等鞣酸藥物以及鞣酸小檗堿、鞣酸加壓素等緩釋藥物。鞣酸含有大量的酚羥基，因此易氧化形成黑色的醌，致使純度下降直接影響其與蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而影響藥品質(zhì)量[1]。在我司生產(chǎn)鞣酸加壓素的過程中，需要鞣酸和多肽加壓素進(jìn)行絡(luò)合，也出現(xiàn)過絡(luò)合結(jié)果不佳的問題。結(jié)合鞣酸本身的特性，我們進(jìn)一步判斷是因為儲存不當(dāng)、時間過長等原因，鞣酸物料發(fā)生氧化、受潮等變質(zhì)問題影響純度，最終降低產(chǎn)品質(zhì)量。

鞣酸純度的檢驗較為困難，通常情況下，可直接觀察其顏色、性狀，但此方法只能簡單判斷鞣酸的品質(zhì)，難以確定量化的標(biāo)準(zhǔn)，作用有限。也可采取液相色譜法，但鞣酸摩爾吸光系數(shù)過高，同時其含有的酚羥基會與色譜柱發(fā)生緊密的結(jié)合，從而污染、堵塞、損壞色譜柱，產(chǎn)生極高的成本。紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法可通過鞣酸最大吸收波長（213 nm，276 nm）進(jìn)行分析，但鞣酸分子所具有的25 個酚羥基易發(fā)生氧化，部分氧化后摩爾吸光系數(shù)變化極小，紫外法難以區(qū)分，故分析結(jié)果會偏高而不準(zhǔn)確，即鞣酸氧化所導(dǎo)致的純度降低，無法通過紫外檢測確定[2]。因此，我們需要一種精確的、易操作、低成本的方法來檢測鞣酸純度。

受到鞣酸加壓素制備過程形成多肽-鞣酸絡(luò)合物的啟發(fā)，我們設(shè)計了一種基于蛋白-鞣酸形成絡(luò)合物的鞣酸純度檢測方法。該絡(luò)合物在水中形成均勻分散而不沉降的溶液，可以用濁度評價其整個絡(luò)合體系[3]。在680 nm 波長測定紫外吸收值，建立吸光度-鞣酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品鞣酸的純 度。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

實驗所用原料藥品、試劑均購買于商業(yè)公司，未經(jīng)說明使用前均不需要二次純化。所有空氣、濕度敏感型反應(yīng)，都在氬氣保護環(huán)境下，在烘干的玻璃容器中進(jìn)行反應(yīng)。所用的鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品購于ACROS，糜蛋白酶、胰蛋白酶、縮宮素由上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司制備。所有購買的試劑除另外說明的未經(jīng)進(jìn)一步純化，購買后直接使用。

高效液相色譜（HPLC）數(shù)據(jù)由Agilent 1200 Series 型號儀器，通過ZORBAX SB-C18 色譜柱測試得到。紫外檢測數(shù)據(jù)均為紫外分光光度計測得，所用儀器型號為MAPADA UV-3100。

1.2 樣品制備

配置濃度為0.1 M 的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH=7.0。配置梯度濃度范圍為0～ 10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)鞣酸水溶液避光儲存待用。將胰蛋白酶、糜蛋白酶、凍干縮宮素粉末溶于磷酸緩沖液，配置濃度為1 mg/mL、5 mg/ mL，分別作為低濃度和高濃度的蛋白溶液，用于在不同蛋白濃度下和鞣酸發(fā)生絡(luò)合作用。

1.3 蛋白絡(luò)合標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取上述配制的0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)鞣酸溶液100 μL，分別滴加進(jìn)2 900 μL 的高濃度蛋白溶液，25 ℃搖床孵育30 min，轉(zhuǎn)速150 r/min。取樣以上溶液分別測量680 nm 處紫外吸收，獲取高濃度蛋白條件下吸光度-鞣酸濃度變化曲線。

將上述實驗組的高濃度更換為低濃度蛋白溶液，搖床孵育2 h，其他條件不變，獲取低濃度蛋白條件下吸光度-鞣酸濃度變化曲線。

通過origin 對上述曲線進(jìn)行線性擬合，方程如下：

式中A——待測樣品吸光度；

x——待測樣品鞣酸濃度；

k——參數(shù)。

1.4 待測鞣酸樣品測試

將待測的鞣酸樣品按照5 mg/mL 配制，按照實驗方案滴加進(jìn)不同濃度的蛋白溶液。形成穩(wěn)定均勻的蛋白-鞣酸絡(luò)合物后，測試其在680 nm 處紫外吸收。將吸光度帶入對應(yīng)蛋白擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測樣品實際濃度，該濃度與配制濃度5 mg/mL 的比值即為待測樣品鞣酸的純度。

鞣酸純度=（C/5）×100%

式中C——待測樣品實際濃度；

5——待測樣品配制濃度（mg/mL）。

1.5 鞣酸樣品的HPCL 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

取鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品加純化水配制成濃度分別為2、4、6、8、10 μg/mL 的對照品儲備溶液。將待測樣品1-3號配制為5 μg/mL 的供試品溶液。以純化水作為空白溶劑。色譜柱為 Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度 洗 脫（0～ 4 min，2%～ 5% A；4～ 5 min，5%～ 8%A；5～ 6 min，8% ～ 15% A；6～ 15 min，15% A；15～ 25 min，15%～ 23% A；25～ 30 min，23% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：276 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)均不低于5 000。按積分面積-鞣酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的積分面積帶入標(biāo)曲計算純度。

2 結(jié)果與討論

鞣酸可以和蛋白絡(luò)合形成一種乳白色的懸濁液，根據(jù)具體濃度條件，可以維持穩(wěn)定、不沉降約6～ 12 h。該體系在640～ 680 nm 波長下具備紫外吸光度，紫外吸光度和濁度成正比例關(guān)系，因此可以用紫外吸光度來評價該系統(tǒng)的絡(luò)合狀態(tài)。值得注意的是，這種吸光度的產(chǎn)生是由于絡(luò)合產(chǎn)生的微顆粒對光具備散射效果，并非對光的吸收產(chǎn)生的降低[4]。

采取這種絡(luò)合的方法制備鞣酸-蛋白絡(luò)合物時，需要選取合適的蛋白體系以及合適的蛋白和鞣酸濃度。根據(jù)多次實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了鞣酸絡(luò)合蛋白的能力對蛋白的種類有很大差異。例如，常用的牛血清蛋白和鞣酸，在多種配比的濃度下均無法絡(luò)合，觀察不到懸濁液，也無法在680 nm 下測得紫外吸光度；而玻璃酸酶和鞣酸的絡(luò)合非常強烈，在多種配比的濃度下形成的絡(luò)合物能觀察到明顯的懸浮顆粒，紫外吸光度也會在讀數(shù)期間發(fā)生變化，短時間內(nèi)還會發(fā)生沉降。同時我們也注意到，氧化變質(zhì)的鞣酸在紫外吸光度中沒有明顯的變化，但參與蛋白進(jìn)行絡(luò)合的過程差別明顯，這使得該絡(luò)合方法具備了區(qū)分鞣酸酚羥基氧化程度的能力。

我們選取了胰蛋白酶、糜蛋白酶作為實驗組，此兩種蛋白均可在實驗條件內(nèi)形成穩(wěn)定的絡(luò)合體系，可以類比鞣酸作為絡(luò)合劑應(yīng)用于藥品生產(chǎn)的多種環(huán)境；選擇了9 肽產(chǎn)品縮宮素，其分子量為1 007.2，可以類比鞣酸作為輔料、有效成分等在小分子的應(yīng)用環(huán)境。基于以上方法，我們設(shè)計了鞣酸和蛋白的絡(luò)合實驗。以胰蛋白酶為例，選擇1 mg/mL 和5 mg/mL兩種蛋白濃度，可以對應(yīng)不同的藥品生產(chǎn)環(huán)境。實驗過程中，我們首先將鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品制備成不同濃度的溶液，再將鞣酸溶液滴加進(jìn)蛋白溶液中，立刻出現(xiàn)白色渾濁。在搖床中進(jìn)行孵育獲得穩(wěn)定體系，然后測量其在680 nm 下的紫外吸光度。我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鞣酸所需要的孵育時間不同，低濃度的鞣酸-蛋白絡(luò)合物在絡(luò)合30 min 后，紫外吸光度讀數(shù)還會繼續(xù)上升，因此提升到2 h 來維持穩(wěn)定狀態(tài)。隨后測量絡(luò)合體系的紫外吸光度，這時可以觀察到體系均勻渾濁，沒有微顆粒和沉降現(xiàn)象。做吸光度-鞣酸濃度點圖，用線性擬合獲得對應(yīng)的鞣酸-蛋白體系標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1～ 3 所示，我們測試了三種蛋白、兩種濃度共6 組鞣酸-蛋白絡(luò)合體，經(jīng)過擬合后，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均在0.98 以上。結(jié)合鞣酸和蛋白絡(luò)合的原理，我們認(rèn)為該擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線可以適用于該絡(luò)合體系，并用于進(jìn)一步判斷鞣酸純度。

圖1 糜蛋白酶和鞣酸絡(luò)合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chymotrypsin-tannic acid complexation

圖2 胰蛋白酶和鞣酸絡(luò)合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of trypsin-tannic acid complexation

圖3 縮宮素和鞣酸絡(luò)合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of oxytocin-tannic acid complexation

我們選取了三種待測樣品鞣酸，新購買的鞣酸（1）和使用1、2 年后的鞣酸（2，3），按照標(biāo)曲法制備了鞣酸-蛋白絡(luò)合物，測試了在680 nm 處的紫外吸光度并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算了純度數(shù)據(jù)。如表1～ 3所示，同一種鞣酸樣品在不同的蛋白環(huán)境下計算出的純度數(shù)據(jù)相近，RSD ≤2%。說明使用蛋白絡(luò)合的方法測定鞣酸純度，不受限于應(yīng)用蛋白濃度和體系，具有良好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

表1 待測鞣酸樣品1 數(shù)據(jù)匯總Tab.1 Tannic acid 1 datas summary

表2 待測鞣酸樣品2 數(shù)據(jù)匯總Tab.2 Tannic acid 2 datas summary

表3 待測鞣酸樣品3 數(shù)據(jù)匯總Tab.3 Tannic acid 3 datas summary

為進(jìn)一步說明該方法的準(zhǔn)確性，我們使用低濃度的鞣酸樣品進(jìn)行了HPLC 測試。如圖4 為10 μg/mL 鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和積分面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于鞣酸純度的鑒定，盡管現(xiàn)有技術(shù)中并未記載以HPLC 作為鞣酸純度鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但經(jīng)該方法檢測鞣酸純度所獲得的結(jié)果仍具備可接受的準(zhǔn)確度[5]。

圖4 鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和積分面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，HPLC 方法Fig.4 Standard Tannic acid UV spectrum and integrated area-concentration standard curve with HPLC method

以相同條件檢測待測樣品1～ 3 號，并將所得積分面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)計算所得對應(yīng)數(shù)據(jù)。結(jié)合表4 與表1～ 3 中的數(shù)據(jù)分析可得，絡(luò)合體系方法所測得的數(shù)據(jù)與HPLC 所測數(shù)據(jù)相近，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表4 HPLC 方法測試待測鞣酸Tab.4 Measurement of tannic acid with HPLC method

3 總結(jié)

鞣酸和部分蛋白絡(luò)合（如胰蛋白酶、糜蛋白酶、凍干縮宮素粉末）可以形成均勻渾濁不沉降的絡(luò)合體系，該體系具備了一定的穩(wěn)定性。基于以上原理，我們設(shè)計了紫外吸收光譜法測定體系渾濁度的方法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定了不同應(yīng)用體系下的鞣酸純度。相比于直接采用紫外吸收法測定更能分辨是否發(fā)生了氧化。與常規(guī)的HPLC 方法測試結(jié)果相近。