吳娟　曾旭諾　葉利利

摘要 研究了黑米色素提取最佳工藝參數(shù)及抗氧化性能，結(jié)果顯示：在對(duì)黑米色素進(jìn)行提取的過(guò)程中，當(dāng)料液比達(dá)到1∶6，提取30 min時(shí)，提取效果最好。黑米色素對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子、羥基自由基都有一定清除能力，為黑米色素在食品和生物醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 黑米色素；提取工藝；色素提取率；抗氧化性能；自由基

中圖分類號(hào) TS 201.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2023）15-0147-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.036

Study on Antioxidant Activity of Black Rice Pigment

WU Juan， ZENG Xu-nuo， YE Li-li

（School of Life Sciences， Anqing Normal University， Anqing， Anhui 246133）

Abstract The best technological parameters and antioxidant properties of black rice pigment were studied. The results showed that in the process of extracting black rice pigment， when the solid-liquid ratio reached 1∶6 and the extraction duration was about 30 min， the extraction effect could reach the best. Black rice pigment can scavenge DPPH radical， superoxide anion and hydroxyl radical， which provides a theoretical basis for the wide application and research of black rice pigment in food， biomedicine and other fields.

Key words Black rice pigment;Extraction process;Pigment extraction rate;Oxidation resistance;Free radical

黑米（Nigrum rice）是由禾本科植物稻谷經(jīng)長(zhǎng)期培育形成的一類藥食兼用的大米?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)黑米具有益氣補(bǔ)腎、健脾益肝、養(yǎng)精蓄銳的功效，可改善視力及促進(jìn)血液循環(huán)［1］。黑米色素屬于黃酮花色素苷類，主要來(lái)源于黑紫色稻谷種皮中，主要成分包括甲基花青定葡萄糖苷（13%）、花青定-3-鼠李葡萄糖苷、花青定-3-葡萄糖苷（75%）等。它們大部分都是以與其他糖類相互結(jié)合的形式存在，其主要性質(zhì)之一是可溶于純水，呈淡紅色或紫色，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及美妝等行業(yè)［2］。黑米色素在苷類分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，因此具有特殊的抗氧化性能。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，正是由于這些酚羥基可以與暫存性自由基結(jié)合，生成穩(wěn)定的自由基，螯合啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化的金屬離子，參與抗氧化的協(xié)同作用，通過(guò)終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，螯合金屬離子，清除活性氧，從而減少自由基對(duì)人體的侵害作用［3-4］。

近些年，黑米色素逐漸進(jìn)入人們的視野，不僅色素提取工藝越來(lái)越精湛，還對(duì)于黑米色素功效的研究也逐漸深入，特別是對(duì)其抗氧化方面的研究較多。據(jù)孫玲等［5］對(duì)黑米色素的研究發(fā)現(xiàn)，黑米色素在體外模擬試驗(yàn)中證明其對(duì)人體也有一定的功效。試驗(yàn)證明，黑米色素對(duì)自由基的去除能力與其濃度成正比，即濃度越高，在體外對(duì)自由基的去除能力越強(qiáng)。張名位等［6］研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷對(duì)人體的肝臟有一定影響。通過(guò)對(duì)黑米花色苷在體內(nèi)的研究證明，在攝入黑米花色苷后，肝臟的抗氧化能力有所增強(qiáng)，身體內(nèi)部分過(guò)氧化氫物分解酶的活力也得到了提高。李新華等［7］研究發(fā)現(xiàn)，黑米色素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子均具有很好的去除效果，還將其與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑VC進(jìn)行了系統(tǒng)的對(duì)比。王巧娥等［8］運(yùn)用純化植物的方法進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)黑米花色苷在植物不同部位純化提取其抗氧化活性不同，可溶于水部分的黑米花色苷的抗氧化活性高于其他部分。以上研究都證實(shí)了黑米色素具有較良好的抗氧化性，可以作為較理想的氧化劑材料應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［9］。

從黑米中提取出的黑米色素不僅對(duì)人體安全無(wú)害，還具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在藥理上也有很大作用，對(duì)人體健康也起到較大作用。由于黑米色素對(duì)人體的安全特性，被廣泛應(yīng)用于食品方面。黑米色素能夠運(yùn)用于食品防腐，從而代替一些化工合成的化學(xué)防腐劑，也可運(yùn)用于食品和飲品的染色，代替一些化學(xué)食品染色劑［10］。黑米色素的資源豐富，而且具有天然健康的特性，符合現(xiàn)代人們對(duì)食品健康的期待，在食品方面有較強(qiáng)的運(yùn)用前景。筆者研究了黑米色素的提取工藝及黑米色素抗氧化性能，以期為開(kāi)發(fā)利用具有抗氧化性能的黑米天然食用色素提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料為市售膳食黑米，提取試劑為無(wú)水乙醇與乙酸。分析試劑為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑VC、Tris-HCl、鄰苯三酚、DPPH、無(wú)水乙醇、1，10-菲啰啉、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、搗碎機(jī)、分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平、水浴鍋等。

1.2 黑米色素提取方法

先將黑米粉碎后過(guò)50目篩得到干粉狀黑米粉，將得到的黑米粉放置于棕色試劑瓶中避光保存，然后將浸提劑無(wú)水乙醇與干粉狀黑米粉按照比例混合，并在水浴鍋中浸提一段時(shí)間后取出上清液于4 ℃4 000 r/min離心將雜質(zhì)沉淀，經(jīng)減壓過(guò)濾得到色素的浸提液，將其進(jìn)行濃縮除去浸提液，得到黑米色素濃縮液，冷藏避光保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

料液比對(duì)黑米色素提取率的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)：黑米粉10? g，按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12料液比加入無(wú)水乙醇，在水浴中浸提一定時(shí)間后測(cè)定吸光值。

提取時(shí)間對(duì)黑米色素提取率的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)：黑米粉10 g，按照一定料液比加入無(wú)水乙醇，在30 ℃水浴中分別連續(xù)浸提10、20、30、40、50、60 min后再測(cè)定吸光值。

1.4 抗氧化性測(cè)定

1.4.1 黑米色素DPPH自由基清除能力測(cè)定。

先測(cè)定2 mL DPPH的無(wú)水乙醇溶液在517 nm處的吸光值（A1），再加入2 mL不同濃度梯度的待測(cè)黑米色素溶液，混合均勻。放置于避光環(huán)境反應(yīng)30 min，再于517 nm處測(cè)其吸光值，所得數(shù)據(jù)即可作為樣品的吸光值（A2）。將2 mL蒸餾水代替上述試驗(yàn)操作中的黑米色素樣品，重復(fù)上述操作，即可得到空白吸光度值（A0）。將標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑VC的清除能力作為對(duì)照，進(jìn)行相同的試驗(yàn)操作。待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的抑制率按下式計(jì)算：

清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.4.2 黑米色素超氧陰離子清除能力測(cè)定。

在25 ℃恒溫水浴鍋中，將4 mL 0.05 mol/L、pH為8.2、預(yù)熱20 min的Tris-HCl緩沖液加入10 mL比色管中，加入25 ℃預(yù)熱20 min 1 mL蒸餾水作為空白對(duì)照組，再加入1 mL 25 ℃預(yù)熱20 min的0.2 mmol/L鄰苯三酚溶液（鄰苯三酚用0.05 mol/L鹽酸配制），并迅速地?fù)u勻，于25 ℃ 325 nm吸光值下每隔30 s測(cè)定1次。鄰苯三酚自氧化反應(yīng)4 min后，加2滴濃度為8 mol/L鹽酸混勻，使其完全終止氧化反應(yīng)，測(cè)得吸光值（A0）。接著分別用1 mL不同濃度梯度的黑米色素待測(cè)樣品代替蒸餾水，測(cè)得吸光值為A1，以標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑VC作為對(duì)照，重復(fù)上述操作測(cè)得吸光值。待測(cè)樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率按下式計(jì)算：

清除率=（A0-A1）/A0×100%

1.4.3 黑米色素羥基自由基清除能力測(cè)定。

向含有試管塞的試管中倒入1 mL硫酸亞鐵溶液與2 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，充分混合均勻，然后依次加入1 mL 1，10-菲啰啉與1 mL 0.01%過(guò)氧化氫溶液，于37 ℃水浴60 min后在536 nm處檢測(cè)吸光值，為損傷的吸光度（A損）。以1 mL不同濃度梯度的黑米色素待測(cè)樣品代替上一試驗(yàn)操作中的過(guò)氧化氫，重復(fù)操作，可分別得到不同樣品管的吸光度（A樣）。除此之外，做空白對(duì)照組，將1 mL蒸餾水代替上述操作過(guò)程中的黑米色素待測(cè)樣品，重復(fù)上述試驗(yàn)操作，可得到未損傷的吸光度（A未）。通過(guò)下式計(jì)算抑制率：

清除率=（A樣-A損）/（A未-A損）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米色素提取工藝

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響。

由圖1可見(jiàn)，黑米色素的提取過(guò)程中，料液比的不同，會(huì)影響到提取物最終的濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)料液比逐漸升高時(shí)，黑米色素的提取率也隨之升高，但是當(dāng)料液比升高到一定程度時(shí)，提取率反而降低。這可能是由于當(dāng)料液比逐漸增大時(shí)，由于提取溶液內(nèi)不同分子之間有濃度差，因此產(chǎn)物分子擴(kuò)散較快，進(jìn)而提取率也就會(huì)隨之升高；但是當(dāng)料液比增大到一定程度時(shí)，由于提取溶液內(nèi)不同分子之間的濃度差變小，提取率趨于平衡，從而導(dǎo)致濃度不再增加甚至減小。試驗(yàn)中，當(dāng)料液比達(dá)到1∶6時(shí)，提取效果最佳。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

在原料中提取目標(biāo)產(chǎn)物的過(guò)程中，有效目標(biāo)成分的高低和析出伴隨著提取持續(xù)時(shí)間的移長(zhǎng)而逐漸增大，直至原料中溶解產(chǎn)物的有效目標(biāo)產(chǎn)物濃度達(dá)到平衡值，因此沒(méi)有必要無(wú)限度地延長(zhǎng)提取時(shí)間。圖2顯示，在原料浸提時(shí)間10～30 min時(shí)，浸提時(shí)間越長(zhǎng)，黑米色素的吸光值越大，黑米色素的提取率也越大，但30 min后的吸光值反而下降，這可能是由于原料浸提的時(shí)間持續(xù)過(guò)長(zhǎng)致使體系溫度升高，從而直接導(dǎo)致黑米色素受到嚴(yán)重破壞，并且還會(huì)大大地增加生產(chǎn)成本。因此，建議選擇30 min為最佳浸提時(shí)間。

2.2 黑米色素提取物DPPH自由基清除能力

該試驗(yàn)得出，黑米色素對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力，并將其與抗氧化劑VC的清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見(jiàn)，黑米色素和VC對(duì)于DPPH自由基均具有不同程度的分解和清除功效，且隨著濃度的增大，它們的清除能力也隨之增強(qiáng)。在所選添加量范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率與黑米色素添加量呈正相關(guān)，隨著黑米色素中主要成分花色苷的濃度增加，清除率能達(dá)到70%以上。

2.3 黑米色素提取物超氧陰離子清除能力

為了準(zhǔn)確判斷新型酚類黑米色素中超氧陰離子的氧化清除能力和抑制作用能力，將其與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑VC對(duì)酚類鄰苯三酚的自由基氧化降解反應(yīng)產(chǎn)生的一種超氧陰性離子清除抑制能力進(jìn)行比較。

由圖4可知，黑米色素提取物與VC對(duì)超氧陰離子均具有不同程度的分解和抑制作用，并且當(dāng)它們處于試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)時(shí)，它們的抑制性功效是隨著試驗(yàn)濃度的提高而逐漸增大，但黑米色素與VC相比，對(duì)超氧陰離子的凈化能力相對(duì)較弱。

2.4 黑米色素提取物羥基自由基清除能力

羥基自由基是一種重要的化學(xué)活性氧，其物理化學(xué)結(jié)構(gòu)特征活潑，是通過(guò)引發(fā)不飽和脂肪酸而直接產(chǎn)生對(duì)飽和脂質(zhì)的一種過(guò)氧化活性反應(yīng)，它具有損傷膜和多種生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的能力。其氧化性是由于氫氧根在結(jié)構(gòu)中失去1個(gè)負(fù)價(jià)電子而形成。當(dāng)其中加入羥基自由基清除劑時(shí)，孤電子與其配對(duì)，吸收性就會(huì)消失或衰減。

由圖5可知，黑米色素提取物與VC相比，在一定濃度范圍內(nèi)較弱，但當(dāng)濃度達(dá)到一定高度時(shí)，黑米色素的羥基清除能力反而高于VC。由圖5可知，在濃度為0～<0.30 mg/mL時(shí)，VC對(duì)羥基自由基的清除率大于黑米色素，因此低劑量的情況下，VC對(duì)羥基的抗氧化能力較強(qiáng)；當(dāng)濃度為0.30～0.50 mg/mL時(shí)，隨著濃度增大，黑米色素對(duì)羥基自由基清除率大于VC；當(dāng)達(dá)到50%清除率時(shí)所需黑米色素濃度為0.25 mg/mL，而VC所需濃度為0.20 mg/mL，很明顯VC在該條件下對(duì)羥基抗氧化能力較強(qiáng)。當(dāng)黑米色素濃度達(dá)到0.40 mg/mL以上，由于大部分羥基自由基在反應(yīng)中被消除，因此羥基自由基清除率變化不大。

3 討論

黑米色素屬于花色苷類，極易溶于乙醇等極性較大的溶劑，卻難以直接溶于極性低或非極性的溶劑，因此可通過(guò)乙醇萃取法來(lái)提取該色素。黑米色素的提取工藝中重要影響因素最佳參數(shù)為料液比1∶6，提取時(shí)間為30 min，但根據(jù)原料和其他條件可作適當(dāng)調(diào)整。

我國(guó)由于擁有豐富的黑米資源，黑米的生產(chǎn)、加工、利用具有廣闊的發(fā)展前景，而且黑米色素具有很強(qiáng)的人體生理學(xué)功能，是一種被廣泛應(yīng)用于眾多行業(yè)領(lǐng)域的理想天然材料，食品與生物醫(yī)藥等行業(yè)對(duì)于黑米色素的要求也越來(lái)越高，使得有色稻米產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有更加廣闊的市場(chǎng)前景。

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基金項(xiàng)目 安徽省教育廳高校教師自然科學(xué)研究項(xiàng)目“有色稻籽粒顏色遺傳分析與功能性分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)”（KJ2018A0356）。

作者簡(jiǎn)介 吳娟（1980—），女，安徽壽縣人，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事作物遺傳育種研究。

收稿日期 2022-07-22