枯草芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)豆類(lèi)粗多糖結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的影響

屈雅寧，許夢(mèng)粵，唐雙慶，劉 琴，陳禪友，王亞珍，王紅波,,,

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究中心，湖北武漢 430056；2.湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430056；3.湖北省健康代糖產(chǎn)品企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北武漢 430056）

豆類(lèi)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，口感良好，是人們喜食的優(yōu)質(zhì)食品資源。豆類(lèi)除含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有多糖、黃酮和皂苷等生物活性成分，使豆類(lèi)具有抗氧化、抑菌、降血糖和降血壓等功能，從而更加受到關(guān)注[1-2]。多糖的生物學(xué)功能是食品營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。YANG 等[3]分離純化了綠豆中的多糖，其表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。BAI等[4]研究了6 種豆科植物粗多糖的化學(xué)組成，結(jié)果表明較高含量的粗多糖和具有特定結(jié)構(gòu)的粗多糖對(duì)降血糖具有一定的作用。

發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的食品生物加工技術(shù)，通過(guò)微生物發(fā)酵作用能改善其風(fēng)味，也能顯著提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和生物學(xué)功能。國(guó)內(nèi)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的研究大多集中于產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味方面，目前對(duì)發(fā)酵豆制品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生新物質(zhì)的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和功能挖掘不夠。JHAN 等[5]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵能提高紅豆食品的抗氧化能力。邰佳等[6]利用枯草芽孢桿菌和纖維素降解菌混合菌種接種玉米須，固態(tài)發(fā)酵后玉米須中的總黃酮含量提高了38.89%，多糖含量提高了32.69%。目前已有研究報(bào)道大豆水溶性多糖具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等活性，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。黑豆多糖、綠豆多糖和豇豆多糖等雜豆多糖的部分結(jié)構(gòu)信息已有一些研究者解析，而關(guān)于其他雜豆類(lèi)多糖的研究偏少，且有關(guān)微生物發(fā)酵對(duì)豆類(lèi)多糖結(jié)構(gòu)影響的研究報(bào)道較少。

本研究選取了大豆、豇豆、紅豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆和菜豆8 種常見(jiàn)的食用豆子為研究對(duì)象，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方式，比較研究了8 種豆子發(fā)酵前后粗多糖的化學(xué)組成、分子量分布、紅外光譜結(jié)構(gòu)以及抗氧化活性能力的變化，為發(fā)酵豆類(lèi)功能食品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆（MD-065，自選材料）、豇豆（鄂豇豆7 號(hào)）、紅豆（紅珍珠）、綠豆（綠寶石）、扁豆（德扁3 號(hào)）、豌豆（漢豌1 號(hào)）、蠶豆（CD-035，自選材料）、菜豆（SJ-0052，自選材料） 均由湖北省食用豆類(lèi)植物自然科技資源中心提供；菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilissubsp.Subtilis，ATCC 6051） 保藏于湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心；LB 培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制（蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，蒸餾水100 mL，瓊脂2 g）；2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪（2,4,6-Tri （2-pyridine）-1,3,5-triazine，TPTZ） 索萊寶公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-Azinobis-3-ethylbanzthiazo-line-6-sulfonate，ABTS）、鐵離子還原能力工作液（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP） 麥克林公司；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffered saline，PBS）、葡萄糖、蒽酮乙酸乙酯、半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯、四硼酸鈉/硫酸、右旋糖酐等試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1515 高效液相色譜儀 美國(guó)Waters；OHpak SB-803 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-805 HQ聚合物基質(zhì)水溶性SEC（GFC）色譜柱 日本Shodex；FA124C 分析天平 上海力辰科技；TGL-16A 離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器；NICOLET iS50R 傅里葉變換顯微紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Scientific；JP-020 超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SMF01 磨粉機(jī) 蘇泊爾電器公司；FreeZone 6 Plus 冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO 公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化與擴(kuò)大培養(yǎng) 將枯草芽孢桿菌劃線接種至LB 培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)2 d，挑取枯草芽孢桿菌單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，得到種子液。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵與冷凍干燥 參考LI 等[7]和BJMA等[8]的實(shí)驗(yàn)方法。將8 種豆子用磨粉機(jī)磨碎（直徑小于1 mm），分別稱取12 g 置于錐形瓶?jī)?nèi)，121 ℃滅菌15 min，冷卻，以5%接種量將菌株種子液接種于豆粉，置于37 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵樣品置于冷凍干燥機(jī)，真空度0.040 MBar，溫度-85 ℃，冷凍干燥12 h，將凍干后的發(fā)酵樣品于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 粗多糖的提取

1.2.3.1 樣品脫脂 參考李安琪等[9]的方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。將未發(fā)酵和發(fā)酵后豆粉，分別取6 g 于燒杯，按料液比1:10（g/mL）加入95%的乙醇，室溫?fù)u床震蕩6 h，6000 r/min 離心10 min，收集沉淀，于60 ℃烘箱烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 粗多糖提取 取脫脂后豆粉，按料液比1:20（g/mL）添加蒸餾水，95 ℃條件下提取6 h，6000 r/min 離心10 min，收集上清液。

1.2.3.3 粗多糖除蛋白 多糖提取上清液中加入等體積3% TCA 溶液于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜[10-11]，8000 r/min 離心10 min 除去蛋白質(zhì)，取上清液。在上清液中加入等體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥得粗多糖。

1.2.3.4 粗多糖得率的計(jì)算 稱量冷凍干燥后的粗多糖，按以下公式計(jì)算發(fā)酵前和發(fā)酵后豆粉粗多糖的得率。

1.2.4 粗多糖組成測(cè)定

1.2.4.1 總糖含量測(cè)定 參考劉藝珠等[12]的方法，量取標(biāo)準(zhǔn)（0.1 mg/mL）葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL，加入蒽酮乙酸乙酯0.5 mL，再加入5 mL 濃硫酸，沸水浴5 min 后冷卻，在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），吸光值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程y=3.8829x+0.0494，R2=0.9992。取樣品20 mg 溶于40 mL 水中配成0.5 mg/mL 的樣品溶液，記錄吸光度，計(jì)算總糖的含量（%）。

式中，C 為樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；V 為樣品定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4.2 糖醛酸含量測(cè)定 以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯比色法[13]測(cè)定各粗多糖樣品中糖醛酸含量。取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 定容至10 mL，取1 mL 該定容溶液，冰水浴，緩慢加入四硼酸鈉/硫酸溶液6 mL，渦旋混勻，沸水浴5 min 后冷卻，加0.1 mL 間羥基聯(lián)苯溶液，充分混勻振蕩5 min，超聲處理除氣泡，在200～800 nm 波長(zhǎng)內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，以糖醛酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=2.6536x+0.072，R2=0.9918。分別取樣品20 mg，用蒸餾水配制成濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液。取樣品溶液1 mL，后續(xù)同上述操作，計(jì)算糖醛酸含量（%）。

式中，C 為樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為樣品定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品[14]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各豆粉粗多糖樣品中的蛋白質(zhì)含量，記錄各反應(yīng)液在595 nm 波長(zhǎng)下的吸光值，以蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=2.4714x+0.2221，R2=0.994。取樣品20 mg 溶于40 mL 水中配成0.5 mg/mL的樣品溶液，后續(xù)操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量（%）。

式中，C 為樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；V 為樣品定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.5 分子量分布測(cè)定 稱量不同分子量的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品，使用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）串聯(lián)柱來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，得校正曲線。稱取樣品5 mg，向樣品中加入0.05 mol/L NaCl 溶液1 mL，配制成5 mg/mL供試樣品溶液，8000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于2 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行多糖分子量分布檢測(cè)[15]。色譜條件：色譜柱：聚合物基質(zhì)水溶性SEC（GFC）色譜柱（8×300 mm）3 根串聯(lián)；流動(dòng)相：0.05 mol/L NaCl 溶液；流速：0.65 mL/min；柱溫：40 °C；進(jìn)樣量：30 μL。

1.2.6 紅外光譜分析 稱取各干燥的粗多糖樣品1～2 mg 于在研缽中，分別加入KBr 粉末200 mg 研磨均勻，壓片，使用傅里葉變換顯微紅外光譜儀掃描樣品，波數(shù)范圍4000～400 cm-1，繪制紅外光譜圖[16]。

1.2.7 粗多糖抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 參考辛玥等[17]的DPPH 測(cè)定方法。制備0.1 mmol/L DPPH 溶液，分別取0.2 mL 粗多糖樣品溶液和0.2 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液混合均勻，避光反應(yīng)30 min 后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光值，結(jié)果按公式（5）計(jì)算DPPH 自由基清除率：

式中：A0為0.2 mL H2O 加0.2 mL DPPH 的吸光度；A1為0.2 mL 樣品溶液加0.2 mL 50%乙醇的吸光度；A2為0.2 mL 樣品溶液加0.2 mL DPPH 的吸光度。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除活性測(cè)定 將7.4 mol/L ABTS 溶液和3.8 mmol/L 硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應(yīng)12 h 得到母液。在734 nm 下將母液用PBS（pH7.4）緩沖溶液調(diào)整吸光度到0.70±0.02，得到反應(yīng)溶液[18]。將25 μL 粗多糖樣品溶液和250 μL的反應(yīng)溶液混勻，靜置15 min，用酶標(biāo)儀在734 nm下測(cè)量吸光值。結(jié)果按公式（6）計(jì)算ABTS+自由基清除率：

式中：A0為25 μL H2O 加250 μL 反應(yīng)液的吸光度；A1為25 μL 樣品溶液加250 μL PBS 緩沖液的吸光度；A2為25 μL 樣品溶液加250 μL 反應(yīng)液的吸光度。

1.2.7.3 鐵離子還原能力測(cè)定（FRAP） 將300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.5）、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L 氯化鐵溶液以10:1:1 體積混合，制成FRAP 工作液。取900 μL FRAP 工作液與100 μL 粗多糖樣品溶液混合，于37 ℃下反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀在595 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[19]。相同條件下以FeSO4為參照標(biāo)準(zhǔn)，作濃度變化曲線。計(jì)算粗多糖樣品的鐵離子還原能力（μmol/L）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定三次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。運(yùn)用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，采用SPSS （version 27.0）進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表明具有顯著性差異。GrapPad 軟件計(jì)算IC50值，Origin Pro 2021 繪制相關(guān)數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后豆類(lèi)中粗多糖得率與組成比較分析

發(fā)酵前后8 種豆粉粗多糖組分變化見(jiàn)表1。未發(fā)酵豆粉粗多糖得率顯著高于發(fā)酵后豆粉（P＜0.05），由于豆子中蛋白質(zhì)含量較高（蛋白質(zhì)含量40%左右）[20]，三氯乙酸（TCA）未將蛋白質(zhì)除盡，未發(fā)酵豆粉粗多糖中含有少量蛋白質(zhì)。未發(fā)酵豆粉粗多糖總糖含量在3.35%～35.63%之間，發(fā)酵后豆粉粗多糖中總糖含量在16.61%～77.11%之間。發(fā)酵后豆粉粗多糖的總糖含量顯著增加（P＜0.05），且蠶豆和豇豆增加最顯著（P＜0.05），分別提高至58.84%和77.11%。發(fā)酵后豆粉粗多糖中蛋白質(zhì)被除盡，提高了多糖的純度。未發(fā)酵的蠶豆、綠豆、紅豆和豇豆粗多糖中含有少量的糖醛酸，發(fā)酵后8 種豆粉粗多糖中的糖醛酸含量均增加，且豌豆增加最顯著（P＜0.05），糖醛酸含量達(dá)16.63%。TCA 方法脫蛋白處理對(duì)提高粗多糖中多糖含量具有顯著的效果[21]，豆粉發(fā)酵過(guò)程中，微生物消耗了豆粉中的部分蛋白質(zhì)，使得發(fā)酵后的豆粉粗多糖樣品均未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)，微生物發(fā)酵聯(lián)合TCA 處理是去除豆粉粗多糖中蛋白質(zhì)的理想方法。胡彥波等[22]研究結(jié)果表明樣品中少量蛋白質(zhì)對(duì)后續(xù)粗多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響，因此，粗多糖樣品無(wú)需進(jìn)一步的脫蛋白處理。本研究結(jié)果表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵能顯著提高豆粉粗多糖的純度、增加粗多糖中糖醛酸的含量。豆粉中含有纖維素，纖維素的細(xì)胞壁被枯草芽孢桿菌的酶系代謝，促進(jìn)了多糖的釋放[6]。因此，經(jīng)微生物發(fā)酵后豆粉粗多糖的含量均有提高。

表1 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖得率與組成比較分析Table 1 Comparison and analysis of the yield and composition of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

2.2 發(fā)酵前后豆類(lèi)中粗多糖分子量比較分析

采用HPGPC 法比較分析8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖的分子量，研究結(jié)果如圖1 所示。發(fā)酵前大豆、豇豆、紅豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆和菜豆均出現(xiàn)1 個(gè)明顯的特征吸收峰，其分子量分別為0.45、6.10、4.80、14.80、4.17、1.80、4.14 和2.25 kDa；而發(fā)酵后豆粉粗多糖特征峰分子量分別為45.39、43.60、30.90、28.10、18.00、56.56、40.60 和36.85 kDa。結(jié)果表明豆粉粗多糖分子量分布不均一，且發(fā)酵后粗多糖分子量均增加。粗多糖分子量增加可能是由于多糖分子中含有大量的羥基，羥基伸縮振動(dòng)，分子間作用力相互聚集，尤其是酸性多糖容易形成不同程度的聚集體，導(dǎo)致多糖分子量增加[23]；也可能是由于枯草芽孢桿菌分泌的多糖聚合酶將小分子多糖酶促聚合生成大分子的多糖化合物[24]。通過(guò)微生物發(fā)酵后大豆粗多糖特征分子量明顯，從0.45 kDa 增加到45.39 kDa。由于粗多糖分子量的差異，會(huì)使其具有不同的生物活性[11]。因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵增加了豆粉粗多糖的分子量，枯草芽孢桿菌發(fā)酵或許是制備新的豆類(lèi)多糖的理想方法。

圖1 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖的分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

2.3 發(fā)酵前后豆類(lèi)中粗多糖紅外光譜比較分析

8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖的紅外光譜分布如圖2 所示。發(fā)酵前后豆粉粗多糖在3426 cm-1附近均具有一個(gè)強(qiáng)且寬的特征吸收峰，這是由于-OH 官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的，表明糖類(lèi)分子形成分子內(nèi)氫鍵[25]。發(fā)酵前和發(fā)酵后8 種豆粉粗多糖在2925 和2932 cm-1之間都有特征峰，并以小肩峰的形式存在，這是糖類(lèi)C-H 伸縮振動(dòng)的特征峰[1]。大部分羰基吸收集中1900～1650 cm-1，通常為譜圖的最強(qiáng)峰或次強(qiáng)峰，為C=O 官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)，未發(fā)酵豆和發(fā)酵豆粗多糖都含有此特征峰，發(fā)酵前大豆和豌豆只含有一個(gè)C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰，其余豆粉粗多糖含有兩個(gè)C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰。表明粗多糖樣品中可能存在不同種類(lèi)的糖醛酸[26]。1640 cm-1是蛋白質(zhì)的特征紅外吸收峰[27]，所有豆粉粗多糖樣品在1640 cm-1附近都未出現(xiàn)強(qiáng)烈的吸收峰，表明豆粉樣品用TCA 去除蛋白效果明顯。在1500～600 cm-1區(qū)域主要提供C-H 彎曲振動(dòng)的信息[28]。扁豆、扁豆-F、蠶豆、蠶豆-F、豇豆、豇豆-F、紅豆、紅豆-F、菜豆、綠豆、綠豆-F 和豌豆粗多糖在 763 和 931 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，表明粗多糖中可能存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[29]。此外，840 cm-1附近的峰值表明粗多糖樣品中包含α-構(gòu)型[30]，即具有α-糖苷鍵，這種豆子粗多糖可能是α-吡喃葡萄糖[31]。發(fā)酵前后豆子粗多糖中均含有α-糖苷鍵。紅外光譜圖結(jié)果分析表明，8 種豆類(lèi)發(fā)酵前后提取物粗多糖均符合多糖分子的結(jié)構(gòu)特征。

圖2 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖紅外光譜分布Fig.2 IR spectral distribution of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

2.4 發(fā)酵前后豆類(lèi)中粗多糖抗氧化活性比較分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力比較分析結(jié)果如圖3 所示。研究結(jié)果表明，增加8 種豆粉粗多糖的濃度，DPPH 自由基清除能力均增加，但清除能力均小于Vc。由粗多糖溶液對(duì)DPPH 自由基的清除曲線經(jīng)回歸處理可求出DPPH 自由基的半清除率（Half aximal inhibitory concentration，IC50），IC50值見(jiàn)表2。除蠶豆外，未發(fā)酵豆粉粗多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力均顯著優(yōu)于發(fā)酵后豆粉粗多糖（P＜0.05），這可能與未發(fā)酵豆粉中含蛋白質(zhì)有關(guān)。SIU 等[32]從三種可食用蘑菇中提取了不同蛋白含量的多糖，結(jié)果表明多糖抗氧化活性和其蛋白質(zhì)含量具有顯著相關(guān)性。發(fā)酵后豆子粗多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力降低可能是由于發(fā)酵使多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，失去了粗多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而降低了抗氧化活性。IC50值顯著性分析見(jiàn)表2，發(fā)酵前和發(fā)酵后的豆粉粗多糖清除DPPH 自由基能力差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵后的大豆、紅豆、蠶豆、豌豆和豇豆對(duì)DPPH 清除率效果較好，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率均超過(guò)50%。發(fā)酵后綠豆粗多糖的清除效果較低，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，清除率未達(dá)到50%。

圖3 發(fā)酵前后8 種豆粉粗多糖DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging capacity of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

表2 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖抗氧化活性顯著性分析Table 2 Significance analysis of antioxidant activity of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

2.4.2 ABTS+自由基清除能力 8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力的結(jié)果如圖4 所示。研究結(jié)果表明，增加8 種豆粉粗多糖濃度，ABTS+自由基清除率能力均增加。發(fā)酵前后豆粉粗多糖對(duì)ABTS+自由基的半清除率的IC50值見(jiàn)表2。發(fā)酵前后豆粉粗多糖對(duì)ABTS+自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。其中豇豆、紅豆、綠豆、扁豆、蠶豆和菜豆發(fā)酵后豆粉粗多糖對(duì)ABTS+自由基清除率均比發(fā)酵前顯著增加。文愉熙等研究報(bào)道，多糖的活性還與糖苷鍵、空間構(gòu)象等有密切關(guān)系[33]，在豆粉粗多糖紅外檢測(cè)中，發(fā)酵前大豆和豌豆在C=O 官能團(tuán)伸縮振動(dòng)上與其它豆粉粗多糖有差異，可能對(duì)ABTS+自由基清除能力有影響。多糖分子結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制也會(huì)影響到多糖的抗氧化活性[34]。當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，發(fā)酵后大豆、蠶豆、紅豆、豌豆和菜豆對(duì)ABTS+自由基清除率超過(guò)50%，清除效果較好。發(fā)酵后綠豆粗多糖清除效果不佳，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)55.70%。

圖4 發(fā)酵前后8 種豆粉粗多糖ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+ radical scavenging ability of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

2.4.3 鐵離子還原能力（FRAP） FRAP 法可作為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)[35]。8 種豆粉發(fā)酵前后粗多糖對(duì)鐵離子還原能力結(jié)果如圖5 所示。研究結(jié)果表明，隨著粗多糖質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵前后豆粉粗多糖對(duì)鐵離子的還原能力均隨濃度增加而增加。發(fā)酵過(guò)程能提高豆粉粗多糖對(duì)鐵離子的還原能力。如表2 所示，當(dāng)粗多糖樣品濃度達(dá)4 mg/mL 時(shí)，發(fā)酵后豆粉粗多糖比未發(fā)酵豆粉粗多糖對(duì)鐵離子還原能力均顯著增加（P＜0.05）。

圖5 發(fā)酵前后8 種豆粉粗多糖鐵離子還原能力Fig.5 Iron ion reducing ability of eight kinds of legume crude polysaccharides before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究用枯草芽孢桿菌ATCC 6051 固態(tài)發(fā)酵了大豆、豇豆、紅豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆和菜豆8 種不同的豆粉，比較分析了發(fā)酵前后8 種豆粉粗多糖的分子結(jié)構(gòu)和抗氧化生物活性的變化。通過(guò)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后制備得到的豆粉粗多糖分子量均增加、粗多糖分子中糖醛酸含量也不同程度的提高。發(fā)酵豆粉粗多糖與未發(fā)酵豆粉粗多糖表現(xiàn)出不同的抗氧化生物活性。除蠶豆外，發(fā)酵后的其它豆粉粗多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力均降低；發(fā)酵后的大豆、紅豆、蠶豆、豌豆和豇豆對(duì)DPPH 自由基清除率較好，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，清除率均超過(guò)50%。發(fā)酵后的豇豆、紅豆、綠豆、扁豆、蠶豆和菜豆粗多糖對(duì)ABTS+自由基清除率均增加。發(fā)酵后的豆粉粗多糖對(duì)鐵離子還原能力均優(yōu)于未發(fā)酵的豆粉粗多糖。綜上，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后可獲得具有較強(qiáng)抗氧化活性的生物活性多糖，通過(guò)發(fā)酵前后豆類(lèi)多糖的對(duì)比研究，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵后豆類(lèi)多糖的實(shí)際應(yīng)用研究提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步的應(yīng)用研究及今后開(kāi)發(fā)枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備具有新型生物學(xué)功能的豆類(lèi)多糖分子提供了新思路，后續(xù)還需對(duì)發(fā)酵前后豆類(lèi)粗多糖的具體功能展開(kāi)進(jìn)一步研究。