梁秀美, 夏海濤, 張維一, 林定鵬, 何如意,郭秀珠, 陳官菊, 張 井*,

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2.浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗站，浙江 溫州 325006；3.溫州科技職業(yè)學(xué)院 (溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院)/浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006)

我國是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，也是世界唯一的養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家[1]。目前，發(fā)達(dá)國家和國際組織在水產(chǎn)領(lǐng)域已經(jīng)建立了較為完善的農(nóng)藥最大殘留限量 (MRL) 體系，如日本共制定二甲戊靈、氯氰菊酯、唑草酮和滴滴涕等131 種農(nóng)藥264 項MRL，所涉及的水產(chǎn)品種類包括鮭形目、鱸形目、甲殼綱、其他魚類和水生動物等；此外，日本還規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)中未包含、無具體限量且非豁免的農(nóng)藥化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)一執(zhí)行0.01 mg/kg 的限量標(biāo)準(zhǔn)。但我國水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留限量設(shè)定指標(biāo)較少，僅5 種農(nóng)藥5 項MRL 標(biāo)準(zhǔn)，且標(biāo)準(zhǔn)中未包含、無具體限量且非豁免的農(nóng)藥未制定統(tǒng)一限量標(biāo)準(zhǔn)，與國外標(biāo)準(zhǔn)相比還存在較大差距[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥是各種污染物的主要儲存場所之一，如何最大限度地減少病害發(fā)生，對于廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖戶(特別是池塘養(yǎng)殖戶) 來說至關(guān)重要，清塘是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但在苗種放養(yǎng)時底泥是否達(dá)到養(yǎng)殖要求，清塘藥物是否會通過在水產(chǎn)品中殘留帶來食用風(fēng)險，目前還未引起廣泛重視。雖然《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022 年1、2 號》[3]文件中對批準(zhǔn)可用的有機磷、菊酯類等清塘殺蟲劑的休藥期做了明確規(guī)定，并明確指出禁止使用林丹等有機氯類農(nóng)藥，但對于酰胺類和三嗪類清塘除草劑、氟蟲腈等限制使用的苯基吡唑類清塘殺蟲劑并未做明確規(guī)定。

水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留樣品前處理方法主要有固相萃取法[4-6]、分散固相萃取法[7-8]、加速溶劑萃取法[9]、凝膠滲透色譜法[4,10-11]、磁性材料法[12]、冷凍去脂法[13]、QuEChERS 法[14-16]等；底泥中主要有固相萃取法[17-18]、加速溶劑萃取法[19-20]、超聲法[21]、凝膠滲透色譜法[22]、QuEChERS 法[14]等。與其他前處理方法相比，QuEChERS 法具有操作簡便、檢測成本低、環(huán)境友好、檢測高效等優(yōu)勢，而且還可準(zhǔn)確分離出殘留的農(nóng)藥成分[23]。因此，本研究選取QuEChERS 方法作為樣品前處理方法。水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11]、液相色譜法[24]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4,7]等。底泥中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[19,21]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18,20]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14,17]等。但有關(guān)水產(chǎn)品和養(yǎng)殖環(huán)境介質(zhì) (底泥) 中農(nóng)藥殘留的同時研究還不多見，現(xiàn)有的檢測方法多存在檢測目標(biāo)物單一、種類少的缺點。鯽魚是我國常見的淡水魚類，富含蛋白質(zhì)，可增強人體抵抗力。本研究在參考《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022 年1、2 號》述及的農(nóng)藥種類的基礎(chǔ)上，結(jié)合針對水產(chǎn)養(yǎng)殖戶通常會使用的清塘農(nóng)藥的走訪調(diào)研結(jié)果，以鯽魚為研究對象，針對酰胺類、三嗪類、苯基吡唑類、有機氯和有機磷類等常見的清塘農(nóng)藥，在QuEChERS 樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化提取和凈化條件，建立了可同時檢測鯽魚及產(chǎn)地底泥中41 種清塘常用農(nóng)藥的GC-MS/MS 分析方法，并對方法的適用性進(jìn)行了驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B/7000D 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有EI 離子源 (美國Agilent 公司)；艾本德5804R冷凍高速離心機 (德國Eppendorf 公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；OA-SYS/N-EVAP-112 氮吹儀 (美國Organomation 公司)；MS7610-33 漩渦振蕩器 (美國Thermo Fisher 公司)；Milli-Q Direct 8 超純水儀(美國Millipore 公司)；AR1502CN 電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)。

41 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，均購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，質(zhì)量濃度除特丁津、敵草凈和西草凈為1000 mg/L 外，其余均為100 mg/L (液態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

十八烷基硅烷 (C18，40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA，40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，105～125 μm)、酸性氧化鋁 (7G010005)、堿性氧化鋁 (AG010005) 和硅藻土 (545) (德國CNW 公司)；弗羅里硅土 (150～250 μm) (美國WZ.der.Floridin 公司)；超純硅膠 (60～200 μm) (加拿大SiliCycle 公司)；EMR 凈化管 (5982～1010) (美國Agilent 公司)；二氧化鋯 (B2006071) (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙酸乙酯、環(huán)己烷 (色譜純) (德國默克公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純。0.22 μm濾膜、1 mL 注射器和2 mL 樣品瓶 (上海安譜實驗科技股份有限公司)；試驗用水為Milli-Q Direct 8 超純水儀制備的超純水。

1.2 檢測條件

色譜條件：HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；碰撞氣為氮氣，流速為1.5 mL/min；載氣為氦氣，流速為2.25 mL/min；傳輸線溫度280 ℃；進(jìn)樣口溫度290 ℃；進(jìn)樣體積1.0 μL；不分流進(jìn)樣，不分流時間為1 min；柱升溫程序：初始溫度60 ℃保持1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min升至310 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離能70 eV；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式 (dMRM)；總運行20.75 min。41 種農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜參數(shù) (按出峰順序) 見表1，總離子流圖見圖1。

圖1 乙酸乙酯中41 種農(nóng)藥的總離子流圖(溶劑標(biāo)，添加水平為0.1 mg/L)Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of 41 pesticides in ethyl acetate (solvent standard and spiked at 0.1 mg/L)

表1 41 種農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters for analysis of 41 pesticides

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 鯽魚 準(zhǔn)確稱取5.00 g 均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入5.00 mL 水 和10.00 mLV(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶液，渦旋1 min 后超聲20 min；加入2.0 g 氯化鈉，渦旋1 min 后于6000 r/min、-4 ℃下冷凍離心5 min；取6 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入900 mg 無水硫酸鎂和600 mg 堿性氧化鋁，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下冷凍離心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL試管中，40 ℃水浴氮吹至近干，用2.00 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.3.2 底泥 準(zhǔn)確稱取5.00 g 經(jīng)陰涼處自然風(fēng)干后揀出雜質(zhì)、過0.25 mm 篩后的底泥樣品于50 mL離心管中，加入5.00 mL 水和10.00 mL 乙酸乙酯，渦旋1 min 后超聲20 min；加入2.0 g 氯化鈉，渦旋1 min 后于6000 r/min、-4 ℃下冷凍離心5 min；取6 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入900 mg 無水硫酸鎂和600 mg 弗羅里硅土、150 mg GCB，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下冷凍離心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL 試管中，在40 ℃水浴中氮吹至近干，用2.00 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1 (1.00 mg/L)：準(zhǔn)確移取特丁津、敵草凈和西草凈標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 mL，其余38 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各0.10 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1，于4 ℃密閉保存于聚丙烯容器瓶中，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2 (0.10 mg/L，以α-六六六計)：按鯽魚中41 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的定量限比例，分別移取一定體積的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2，于4 ℃密閉保存于聚丙烯容器瓶中，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液3 (0.10 mg/L，以α-六六六計)：按底泥中41 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的定量限比例進(jìn)行配制，方法同上，于4 ℃密閉保存于聚丙烯容器瓶中，備用。

1.5 檢出限及定量限和線性范圍

1.5.1 檢出限 (LOD) 及定量限 (LOQ) 分別以陰性鯽魚和底泥樣品為基質(zhì)，采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品 (標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1) 的方法配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，分別得到0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1、2 和5 μg/L 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液1 (鯽魚樣品) 和2 (底泥樣品)，按1.2 節(jié)的條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考GB/T 33260.2—2018 計算目標(biāo)物的儀器LOD[25]。方法LOQ 以最小添加濃度且可準(zhǔn)確定量的水平予以評價。

1.5.2 線性范圍 確定了方法LOQ 后，同樣采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品 (分別為標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2 和3) 的方法，分別得到0.10、0.20、0.50、1、2 和5 μg/L (以α-六六六計) 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液3 (鯽魚樣品) 和4 (底泥樣品)，按1.2 節(jié)的條件測定，計算線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 鯽魚和底泥中提取溶劑的選擇 分別考察了以乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷和V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶劑作為提取溶劑時，鯽魚肉中41 種目標(biāo)物的提取效果；以及以乙腈、乙酸乙酯、正己烷和石油醚作為提取劑時，底泥中目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果 (表2) 表明：1) 鯽魚肉中，甲醇的提取效率低；雖然乙酸乙酯、環(huán)己烷和正己烷的提取效果較好，但同時有大量色素等雜質(zhì)被提取，不利于后續(xù)凈化；乙腈的提取效果也很好，但價格、毒性均比乙酸乙酯高；V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶劑提取效果好，且提取液顏色淺，故鯽魚樣品最終選擇V(乙腈) :V(乙酸乙酯) = 1 : 1 混合溶劑為提取溶劑。2) 底泥樣品中，乙腈和乙酸乙酯的提取效率均較好，考慮到價格、毒性等因素，最終選擇以乙酸乙酯為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對41 種農(nóng)藥提取效果的影響(n = 3)Table 2 Extraction effect of the 41 pesticides using different extraction solvents (n = 3)

2.1.2 鯽魚和底泥中凈化條件優(yōu)化

2.1.2.1 凈化劑的選擇 鯽魚和養(yǎng)殖底泥樣品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，鯽魚中含有脂肪和蛋白質(zhì)等干擾成分，底泥中含有腐殖質(zhì)和色素等雜質(zhì)，可能對色譜分離效果及儀器靈敏度等造成一定程度的影響，從而影響定性和定量分析結(jié)果，故需對樣品進(jìn)行凈化。本文分別選擇C18、PSA、GCB、超純硅膠、弗羅里硅土、硅藻土、酸性氧化鋁、堿性氧化鋁、EMR 和二氧化鋯等常見的10 種固相萃取柱填料作為備選凈化材料，首先對比研究了其對目標(biāo)物的吸附情況。結(jié)果顯示，鯽魚肉中10 種凈化劑 (圖2) 和底泥樣品中8 種凈化劑 (圖3) 對目標(biāo)物的吸附性均不強，目標(biāo)物的回收率均在70%～120%之間，可達(dá)到要求。

圖2 不同凈化劑組合對鯽魚中41 種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect on the recoveries of 41 pesticides in crucian carp using different cleaned-up sorbents

圖3 不同凈化劑組合對底泥中41 種農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 Effect on the recoveries of 41 pesticides in bottom sediment using different cleaned-up sorbents

2.1.2.2 基質(zhì)效應(yīng) 采用GC-MS/MS 儀進(jìn)行殘留測定時應(yīng)盡量避免基質(zhì)效應(yīng) (ME)[26-27]，同時ME也可反映凈化效果。本文采用相對響應(yīng)值法對ME 進(jìn)行評價 (ME = 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值)，當(dāng)0.8 ≤ ME ≤ 1.2 時基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)ME ＞ 1.2 時為基質(zhì)增強效應(yīng)，當(dāng)ME ＜0.8 時為基質(zhì)抑制效應(yīng)[28]。結(jié)果 (圖4、5 和表3)顯示：堿性氧化鋁 (凈化劑組合V) 對鯽魚肉樣品提取液的凈化效果最優(yōu)；GCB (凈化劑組合VIII)對底泥樣品提取液的凈化效果最優(yōu)，其次是弗羅里硅土。

圖4 不同凈化劑組合對鯽魚中41 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評價Fig.4 The matrix effects of 41 pesticides in crucian carp using different cleaned-up sorbents

圖5 不同凈化劑組合對底泥中41 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評價Fig.5 The matrix effect of 41 pesticides in bottom sediment using different cleaned-up sorbents

表3 不同凈化劑組合對鯽魚和底泥樣品中41 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評價Table 3 The matrix effects of 41 pesticides in crucian carp and bottom sediment using different cleaned-up sorbents

2.1.2.3 凈化劑用量的優(yōu)化 為了提高凈化效果，降低ME，進(jìn)一步對比了不同用量堿性氧化鋁(300、450、600、750、900 mg) 對鯽魚肉樣品提取液的凈化效果和不同用量GCB、弗羅里硅土組合 (150 mg 弗羅里硅土 + 150 mg GCB、150 mg 弗羅里硅土 + 300 mg GCB、300 mg 弗羅里硅土 +150 mg GCB、300 mg 弗羅里硅土 + 300 mg GCB、450 mg 弗羅里硅土 + 150 mg GCB、450 mg 弗羅里硅土 + 300 mg GCB、600 mg 弗羅里硅土 + 150 mg GCB、600 mg 弗羅里硅土 + 300 mg GCB) 對底泥樣品提取液的凈化效果。結(jié)果 (圖2、3、4、5 和表3) 表明，鯽魚肉樣品中600 mg 堿性氧化鋁 (凈化劑組合XIV)、底泥樣品中600 mg 弗羅里硅土 +150 mg GCB (凈化劑組合XVI) 的凈化效果最優(yōu)，且回收率均可達(dá)到要求。為提高靈敏度，本文對樣品進(jìn)行了濃縮，結(jié)果顯示目標(biāo)物的回收率亦均可達(dá)到要求。

綜上，鯽魚中凈化劑最終選擇600 mg 堿性氧化鋁 (凈化劑組合XVII)、底泥中選擇600 mg 弗羅里硅土 + 150 mg GCB (凈化劑組合XVIII)，并選用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量的方式來減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.2 方法評價

2.2.1 線性范圍、檢出限 (LOD) 及定量限 (LOQ)

采用1.5.1 節(jié)的方法，對LOD 和LOQ 進(jìn)行評價。結(jié)果 (表4) 表明，鯽魚肉和底泥樣品中儀器LOD 均在0.05～2.5 μg/L 之間，方法LOQ 均在0.1～5.0 μg/kg 之間。

表4 41 種農(nóng)藥在鯽魚及底泥中的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear regression equation, correlation coefficient (r), LOD and LOQ of 41 pesticides in crucian carp and bottom sediment

采用1.5.2 節(jié)的方法，對方法線性范圍進(jìn)行評價。結(jié)果 (表4) 表明，鯽魚樣品中目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù) (r) 在0.9960～0.9999 之間，底泥樣品中目標(biāo)物的r在0.9964～1.000 之間，均能夠滿足定量分析的基本要求[29]。

2.2.2 方法的正確度和精密度 分別向鯽魚肉和底泥樣品中添加LOQ、2LOQ 和10LOQ3 個水平的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2 和3，每個水平重復(fù)6 次。由表5 可知，41 種農(nóng)藥在鯽魚樣品中的平均回收率在73%～116%之間，RSD 在0.65%～13%之間(n= 6)；在底泥樣品中的平均回收率在73%～104%之間，RSD 在0.051%～10%之間 (n= 6)。表明方法具有較好的正確度和精密度[29]。

2.3 方法應(yīng)用

為了進(jìn)一步驗證方法的可行性，運用建立的方法對從市場購買的青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、青蝦、小龍蝦等共16 個養(yǎng)殖類水產(chǎn)品和清塘一段時間后采集的14 個底泥樣品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) (表6)：16 個水產(chǎn)品樣品中檢出8 種農(nóng)藥，檢出率在6%～56%之間；14 個底泥樣品中檢出5 種農(nóng)藥，檢出率在7%～93%之間。參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[30]，所有檢出農(nóng)藥殘留均未超標(biāo)。

表6 實際市場抽檢樣品中41 種農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果Table 6 Detection results of 41 pesticides in market samples

本研究中，水產(chǎn)品和底泥中持久性有機污染物滴滴涕系列的檢出率較高，這可能是因為有機氯農(nóng)藥雖然目前早已不再使用，但由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且當(dāng)年的大量使用，自然條件下不易被降解，至今在地表土壤和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量仍然很高[31]。

3 結(jié)論

本研究建立了鯽魚和底泥中41 種常用清塘農(nóng)藥的GC-MS/MS 快速檢測方法。使用改良的QuEChERS 前處理方法，基質(zhì)匹配外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。對測定方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明：1) 鯽魚中41 種農(nóng)藥的方法LOQ 在0.1～5.0 μg/kg之間，r在0.9960～0.9999 之間；在LOQ、2 LOQ和10 LOQ 3 個添加水平下的平均回收率在73%～116% 之間，RSD 在0.65%～13% 之間 (n= 6)。2) 底泥中41 種農(nóng)藥的方法LOQ 在0.1～5.0 μg/kg之間，r在0.9964～1.000 之間；在LOQ、2 LOQ和10 LOQ 3 個添加水平下的平均回收率在73%～104%之間，RSD 在0.051%～10%之間 (n= 6)。該方法準(zhǔn)確、快捷、靈敏，為我國水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全提供了科學(xué)支持和技術(shù)保障，對于推進(jìn)政府監(jiān)管部門執(zhí)法、提高檢測效率、降低檢測成本等均具有一定的實際意義和社會效益，可應(yīng)用于水產(chǎn)品食品安全日常監(jiān)測。