于冬燕 陳剛浩 蘇權(quán) 李意婷 覃向生 陳潔 甘珍翠 陳志成

液相色譜法（Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱LC）是一種基于物質(zhì)在液相內(nèi)分配和吸附的原理進(jìn)行分離和分析的技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、分離效果好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足乳制品質(zhì)量監(jiān)控和安全性評(píng)估的需求。因此，液相色譜法在乳制品行業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)于提高產(chǎn)品質(zhì)量和保障消費(fèi)者健康都具有重要意義。

一、液相色譜法的原理

在液相色譜法中，樣品首先通過(guò)進(jìn)樣器被引入高效液相色譜柱，柱內(nèi)充滿了固定相，可以是吸附劑、離子交換劑或者凝膠劑等。液相在固定相上流動(dòng)時(shí)，不同成分會(huì)因?yàn)樵谝苿?dòng)相和固定相之間的相互作用力不同而發(fā)生分離，這些相互作用力包括吸附、分配、離子交換和凝膠層析等，流經(jīng)柱的移動(dòng)相可以是液體或氣體。移動(dòng)相中溶解有待分析的組分，在流動(dòng)過(guò)程中，樣品內(nèi)的物質(zhì)將被分離開(kāi)來(lái)。分離完成后，分離出的化學(xué)物質(zhì)將被傳送至檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，檢測(cè)器包括紫外可見(jiàn)光譜檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和峰面積，可以得到物質(zhì)含量的定量結(jié)果。

二、乳制品中常見(jiàn)成分的液相色譜分析

1.蛋白質(zhì)分析。蛋白質(zhì)的含量和種類對(duì)于產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有著重要影響，液相色譜法在蛋白質(zhì)分析中具有高分辨率、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)分析方法包括離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和親和色譜等。其中，離子交換色譜是通過(guò)樣品中蛋白質(zhì)與帶電的固定相之間的離子交換作用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和溶液pH值的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)之間的分離；凝膠過(guò)濾色譜是利用不同大小的分子來(lái)分離蛋白質(zhì)，大分子蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)色譜柱的孔隙而被保留，小分子溶質(zhì)則可順利通過(guò)；親和色譜是利用蛋白質(zhì)與特定親和配體之間的特異性相互作用來(lái)進(jìn)行分離，比如利用抗體與抗原的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

2.糖類分析。糖類是乳制品中的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，液相色譜法在糖類分析中具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢(shì)，常用的糖類分析方法包括離子交換色譜、親和色譜和毛細(xì)管電泳等。其中，離子交換色譜在糖類分析中得到廣泛應(yīng)用，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH和流動(dòng)相中的離子濃度來(lái)控制糖類在固定相上的吸附和洗脫過(guò)程，實(shí)現(xiàn)糖類的分離和檢測(cè)；親和色譜是利用特定親和配體與糖類之間的結(jié)合作用來(lái)進(jìn)行分離，比如通過(guò)蛋白質(zhì)固定相與半乳糖苷酶結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)半乳糖的分離；毛細(xì)管電泳則是利用糖類在電場(chǎng)中的遷移速度差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，其分離效果優(yōu)于傳統(tǒng)的色譜方法。

3.脂類分析。脂類對(duì)乳制品的風(fēng)味、質(zhì)地和儲(chǔ)存穩(wěn)定性有著重要作用，液相色譜法在脂類分析中應(yīng)用廣泛，常見(jiàn)的方法包括正相液相色譜和反相液相色譜。其中，正相液相色譜主要用于分析非極性和中等極性脂類，常用的固定相是含有非極性取代基的硅膠或氧化鋁；反相液相色譜則用于分析極性脂類，常用的固定相是碳鏈長(zhǎng)度較長(zhǎng)的疏水基團(tuán)修飾的硅膠。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性和溶劑梯度，可以實(shí)現(xiàn)脂類的有效分離和定量。

4.維生素分析。維生素也是乳制品中的重要營(yíng)養(yǎng)成分之一，液相色譜法在維生素分析中具有高靈敏度、高選擇性和快速分離的優(yōu)勢(shì)，常見(jiàn)的方法包括高效液相色譜、光電二極管陣列檢測(cè)器和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。其中，高效液相色譜常用于維生素的分析，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成和梯度程序來(lái)實(shí)現(xiàn)維生素的分離和定量；光電二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)進(jìn)行多波長(zhǎng)的檢測(cè)，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性；質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析，具有高靈敏度和高特異性。

三、液相色譜法在

乳制品安全性評(píng)估中的應(yīng)用

1.重金屬分析。重金屬是一類可能存在于乳制品中的污染物，如鉛、鎘、汞等，主要來(lái)自于土壤、飼料或生產(chǎn)過(guò)程中的污染源。液相色譜法結(jié)合前處理技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和分析乳制品中的重金屬含量，首先對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化，然后使用離子交換色譜、親和色譜或石墨爐原子吸收光譜等技術(shù)對(duì)重金屬進(jìn)行定量測(cè)定。

離子交換色譜可以有效分離乳制品中的重金屬。在樣品經(jīng)過(guò)前處理后，重金屬離子被吸附在離子交換樹(shù)脂上，通過(guò)改變移動(dòng)相的成分或pH，使吸附的重金屬離子逐漸釋放出來(lái)，然后通過(guò)色譜柱進(jìn)行分離和定量分析。

親和色譜是利用親和劑與重金屬之間的選擇性結(jié)合作用，實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè)。通過(guò)特定的親和劑與重金屬形成絡(luò)合物，將樣品中的重金屬與其他干擾物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，再進(jìn)行后續(xù)的定量分析。

石墨爐原子吸收光譜具有高靈敏度，能夠直接測(cè)定乳制品樣品中的重金屬含量。該方法使用專用的石墨爐進(jìn)行樣品的加熱和原子化，然后通過(guò)測(cè)量被原子化的重金屬蒸氣對(duì)特定波長(zhǎng)的光的吸收程度來(lái)確定其含量。

2.季銨鹽類分析。季銨鹽是一類常用的消毒劑和防腐劑，廣泛用于乳制品生產(chǎn)過(guò)程。然而，不當(dāng)使用或殘留過(guò)量的季銨鹽可能對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的影響，因此需要對(duì)乳制品中季銨鹽的含量進(jìn)行精確監(jiān)測(cè)。液相色譜法結(jié)合前處理技術(shù)可以有效地分析乳制品中季銨鹽的含量，常用的方法是離子交換色譜，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH和流動(dòng)相中的離子濃度實(shí)現(xiàn)季銨鹽與固定相之間的離子交換，從而分離和定量季銨鹽。

在季銨鹽分析中，液相色譜法還可以結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，提高分析的準(zhǔn)確性和特異性。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將液相色譜與質(zhì)譜儀結(jié)合起來(lái)，可以同時(shí)檢測(cè)多種季銨鹽并確定其結(jié)構(gòu)和含量，從而更加準(zhǔn)確地對(duì)乳制品中的季銨鹽進(jìn)行分析。

為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，液相色譜法在季銨鹽分析中還需要進(jìn)行方法驗(yàn)證和質(zhì)量控制。方法驗(yàn)證包括確定方法的靈敏度、線性范圍、重復(fù)性等參數(shù)，以保證分析結(jié)果的可靠性；質(zhì)量控制則是通過(guò)引入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、空白樣品和質(zhì)控樣品，監(jiān)測(cè)儀器的性能和分析過(guò)程的準(zhǔn)確性。

3.硝酸鹽類分析。硝酸鹽常用于化肥和農(nóng)藥，因此可能存在于乳制品中。高含量的硝酸鹽可能對(duì)人體健康特別是嬰幼兒造成潛在風(fēng)險(xiǎn)，而液相色譜法可以有效測(cè)定乳制品中的硝酸鹽含量。

一種常用的方法是離子交換色譜法，利用離子交換樹(shù)脂對(duì)樣品中的硝酸鹽進(jìn)行分離和測(cè)定，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的成分和離子強(qiáng)度，使得硝酸鹽與固定相之間發(fā)生離子交換，從而實(shí)現(xiàn)分離和定量分析。

液相色譜法還可以結(jié)合紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)器，通過(guò)測(cè)量硝酸鹽分子在特定波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)確定其含量。通過(guò)預(yù)先建立硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以準(zhǔn)確計(jì)算乳制品樣品中硝酸鹽的濃度。

四、液相色譜法在乳制品品質(zhì)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

1.動(dòng)態(tài)分析。動(dòng)態(tài)分析是指對(duì)乳制品樣品中特定成分的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)或連續(xù)監(jiān)測(cè)和分析，以了解其在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存等過(guò)程中的動(dòng)態(tài)性能。液相色譜法可以用于對(duì)乳制品中多種有機(jī)和無(wú)機(jī)成分的動(dòng)態(tài)分析。比如，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)乳制品中糖類、蛋白質(zhì)和維生素等成分的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)估其在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

在動(dòng)態(tài)分析中，液相色譜法通常與自動(dòng)采樣器和在線檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合使用，以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品樣品中成分的連續(xù)監(jiān)測(cè)。自動(dòng)采樣器可以定期或按需自動(dòng)取樣，并將樣品引入液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析；在線檢測(cè)系統(tǒng)則可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和記錄分析結(jié)果，以獲取樣品成分的動(dòng)態(tài)變化曲線。

動(dòng)態(tài)分析中的液相色譜方法需要考慮樣品的穩(wěn)定性和分析時(shí)間的控制。對(duì)于易發(fā)生變化的成分，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和食品添加劑等，需要選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相條件，以保證分離和測(cè)定的準(zhǔn)確性。同時(shí)，還需要優(yōu)化分析時(shí)間，以獲得足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而反映樣品中成分的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

2.表觀多肽圖譜分析。乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物和碎片被稱為表觀多肽，在乳品的品質(zhì)特性和口感上發(fā)揮著重要作用。液相色譜法通過(guò)分離和定量分析乳制品中的表觀多肽，可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)降解、酶解和發(fā)酵等過(guò)程的信息，從而評(píng)估乳品的品質(zhì)和新鮮度。常見(jiàn)的液相色譜模式包括反相色譜、離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜等。

在表觀多肽圖譜分析中，乳制品樣品首先需要進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和酶解處理，將蛋白質(zhì)分解為多肽，再利用適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相對(duì)多肽進(jìn)行分離。根據(jù)多肽的特性，可以選擇不同的色譜條件進(jìn)行分析，例如反相色譜適用于疏水性多肽的分離，而離子交換色譜適用于帶電多肽的分離。分離后的多肽可以通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。表觀多肽圖譜分析可以提供乳制品中不同蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的相對(duì)含量和特征峰的信息，通過(guò)對(duì)比不同樣品的表觀多肽圖譜，可以評(píng)估乳品的新鮮度、貯存穩(wěn)定性和加工過(guò)程中的變化。

3.酸度、氧化度等指標(biāo)分析。酸度、氧化度等指標(biāo)對(duì)于乳制品的品質(zhì)和安全性具有重要影響，因此需要進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定和監(jiān)控。

如表1所示，酸度是乳制品品質(zhì)評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)之一，常用的分析方法包括離子色譜法和pH計(jì)測(cè)定法。離子色譜法可以在分離柱上將有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸與其他成分分離，然后通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行定量分析；pH計(jì)測(cè)定法則是通過(guò)測(cè)量樣品溶液的酸堿度來(lái)間接評(píng)估酸度水平。這兩種方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中的酸度，并為生產(chǎn)者提供調(diào)整產(chǎn)品配方和工藝的依據(jù)，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量和口感。

氧化度是反映乳制品在儲(chǔ)存和加工過(guò)程中氧化變質(zhì)程度的重要指標(biāo)，常用的分析方法是HPLC和電化學(xué)檢測(cè)法是。HPLC可以高效分析乳制品中的氧化物，如過(guò)氧化脂質(zhì)、羥基自由基等，通過(guò)定量分析來(lái)評(píng)估乳制品的氧化度；電化學(xué)檢測(cè)法是基于氧化還原反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定樣品中氧化還原電位的變化來(lái)間接評(píng)估氧化度。這兩種方法可以準(zhǔn)確測(cè)定乳制品的氧化度，為生產(chǎn)者提供及時(shí)的質(zhì)量監(jiān)控和調(diào)整依據(jù)，以延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期和提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

作者簡(jiǎn)介：于冬燕（1987-），女，漢族，廣西桂林人，工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槿橹破窓z驗(yàn)和體系管理。

*通信作者：陳志成（1974-），男，漢族，湖南寧遠(yuǎn)人，高級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槿橹破费邪l(fā)和管理。