左璐瑩, 吳繼來, 初 楚, 陳欣渝, 陳安良*,

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 311300；2.浙江省杭州市臨安區(qū)植物檢疫站，杭州 311300)

植物抗病激活劑被稱為植物疫苗，在離體條件下沒有抑菌能力，但在活體條件下可表現(xiàn)出良好的防治效果[1]。水楊酸 (SA) 是誘導(dǎo)植物抗病性的信號(hào)分子，可通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白(PR 蛋白)、調(diào)節(jié)相關(guān)保護(hù)酶活性等途徑使植物體產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性 (SAR)[2]。目前利用水楊酸防治冬瓜枯萎病[3]、番木瓜環(huán)斑病[4]、草莓白粉病[5]等的效果已被證實(shí)，但其在林業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用尚未見報(bào)道。

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要的病害之一，可危害油茶果、葉、枝梢和花蕾等部位，引起落果、落蕾、落葉、枝梢枯死、枝干潰瘍，甚至整株衰亡[6]。其病原菌主要為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]，生產(chǎn)上常采用多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑進(jìn)行防治[8]，但單一化學(xué)農(nóng)藥長期使用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性[9]，且大量使用殺菌劑對油茶產(chǎn)品質(zhì)量安全也具有不利影響。將化學(xué)殺菌劑與植物抗病激活劑混合使用，可在保證防治效果的同時(shí)減少化學(xué)藥劑的使用，以減輕化學(xué)藥劑帶來的環(huán)境壓力、抗性及農(nóng)產(chǎn)品殘留污染等問題，對促進(jìn)綠色防控、推進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)生態(tài)發(fā)展具有重要意義[10]。

本研究團(tuán)隊(duì)前期室內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗病激活劑水楊酸可誘導(dǎo)油茶產(chǎn)生抵御炭疽病的能力，其與咪鮮胺混用對抑制離體炭疽病菌還具有一定的增效作用[11]，但該結(jié)論尚未在活體和田間得到證實(shí)，目前水楊酸也還未進(jìn)行單獨(dú)的農(nóng)藥品種登記。本研究采用水楊酸原藥，在油茶苗上針對炭疽病進(jìn)行了咪鮮胺與水楊酸混配的防治效果試驗(yàn)，繼而進(jìn)行了田間藥效試驗(yàn)驗(yàn)證，以期在減少殺菌劑咪鮮胺用量的同時(shí)，獲得理想的田間防效，達(dá)到減藥增效的目的，為植物抗病激活劑的實(shí)際應(yīng)用和油茶炭疽病防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 油茶植株、菌株和藥劑 油茶品種為長林53 號(hào)，來源于浙江省建德市油茶苗圃。膠孢炭疽菌C.gloeosporioides菌株由浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室保存并提供。99.5%水楊酸 (salicylic acid) 原藥，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；450 g/L 咪鮮胺水乳劑 (prochloraz 450 g/L EW)，青島翰生生物科技股份有限公司。

3WBD-16 型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器，北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)。

母液配制：將750 mg 水楊酸原藥加入4 mL無水乙醇中，再加入1 mL OP-10 乳化劑，混勻，配制為150 mg/mL 的水楊酸母液；將4 g 咪鮮胺EW 加入18 mL 無菌水中，配制為100 mg/mL 的咪鮮胺母液。試驗(yàn)時(shí)用清水稀釋母液，分別配制成以下系列質(zhì)量濃度藥液：150 mg/L 水楊酸(SA)、100 mg/L 咪鮮胺 (P1)、200 mg/L 咪鮮胺(P2)、300 mg/L 咪鮮胺 (P3)、150 mg/L 水楊酸 +100 mg/L 咪鮮胺 (C1)、150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L咪鮮胺 (C2)、150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺(C3)，同時(shí)設(shè)清水對照 (CK)，共8 個(gè)處理。每組藥劑配制1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶苗施藥及葉片接菌 將供試膠孢炭疽菌菌株接種于經(jīng)高溫滅菌的PDA 平板上，置于25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d，備用。選擇長勢良好且大小一致的兩年生油茶苗40 株，分為8 組，對應(yīng)8 個(gè)處理，每組5 株油茶苗，相當(dāng)于每處理重復(fù)5 次。將配制好的藥液分別噴施于各組油茶苗上，至葉片完全潤濕止，并于首次噴藥5 d 后噴施第2 次藥液。于滅菌條件下，在預(yù)培養(yǎng)5 d 后的膠孢炭疽菌菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅。于首次噴藥后5 d (第2 次噴藥前) 以及第2 次噴藥后5、10、15、20、25 d 分別從每株油茶苗上取3 片新葉，進(jìn)行刺傷后接種菌餅，置于37 ℃、相對濕度80%、遮光的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，5 d 后按如下方法測量病斑面積。

將接菌葉片置于45 cm × 45 cm × 45 cm 小型黑色燈棚底部，在15 cm × 15 cm 玻璃片上標(biāo)記出1 cm × 1 cm 標(biāo)準(zhǔn)面積，用玻璃片將葉片壓展，在燈棚上端進(jìn)行定焦距拍攝。將照片導(dǎo)入Autodesk Computer Aided Design (CAD)，利用CAD 軟件選取病斑，計(jì)量病斑面積。采用Abbott 法[12]評價(jià)水楊酸與咪鮮胺混用對防治油茶炭疽病的增效作用。按照式 (1)、式 (2) 和式 (3) 分別計(jì)算防治效果 (Cobs，%)、理論防效 (Cexp，%) 和增效系數(shù)(SR)。

式 (1)～(3) 中：Lac為對照組病斑面積，cm2；Lat為處理組病斑面積，cm2；C1、C2分別為2 種單劑的實(shí)際防效，%。

SR＞1 為增效作用，SR＜1 為拮抗作用，SR=1 為相加作用[12]。

1.2.2 田間藥效試驗(yàn) 試驗(yàn)在浙江省杭州市桐廬縣分水鎮(zhèn)油茶基地進(jìn)行，3 年生白花油茶。

1.2.2.1 藥劑配比及小區(qū)劃分 試驗(yàn)共設(shè)6 個(gè)質(zhì)量濃度處理，分別對應(yīng)1.1.1 節(jié)中的SA、P1、P2、C1、C2 及對照 CK。每處理3 個(gè)小區(qū)，各小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行加以隔離。

1.2.2.2 施藥時(shí)間和施藥方法 田間試驗(yàn)方法參考江西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB36∕T1128.4 - 2019 進(jìn)行[13]。

采用3WBD-16 型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器 (單個(gè)空心圓錐噴頭，噴孔直徑1.3 mm，操作壓力0.2～0.4 MPa，流量0.65～0.88 L/min)均勻噴霧施藥，用藥液量為2400 L/hm2。于2022 年6 月22 日油茶樹炭疽病發(fā)生初期第1 次施藥，7 d 后 (6 月29 日) 第2 次施藥，全期共施藥2 次。試驗(yàn)期間不采用任何其他防治措施。

1.2.2.3 藥效調(diào)查 每小區(qū)隨機(jī)調(diào)查5 株油茶樹，每株調(diào)查3 枝油茶樹梢的全部葉片，記錄葉片總數(shù)、各級(jí)病葉數(shù)。按發(fā)病程度進(jìn)行病情分級(jí)[13]：0 級(jí)，無病斑；1 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；3 級(jí)，病斑面積占6%～15%；5 級(jí)，病斑面積占16%～25%；7 級(jí)，病斑面積占26%～50%；9 級(jí)，病斑面積占51%以上。本研究于油茶炭疽病發(fā)生初期進(jìn)行，施藥前調(diào)查病情基數(shù)，于第1 次藥后7 d (第2 次藥前，6 月28 日) 及第2 次藥后28 d (7 月26 日) 各調(diào)查1 次發(fā)病情況，共調(diào)查3 次。按照公式 (4) 和 (5) 分別計(jì)算病情指數(shù) (Di) 及防治效果 (E，%)，部分小區(qū)因初始病情基數(shù)為0，按照公式 (6) 進(jìn)行計(jì)算。

當(dāng)初始病情基數(shù)不為0 時(shí)：

當(dāng)初始病情基數(shù)為0 時(shí)：

式 (4)～(6) 中：Na為病級(jí)葉片數(shù)；a為該病級(jí)代表數(shù)值 (a= 1，2，3...，9)；N為調(diào)查葉片數(shù)；Dic0為空白對照區(qū)藥前病情指數(shù)；Dic1為空白對照區(qū)藥后病情指數(shù)；Dit0為藥劑處理區(qū)藥前病情指數(shù)；Dit1為藥劑處理區(qū)藥后病情指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25.0 對病斑面積和防治效果進(jìn)行差異顯著性分析，并通過GraphPad 8.0 和Excel 2013 繪制結(jié)果圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)增效作用測定

離體葉片接菌測定結(jié)果 (圖1) 表明：第2 次藥后5 d 和10 d，150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺 (C2)處理組的防治效果顯著高于200 mg/L 咪鮮胺單獨(dú)處理 (P2)，增效系數(shù)分別達(dá)到1.38 和1.42 (P＜ 0.05) (表1)，但與300 mg/L 咪鮮胺單獨(dú)處理組 (P3) 之間卻無顯著性差異；第2 次藥后5 d，150 mg/L 水楊酸 + 100 mg/L 咪鮮胺 (C1) 處理組防治效果顯著高于100 mg/L 咪鮮胺單獨(dú)處理(P1)，增效系數(shù)達(dá)到1.42，但與P2 組之間則無顯著性差異；表明水楊酸與咪鮮胺混用后具有增效作用。第2 次藥后20 d，C2 組防效為57.26%，150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺 (C3) 組防效為53.29%，顯著高于P2 和P3 組，說明水楊酸與咪鮮胺混用可以有效延長防治持效期至首次施藥后25 d。同時(shí)，C3 組當(dāng)咪鮮胺質(zhì)量濃度升高至300 mg/L 后，與水楊酸混用并未出現(xiàn)明顯的增效作用，甚至在第2 次藥后10 、15 和20 d，增效系數(shù)小于1，說明與水楊酸混用時(shí)，咪鮮胺濃度過高反而會(huì)降低防治效果。

表1 水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病防治效果的增效作用Table 1 Synergistic effect of the mixture of salicylic acid and prochloraz on the control of anthracnose of C.oleifera

圖1 離體葉片法測定水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病的防治效果Fig.1 Relative control efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera determined by detached leaf inoculation test

此外，第1 次施藥后5 d，水楊酸與咪鮮胺混用的增效效果并不明顯，第2 次藥后5 d 才逐漸表現(xiàn)出二者的增效作用，第2 次藥后15 d，水楊酸與咪鮮胺混用處理組的防治效果顯著高于咪鮮胺單獨(dú)處理，說明水楊酸激活油茶的抗病性需要一定時(shí)間過程，當(dāng)油茶被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病性后則可以保持較長時(shí)間，從而使得咪鮮胺的持效期延長。

2.2 田間防治效果

田間防治效果見表2。第1 次施藥后7 d，150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺 (C2) 和150 mg/L 水楊酸 + 100 mg/L 咪鮮胺 (C1) 處理組的平均防治效果均顯著高于200 mg/L 咪鮮胺 (P2)、150 mg/L 水楊酸 (SA) 和100 mg/L 咪鮮胺 (P1) 單獨(dú)處理組；第2 次藥后7 d，C2 組的防效顯著高于P2，C1 組的防效顯著高于P1 (P＜ 0.05)。即水楊酸與咪鮮胺混用的防治效果均高于單劑單獨(dú)使用，說明將2 種藥劑混合施用可以達(dá)到增強(qiáng)防效的目的。第2 次藥后28 d，C1 和C2 組的防效均顯著高于P1 和P2 組，表明將水楊酸與咪鮮胺混合施用延長了防治持效期。田間防效結(jié)果與室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病的田間防治效果Table 2 Field efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera

試驗(yàn)期間，觀察發(fā)現(xiàn)各處理小區(qū)油茶樹長勢、株高、葉片形狀和顏色等均與空白對照區(qū)無明顯差異，表明在試驗(yàn)期間無藥害現(xiàn)象發(fā)生。

3 小結(jié)與討論

本研究通過在油茶苗上施藥后再于離體葉片上接菌的方式，初步篩選出150 mg/L 水楊酸 +200 mg/L 咪鮮胺、150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺2 組防治效果顯著的混用處理，證明了2 種藥劑混用存在協(xié)同增效作用，并通過田間藥效試驗(yàn)，確定了150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺混用時(shí)對油茶炭疽病的防治效果最佳，與室內(nèi)生測結(jié)果一致。研究表明，水楊酸與咪鮮胺混用可提高對油茶炭疽病的防治效果并延長持效期，在田間應(yīng)用后有望減少殺菌劑施藥次數(shù)和降低施藥濃度，從而減少殺菌劑的用量。

有報(bào)道表明，施用外源性水楊酸可以通過提高超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD) 和降低過氧化氫酶 (CAT) 活性，減少脂質(zhì)過氧化，有效防治芒果炭疽病[14]、甜櫻桃青霉病[15]及山茶灰斑病[16]；可調(diào)控月季細(xì)胞壁中的防御系統(tǒng)，提高其抗黑斑病的能力[17]，并可有效延長月季切花瓶插壽命達(dá)6 倍[18]。王翠蘭等[11]進(jìn)行了水楊酸和咪鮮胺聯(lián)合施用對油茶炭疽病防治的室內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水楊酸和咪鮮胺混用具有顯著的增效作用，本研究結(jié)果與之一致。Takayoshi 等[19]利用噻菌靈(thiabendazole) 結(jié)合水楊酸誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗病能力，提高了藥劑對水稻稻瘟病的防治效果，本研究結(jié)果與該報(bào)道也相似。有研究者對水楊酸的誘導(dǎo)抗病性進(jìn)行了歸納，闡述了水楊酸與具有CAT 活性的水楊酸受體蛋白結(jié)合，抑制其CAT 活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過氧化氫濃度升高，從而激活植物體內(nèi)抗性基因表達(dá)的作用機(jī)理[1,20-22]，但目前聚焦到外源水楊酸對油茶誘導(dǎo)抗病性的研究還較少。后續(xù)我們還將針對不同階段油茶葉片的抗病性相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行測定，以探究其內(nèi)在機(jī)理。

植物免疫誘抗劑通過提高植物自身抗逆性來抵御病蟲害和不良環(huán)境條件的侵害，對解決化學(xué)農(nóng)藥過量使用造成的有害生物抗藥性上升、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題均有重要意義[20]。本研究明確了水楊酸和咪鮮胺混合施用可達(dá)到減藥增效、延長持效期的目的，并篩選出了其最優(yōu)配比為水楊酸150 mg/L + 咪鮮胺200 mg/L，結(jié)果可為油茶炭疽病防控新型綠色農(nóng)藥產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)提供新的思路和依據(jù)。