白扁豆和瓜蔞子藥材粉末飲片煎煮工藝研究*

海 月，朱 敏，錢(qián) 芳，陸 超，吳 磊，束雅春

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210036）

中藥粉末飲片是飲片的重要臨床應(yīng)用形式之一，《中國(guó)藥典》以及各省、自治區(qū)、直轄市中藥飲片炮制規(guī)范中收載的中藥粉末飲片日益增多，中藥粉末飲片具有提高有效利用率、節(jié)省藥材資源、配伍靈活、可避免處方外泄等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用［1-2］。中藥粉末飲片用量逐年增加，但我國(guó)并未對(duì)其適用范圍、適宜粒徑、制備工藝、質(zhì)量控制等內(nèi)容作出詳細(xì)規(guī)定和制訂統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，難以保障其質(zhì)量，制約了中藥飲片產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展［3］。因此，加強(qiáng)中藥粉末飲片的生物等效性、安全性和提取工藝研究是創(chuàng)新中藥飲片用藥形式的關(guān)鍵。核苷類(lèi)化合物是維持生物細(xì)胞重要功能的一類(lèi)成分，生理作用和生物活性廣泛，如抗癌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性等［4-9］。本研究中以白扁豆和瓜蔞子兩味中藥的粉末飲片為例，考察不同粉碎粒度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)其中核苷類(lèi)成分含量的影響，為粉末飲片的制備工藝和生物等效性研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華儀器制造有限公司）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AX224ZH/ E 型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；5424R 型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司）；e2695 - 2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）。

試藥：胞嘧啶對(duì)照品（批號(hào)為T(mén)W1128XA13）、尿嘧啶對(duì)照品（批號(hào)為T(mén)14A8X33880）、尿苷對(duì)照品（批號(hào)為T(mén)M0313XA13）、鳥(niǎo)苷對(duì)照品（批號(hào)為AJ0609NA14）、腺苷對(duì)照品（批號(hào)為Z04N8J47423），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，含量≥98.0%；乙腈為色譜純，乙酸銨（10 mmol/L）為分析純，水為娃哈哈純凈水。白扁豆藥材飲片（安徽亳州永剛飲片廠(chǎng)，批號(hào)為A220315）；瓜蔞子藥材飲片（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20220101-01）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK ADME - HR（S - 5）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-10 mmol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時(shí)1%A →5%A，15～25 min 時(shí)5%A，25～28 min 時(shí)5%A →80%A，28～33 min 時(shí)80%A；33～35 min 時(shí)80%A →1%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，分別加10%甲醇溶解，制成每1 mL分別含0.535，0.500，0.498，0.539，0.590 mg的單一對(duì)照品貯備液；分別取適量，混合后加10%甲醇定容，制成每1 mL 分別含0.107，0.100，0.099，0.108，0.118 mg的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：稱(chēng)取原飲片（白扁豆A，瓜蔞子GA）及粉末飲片［未過(guò)1 號(hào)篩（白扁豆B，瓜蔞子GB），過(guò)1 號(hào)篩（白扁豆C，瓜蔞子GC），過(guò)2 號(hào)篩（白扁豆D，瓜蔞子GD）、過(guò)3 號(hào)篩（白扁豆E，瓜蔞子GE）］5 種粒度飲片各2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加熱水20 mL，密塞，搖勻，浸泡30 min 后，分別煎煮10，20，30 min（編號(hào)分別為①②③），煎煮1 次（Ⅰ）或2 次（Ⅱ），搖勻?yàn)V過(guò)后，濾液置10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上清液900μL，加甲醇定容至1 mL，經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。白扁豆、瓜蔞子供試品編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 2種藥材粉末飲片供試品編號(hào)（n=2）Tab.1 Numbers of test solution of two medicinal powder decoction pieces（n=2）

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液與混合對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，且分離度均大于1.5，分離良好。理論板數(shù)按各成分峰計(jì)均大于3 000。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)涑刹煌|(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test

檢測(cè)限與定量限考察：分別取胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的單一對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋后按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）約為3和10 時(shí)各待測(cè)成分質(zhì)量濃度分別記作檢測(cè)限和定量限。結(jié)果各成分的檢測(cè)限分別為0.01，0.01，0.03，0.01，0.02 μg，定量限分別為0.03，0.04，0.08，0.04，0.07μg。

精密度試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.72%，0.72%，0.71%，0.71%，0.72%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下E③Ⅰ、GE③Ⅰ供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，18，24 h時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果E③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.73%，0.60%，1.21%，1.50%（n= 8），GE③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.80%，0.66%，1.22%，1.20%，1.03%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下E③Ⅰ、GE③Ⅰ樣品適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各成分含量。結(jié)果E③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、腺苷含量的RSD分別為0.72%，1.30%，1.24%，0.65%（n= 6），GE③Ⅰ供試品溶液中胞嘧啶、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷含量的RSD分別為0.93%，0.56%，0.70%，1.44%，1.07%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的白扁豆和瓜蔞子粉末飲片樣品，各6 份，每份2 g，精密加入各單一對(duì)照品貯備液，按2.2項(xiàng)下方法制備E③Ⅰ和GE③Ⅰ的供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 白扁豆藥材粉末飲片樣品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of Lablab Semen Album Powder Decoction Pieces（n=9）

表4 瓜蔞子藥材粉末飲片樣品加樣回收結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of the recovery test of Trichosanthis Semen Powder Decoction Pieces（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取2.2 項(xiàng)下各供試品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5和表6（“-”為未測(cè)出）。最終確定白扁豆、瓜蔞子藥材粉末飲片最佳工藝均為打成粗粉（后者需過(guò)2號(hào)篩），提取2次，每次20 min。

表5 白扁豆藥材粉末飲片樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.5 Results of content determination of nucleosides in Lablab Semen Album Powder Decoction Pieces（mg/g，n=2）

表6 瓜蔞子藥材粉末飲片樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.6 Results of content determination of nucleosides in Trichosanthis Semen Powder Decoction Pieces（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)中同時(shí)考察了超聲水提取法和加熱水提取法，結(jié)果顯示，前法對(duì)核苷類(lèi)成分的溶出率更高，但考慮臨床實(shí)際使用時(shí)多是加熱水提取1 次或2 次，故最終仍選擇加熱水提取，提取時(shí)間選取10，20，30 min，提取次數(shù)按1次和2次分別進(jìn)行考察。

3.2 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中同時(shí)考察了甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液，乙腈-10 mmol/L乙酸銨5 種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)峰形更對(duì)稱(chēng)，分離效果更好；還同時(shí)考察了Waters Sunfire C18柱，Zefex Acutfex PW-C18柱及CAPCELL PAK ADME-HR（S-5）柱，結(jié)果顯示，本研究中所選色譜柱在高水相比例下有較好的分離效果和耐用性。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，不同提取時(shí)間、提取次數(shù)及粒度對(duì)核苷類(lèi)成分含量有不同程度的影響。白扁豆藥材粉末飲片樣品中檢測(cè)到胞嘧啶，尿嘧啶，尿苷和腺苷，瓜蔞子藥材粉末飲片樣品中除上述4種成分外，還檢測(cè)到鳥(niǎo)苷。白扁豆和瓜蔞子藥材粉末飲片各粒度樣品中，提取2次比提取1次的核苷類(lèi)成分含量均增加。

白扁豆藥材粉末飲片樣品：各粒度樣品中均檢測(cè)到胞嘧啶和腺苷。樣品提取20 min 和30 min 的樣品中核苷類(lèi)成分含量均明顯高于提取10 min，前兩者間含量差異不明顯；在相同提取時(shí)間和提取次數(shù)條件下，B 樣品中核苷類(lèi)成分含量總體高于其他粒度，其次是粒度最小的E樣品，但在煎煮過(guò)程中，粒度太小易發(fā)生糊底。因此，綜合考慮本研究結(jié)果和臨床實(shí)際應(yīng)用操作便捷性，以打成粗粉，提取2次，每次20 min為宜。

瓜蔞子藥材粉末飲片樣品：在原飲片提取物中均未檢測(cè)到核苷類(lèi)成分；在GB 樣品中僅在提取30 min 的樣品中檢測(cè)到部分核苷類(lèi)成分；GC，GD，GE 樣品以提取2次樣品中大部分的核苷類(lèi)成分含量較高，且以提取30 min 含量較高（但有部分核苷類(lèi)成分含量反而低于20 min），GD樣品中核苷類(lèi)成分含量總體偏高，臨床使用時(shí)，可考慮將瓜蔞子粉碎過(guò)2號(hào)篩，提取2次，每次20 min。

本研究結(jié)果顯示，隨著粉碎粒度的增加，核苷類(lèi)成分的含量不完全隨之增加，可能由于果實(shí)種子類(lèi)成分含油脂較多，粒度越小，油脂類(lèi)成分的溶出也隨之增加，一定程度上會(huì)限制某些核苷類(lèi)成分的溶出，可見(jiàn)臨床使用時(shí)，有效成分溶出率不一定與粒度呈負(fù)相關(guān)。本研究中，每個(gè)樣本均平行制備2 份，能一定程度上反映核苷類(lèi)成分含量的變化趨勢(shì)，但重復(fù)次數(shù)仍有限，后續(xù)需對(duì)現(xiàn)有結(jié)果進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。中藥發(fā)揮藥效是多成分共同作用的結(jié)果，核苷類(lèi)只是其中的一類(lèi)成分，白扁豆和瓜蔞子藥材飲片中含有大量的脂肪酸、蛋白質(zhì)等其他成分，粉碎粒度及提取方法的考察，尚需結(jié)合多成分多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。核苷類(lèi)成分在白扁豆和瓜蔞子藥材飲片中的藥理藥效機(jī)制尚未知曉，后續(xù)還需結(jié)合相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)，從功效相關(guān)活性成分的粉碎及提取工藝角度綜合完善果實(shí)種子類(lèi)粉末飲片的煎煮規(guī)范，以更好地為臨床科學(xué)合理用藥提供研究依據(jù)。