徐梓凡,鄭昊涵,謝田華,王曉露,姚 勇

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院眼科,江蘇 無錫 214023)

非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)包括小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等,是由基因組轉(zhuǎn)錄而成的不編碼蛋白質(zhì)的RNA,被認(rèn)為在許多人類疾病的基因表達(dá)和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1]。其中,circRNA不同于經(jīng)典的線性RNA,不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾,而是通過共價鍵形成單鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[2]。早在1976年,circRNA作為類病毒首次被報道,在后來的幾十年間它們因被認(rèn)為是剪接錯誤的產(chǎn)物而被忽視,后來才被發(fā)現(xiàn)是真核生物中內(nèi)源性RNA的剪接產(chǎn)物[3]。隨著RNA高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,Hansen等[4]于2013年首次報道了環(huán)狀RNA海綿miR-7 (circular RNA sponge for miR-7,ciRS-7)通過“海綿狀”吸附miR-7發(fā)揮生物學(xué)作用。目前,研究發(fā)現(xiàn)circRNA的功能包括作為miRNA海綿[5]、與蛋白質(zhì)相互作用[6]、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和干預(yù)剪接過程[7],甚至可以翻譯產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)[8],在血管性疾病、炎癥性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[9-10]。近年來,有研究[11-12]報道,circRNA的表達(dá)變化在眼睛的組織發(fā)育和眼病的進(jìn)展中產(chǎn)生重大影響。因此,circRNA可能是眼病的診斷、治療及預(yù)后評估過程中重要的生物學(xué)標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn),其中具體的作用和分子機(jī)制,還需要更多的研究去探索。

1 circRNA的特征

circRNA是一類不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾巴,通過反向剪接機(jī)制形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性ncRNA。RNA測序技術(shù)證實(shí),circRNA在真核生物中廣泛表達(dá),在某些情況下其豐富度可能超過同源線性RNA[7,13]。circRNA的獨(dú)特環(huán)形結(jié)構(gòu)使它們比線性RNA具有更長的半衰期和更強(qiáng)的核糖核酸酶抗性,不易被降解,從而穩(wěn)定地存在于真核細(xì)胞中[14]。此外,多個研究證實(shí)circRNA還具有保守性和組織特異性,可以在許多疾病中發(fā)揮特殊的分子標(biāo)記作用[13-15]。真核生物中大多數(shù)的circRNA可以根據(jù)其組成序列的不同分為三個亞型:①外顯子circRNA(ecircRNA),由一個或多個外顯子環(huán)化而產(chǎn)生;②外顯子-內(nèi)含子circRNA(elciRNA),由保留內(nèi)含子的外顯子環(huán)化而成;③內(nèi)含子circRNA(ciRNA),僅由內(nèi)含子環(huán)化而成[16]。

2 circRNA的形成機(jī)制

circRNA的形成機(jī)制主要分為兩種模型,包括套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化。在單個基因位點(diǎn)上,兩種模型都發(fā)生選擇性剪接,可以產(chǎn)生包含不同內(nèi)含子和外顯子組合的各種circRNA[15]。

2.1 內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化模型[15-17]先進(jìn)行反向剪接生成帶有外顯子和內(nèi)含子的環(huán)形結(jié)構(gòu),然后加工生成circRNA。側(cè)翼內(nèi)含子配對由重復(fù)的側(cè)翼內(nèi)含子序列驅(qū)動,例如反向重復(fù)的Alu元件或反向互補(bǔ)匹配堿基(RCM),使剪接位點(diǎn)接近形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),然后剪掉內(nèi)含子形成circRNA[18]。此外,一些反式作用因子在circRNA的產(chǎn)生過程中也起到一定的作用,多種RNA結(jié)合蛋白(RBP)例如盲肌(MBL)、選擇性剪接因子Quaking(QKI)和RNA編輯酶腺苷酸脫氨酶(ADAR1),已被報道可以與環(huán)狀外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子中的特定靶標(biāo)結(jié)合,并通過蛋白質(zhì)之間的相互作用調(diào)控環(huán)化[7,19-20]。側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合位點(diǎn)的QKI二聚體高效表達(dá)可以促進(jìn)circRNA的產(chǎn)生[19]。與之相反,ADAR1可通過干擾RNA配對抑制circRNA的形成,從而減少circRNA的數(shù)量[20]。

2.2 套索驅(qū)動環(huán)化模型[15]首先形成典型的線性RNA,然后通過外顯子跳躍生成套索結(jié)構(gòu)。內(nèi)含子被移除后形成ciRNA,剩余的結(jié)構(gòu)通過內(nèi)剪接頭尾相連,產(chǎn)生ecircRNA或elciRNA。

3 circRNA的功能

3.1 作為miRNA的分子海綿 外顯子circRNA含有miRNA識別元件(MREs),可作為海綿吸附體競爭性結(jié)合miRNA,抑制其與mRNA結(jié)合,從而靶向基因的翻譯[4]。

3.2 與蛋白質(zhì)的相互作用 蛋白質(zhì)和circRNA之間的相互作用非常復(fù)雜,circRNA可以作為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體、誘餌或支架,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用及其活性[21]。

3.3 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯 細(xì)胞核中的circRNA可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和剪接,circRNA與RNA聚合酶Ⅱ通過特定的RNA-RNA相互作用,促進(jìn)同源基因的轉(zhuǎn)錄[22]。此外,circRNA可以通過調(diào)節(jié)基因剪接,或者通過競爭RNA結(jié)合蛋白(RBPs)來調(diào)節(jié)基因翻譯[23]。

3.4 翻譯成多肽或蛋白質(zhì) 當(dāng)circRNA序列中存在內(nèi)部核糖體啟動位點(diǎn)(IRES)時,已經(jīng)被證明可以在體內(nèi)和體外翻譯[24],也可以由N6-甲基腺苷(M6A)修飾以不依賴5’帽的方式驅(qū)動[25]。

3.5 生成假基因 與mRNAs類似,circRNA有可能被逆轉(zhuǎn)錄,并整合到宿主基因組中,以產(chǎn)生假基因,參與多種生理和病理過程中DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)[26]。

3.6 調(diào)控表觀遺傳 circRNA可以調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾,例如DNA或組蛋白甲基化[27]。

4 circRNA與眼科相關(guān)疾病

4.1 糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的主要并發(fā)癥,也是全球范圍內(nèi)視力下降、致盲的罪魁禍?zhǔn)譡28]。視網(wǎng)膜微血管功能障礙(包括視網(wǎng)膜無灌注、血管通透性增加和病理性的視網(wǎng)膜血管新生等)和神經(jīng)變性(包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙等)參與了DR的發(fā)生和發(fā)展[29]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的異常表達(dá)和其他因素,如晚期糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、活化的蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路,也被認(rèn)為是DR血管功能障礙的分子基礎(chǔ)[28]。高糖可以顯著的引起視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,增加血管滲出和黃斑水腫,促進(jìn)病理性的視網(wǎng)膜血管生成等[30]。之前的一項(xiàng)研究通過高通量circRNA微陣列分析檢測了circRNA表達(dá)譜的差異,發(fā)現(xiàn)circ-0005015在DR患者的血漿、玻璃體和視網(wǎng)膜前纖維血管膜(FVM)中顯著上調(diào)[31]。circRNA可以通過分泌在細(xì)胞外囊泡 (EVs)中或組裝成核糖核蛋白復(fù)合物,而在體液中被檢測到。研究發(fā)現(xiàn),circ-0005015充當(dāng)miR-519d-3p海綿來抑制其活性,增加基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2),X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖和遷移,參與病理性的視網(wǎng)膜血管生成[31]。在高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞和DR患者的臨床樣品中,circHIPK3和circCOL1A2的表達(dá)上調(diào),circHIPK3通過特異性吸附miR-30a-3p,激活血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)/FZD4/WNT2的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),參與了DR視網(wǎng)膜血管功能障礙的進(jìn)展[32]。與其類似,circCOL1A2通過調(diào)節(jié)miR-29b/VEGF軸,參與DR小鼠的血管生成[33]。另有研究表明,circ-0002570/miR-1243/AMOT(angiomotin)軸[34]和cZNF609/miR-615-5p/MEF2A軸以ceRNA機(jī)制調(diào)控DR的進(jìn)展[35]。在高糖環(huán)境中,作為miR-20b-5p海綿的circDNMT3B表達(dá)下調(diào),進(jìn)而下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白和激活素膜結(jié)合抑制劑(BAMBI),促進(jìn)了人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管狀形成;過表達(dá)circDNMT3B可以減少糖尿病大鼠視網(wǎng)膜無細(xì)胞毛細(xì)血管數(shù)量,減輕視力損害[36]。

視網(wǎng)膜血管中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的串?dāng)_對于血管的穩(wěn)態(tài)和重塑是至關(guān)重要的。然而,糖尿病時,周細(xì)胞的缺失,可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏、閉塞和新血管的形成。Jiang等[37]報道,CZNF532在糖尿病應(yīng)激下的周細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。與其類似,Liu 等[38]研究發(fā)現(xiàn)cPWWP2A在周細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),而在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DR時,高血糖和氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1(SP1)的表達(dá)。已證實(shí)SP1通過與cZNF532啟動子區(qū)域結(jié)合,激活cZNF532轉(zhuǎn)錄。增加的cZNF532作為海綿吸附miR-29a-3p而抑制其活性,誘導(dǎo)硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)表達(dá)增加,從而促進(jìn)周細(xì)胞增殖以及周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的募集[37]。高血糖環(huán)境下,周細(xì)胞變性還會導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞的進(jìn)行性喪失,以及脫細(xì)胞毛細(xì)血管和微動脈瘤的產(chǎn)生。CZNF532基因敲除或miR-29a-3p過表達(dá)可加重STZ誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙,增加未灌注的無細(xì)胞毛細(xì)血管和微動脈瘤的數(shù)量[37]。周細(xì)胞來源的cPWWP2A通過吸附miR-579,調(diào)節(jié)血管生成素1(Ang1)/閉合蛋白(occludin)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)通路,從而影響周細(xì)胞覆蓋率和血管完整性。此外,cPWWP2A可以以細(xì)胞外囊泡為載體,調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[38]。CPWWP2A的過表達(dá)或抑制其下游分子miR-29a-3p和miR-579,可消除糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管通透性增高和周圍細(xì)胞覆蓋率降低的影響,延緩視網(wǎng)膜血管功能紊亂的進(jìn)展[38]。

另外,最近兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)circ-0041795[39]和circ-0084043[40]在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中異常表達(dá),參與了糖尿病條件下的視網(wǎng)膜血管的功能障礙。circ-0041795作為海綿吸附miR-646,靶向VEGF-C,參與HG誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞分泌促炎因子,如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素6(IL-6)等水平的調(diào)節(jié)[39]。circ-0084043通過海綿樣吸附miR-140-3p,靶向轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα);沉默circ-0084043可以顯著降低氧化應(yīng)激的水平,降低丙二醛(MDA)的含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性,從而抑制高糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[40]。

4.2 年齡相關(guān)性黃斑變性 年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理改變的不同 AMD 分為兩型:萎縮性 AMD(非滲出型 AMD,或干性型 AMD) 與滲出型 AMD(濕性型 AMD)。RPE、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和光感受器的萎縮是萎縮性AMD的特征[41]。研究發(fā)現(xiàn),線粒體活性氧的產(chǎn)生促進(jìn)RPE的去分化,是導(dǎo)致萎縮性AMD發(fā)生發(fā)展的重要因素[42]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞胞質(zhì)中的circNR3C1含有多個miRNA結(jié)合位點(diǎn)[43]。circNR3C1可以作為海綿結(jié)合miR-382-5P,競爭內(nèi)源性RNA,靶向磷酸酶基因(PTEN)/AKT/mTOR信號通路。而沉默了circN3C1,miR-382-5P活性增強(qiáng),RPE特征性轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平降低,吞噬作用被抑制,線粒體活性氧產(chǎn)生增多,促進(jìn)了RPE超微結(jié)構(gòu)的損傷和功能障礙,進(jìn)而加劇了萎縮性AMD的疾病進(jìn)展[44]。

滲出性AMD的典型表現(xiàn)是脈絡(luò)膜的新生血管(CNV)突破Bruch膜進(jìn)入視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)或隱藏在視網(wǎng)膜下,造成視網(wǎng)膜水腫、滲出、出血等功能障礙,嚴(yán)重的還會造成視力下降。在激光誘導(dǎo)小鼠CNV脈絡(luò)膜中,CZBTB44的表達(dá)顯著上調(diào)[45]。CZBTB44作為miR-578海綿,抑制miR-578活性,導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM1)表達(dá)增加;沉默cZBTB44可以延緩激光誘導(dǎo)的CNV的進(jìn)展[45]。

4.3 角膜疾病 Wu等[46]重點(diǎn)探索了cZNF609在角膜血管新生調(diào)控中的生物學(xué)作用。角膜縫合術(shù)后角膜上皮中的cZNF609表達(dá)持續(xù)上調(diào),miR-184表達(dá)持續(xù)下調(diào)。cZNF609通過抑制miR-184的活性,促進(jìn)AKT/β-catenin/VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀形成,從而調(diào)控角膜新生血管。然而,cKifap3的作用相反,cKifap3可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力[47]。

4.4 青光眼 直接或間接改善視網(wǎng)膜神經(jīng)變性是預(yù)防、延緩和逆轉(zhuǎn)青光眼所致視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的一種很有前途的治療方法。血管和神經(jīng)是體內(nèi)兩個重要的通道,可以相互作用,通常具有共同的分化、生長調(diào)節(jié)功能[48]。之前有研究證明CZNF609參與了缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管功能障礙[35]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)變性過程中明顯增高,視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞被激活,通過釋放細(xì)胞因子、活性氧(ROS)或一氧化氮(NO)等途徑,導(dǎo)致谷氨酸受體的生物合成下降,加重神經(jīng)元損傷,造成RGC凋亡[49]。最近的兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CZNF609和CZRANB1的表達(dá)水平在青光眼引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性中顯著上調(diào),通過調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞功能,間接調(diào)節(jié)RGC功能,在視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變中起著重要作用[50-51]。CZNF609作為miR-615海綿,抑制miR-615活性,上調(diào)METRN基因表達(dá),而CZRANB1通過CZRANB1/miR-217/RUNX2組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞功能,進(jìn)而影響視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的發(fā)生發(fā)展[50-51]。沉默了CZNF609和CZRANB1可以顯著抑制視網(wǎng)膜反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生,減少M(fèi)üller細(xì)胞對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的有害影響,促進(jìn)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞在青光眼中的存活。

4.5 白內(nèi)障 晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)的凋亡和氧化損傷被報道參與了晶狀體蛋白氧化、降解、聚集和交聯(lián),是非先天性白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的共同分子基礎(chǔ)[52]。有研究報道circHIPK3的異常表達(dá)與人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡和增殖有關(guān),circHIPK3/miR-193a-3p/α-晶狀體蛋白(CRYAA)網(wǎng)絡(luò)參與了體外LECs功能的調(diào)節(jié)[53]。最新研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)circHIPK3可以顯著抑制miR-221-3p的水平,激活PI3K/AKT通路,通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激標(biāo)志物,如MDA和GSH-PX的水平,進(jìn)而減少了LECs的損傷和凋亡[54]。這些新發(fā)現(xiàn)也提供了新的線索和潛在的治療目標(biāo),以揭示年齡相關(guān)白內(nèi)障(ARC)的發(fā)病機(jī)制。另一項(xiàng)研究分析了糖尿病相關(guān)的白內(nèi)障患者晶狀體組織中差異表達(dá)的circRNA,其中circKMT2E的表達(dá)比正常組織高2倍以上,與miR-204-5p的表達(dá)趨勢相反。

5 結(jié) 語

隨著科技的發(fā)展,越來越多的研究表明了circRNA的異常表達(dá)與眼科疾病的進(jìn)展密切關(guān)系。circRNA作為一類新的內(nèi)源性lncRNA,可能在白內(nèi)障、青光眼、DR等眼部疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。circRNA在患者的血漿、房水等中可以被檢測到,可作為潛在的生物標(biāo)志物和預(yù)后評估指標(biāo);并且生物合成的circRNA有希望成為治療干預(yù)手段。然而,仍有許多未知的circRNA在眼病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的調(diào)控角色。此外,相較于miRNA和lncRNA,circRNA在眼部生物學(xué)過程中的作用及分子機(jī)制仍有許多空白,迫切需要更多的研究去探索。