黃財(cái)順,陸璐璐,馮啟宏,梁小敏,潘子康,王乾蕾*

雜質(zhì)是引起藥品不良反應(yīng)的重要因素,近幾年來,國內(nèi)外發(fā)生的多起重大藥品安全事件無不與其密切相關(guān)[1]。而基因毒性雜質(zhì)的危害更嚴(yán)重?；蚨拘噪s質(zhì)(genotoxic impurity,GTI),也稱遺傳毒性雜質(zhì),可引起DNA突變和重組,從而導(dǎo)致基因癌癥。由于種類繁多、毒性較大,嚴(yán)重性越來越受重視,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和分析檢測為重要手段?？股仡愃幬锱R床用量較大,其中含有基因毒性雜質(zhì)。本文對(duì)抗生素類藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測與分析進(jìn)行綜述。

1 基因毒性雜質(zhì)分類及研究概述

基因毒性雜質(zhì)主要分為5大類,分別為亞硝胺類化合物、磺酸酯類化合物、肼類化合物、環(huán)氧化合物、芳香胺類化合物,多采用液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、色譜聯(lián)用技術(shù)等進(jìn)行檢測。對(duì)無法用GC法檢測到的磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)可在堿性條件下水解生成甲磺酸鈉,建立合適的離子色譜法進(jìn)行分析[2]。

基因毒性雜質(zhì)主要產(chǎn)生于藥物原材料合成過程中的起始物料、中間體、試劑及反應(yīng)副產(chǎn)物。合理篩選工藝路線,識(shí)別警示結(jié)構(gòu),可從源頭上遏制基因毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生。

2 研究進(jìn)展

2.1 β-內(nèi)酰胺類抗生素基因毒性雜質(zhì)研究 β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactams)系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素,包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類及青霉烯類酶抑制劑等。

β-內(nèi)酰胺類抗生素具有胺類結(jié)構(gòu),生產(chǎn)和存儲(chǔ)過程中容易產(chǎn)生N-亞硝胺雜質(zhì),應(yīng)引起足夠重視。李俊等[3]建立了頭孢孟多酯鈉、頭孢地嗪鈉、鹽酸頭孢替安中8種N-亞硝胺類雜質(zhì)的GC-MS/MS檢測方法。周剛等[4]采用GC-MS/MS法,對(duì)提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化,成功建立了阿莫西林原料藥中12種N-亞硝胺類化合物的檢測方法。蔡英杰等[5]采用振蕩提取的方式,避免了基質(zhì)對(duì)儀器造成的損害,成功運(yùn)用GC-MS法同時(shí)檢測頭孢呋辛鈉中的N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基二乙胺。宋蕓峰等[6]利用UPLC-MS/MS法同時(shí)測定13個(gè)潛在的亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。除N-亞硝胺雜質(zhì)外,β-內(nèi)酰胺類藥物中還可能存在氯甲烷、氯乙烷、2-巰基苯并噻唑、酰氯等基因毒性雜質(zhì),相關(guān)檢測方法已建立[7-9]。

β-內(nèi)酰胺類抗生素中的基因毒性雜質(zhì)以N-亞硝胺類物質(zhì)為主,可能為β-內(nèi)酰胺中的胺類結(jié)構(gòu)在合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。由于亞硝胺類物質(zhì)有著相似結(jié)構(gòu),在建立檢測方法后,可同時(shí)測定多種N-亞硝胺雜質(zhì),但對(duì)儀器的靈敏度有較高要求。

2.2 酮類抗生素基因毒性雜質(zhì)研究 酮類抗生素的應(yīng)用較為廣泛,如諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星等。此類藥物合成過程中容易產(chǎn)生與酮類結(jié)構(gòu)相近的酯類基因毒性雜質(zhì)。宋太發(fā)等[10]采用分段模式檢測,建立了加替沙星中基因毒性雜質(zhì)對(duì)甲基苯磺酸乙酯的LC-MS/MS檢測方法。范達(dá)等[11]建立了注射用甲磺酸吉米沙星中甲磺酸烷基酯類基因毒性雜質(zhì)的頂空氣相色譜檢測方法。李霄等[12]和曹穎等[13]分別用UHPLC-HRMS和LC-MS /MS法測定了莫西沙星中的亞硝胺類化合物和酰氯類遺傳毒性雜質(zhì)。陳爽等[14]建立了左氧氟沙星中二氯亞砜的GC-MS檢測方法。除上述喹諾酮類抗生素外,唑烷酮類也有相應(yīng)研究。李倚天等[15]采用單離子掃描模式(SIM),建立UPLC-MS/MS法,可快速測定利奈唑胺中基因毒性雜質(zhì)“S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽”的含量。裘亞等[16]采用LC-MS法分析發(fā)現(xiàn)樣品中均存在潛在基因毒性雜質(zhì)3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺,應(yīng)予以重點(diǎn)關(guān)注。劉峰等[17]以UPLC-MS/MS法同時(shí)測定利奈唑胺及生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇。利奈唑胺還存在硝基苯類和S-環(huán)氧氯丙烷等基因毒性雜質(zhì)[18-19]。

酮類抗生素的基因毒性雜質(zhì)研究比較多,僅次于β-內(nèi)酰胺類抗生素。由于碳氧雙鍵較為活躍,在生產(chǎn)過程中極易轉(zhuǎn)化為酯類和醇類雜質(zhì)。因此,酮類抗生素的基因毒性雜質(zhì)研究以甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、S-1-氨基-3-氯-2-丙醇+等物質(zhì)為主,與其他類型抗生素形成鮮明對(duì)比。

2.3 氨基苷類抗生素基因毒性雜質(zhì)研究 氨基苷類(aminoglycosides)抗生素是由兩個(gè)或三個(gè)氨基糖分子和一個(gè)氨基環(huán)醇通過醚鍵連接而成。臨床中常用的氨基糖苷類的抗生素包括鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星等。姚永青等[20]以5%苯甲醛甲醇溶液作為衍生化試劑,建立了硫酸阿米卡星及其制劑中基因毒性雜質(zhì)肼的含量測定方法。

2.4 四環(huán)素類抗生素基因毒性雜質(zhì)研究 四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines)是結(jié)構(gòu)中含并四苯基本骨架,由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素包括土霉素、金霉素、四環(huán)素及半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等,生產(chǎn)和存儲(chǔ)過程中容易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相近的雜質(zhì),如9-硝基米諾環(huán)素,屬于基因毒性雜質(zhì)。易芬芬等[21]采用多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式建立了替加環(huán)素中遺傳毒性雜質(zhì)9-硝基米諾環(huán)素的LC-MS檢測方法。

2.5 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基因毒性雜質(zhì)研究 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolides antibiotics,MA)屬于快速抑菌劑,是分子結(jié)構(gòu)中具有碳內(nèi)酯環(huán)的抗菌藥物的總稱。其作用原理是通過阻斷核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性,進(jìn)而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。其生產(chǎn)和存儲(chǔ)過程中容易產(chǎn)生酯類雜質(zhì)。張勉等[22]采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定克林霉素磷酸酯中的對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。孫麗等[23]建立了阿奇霉素顆粒中基因毒性雜質(zhì)對(duì)甲苯磺酸乙酯的高效液相色譜測定方法。郝麗娟等[24]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測阿奇霉素原料藥及其制劑中6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。

關(guān)于氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的基因毒性雜質(zhì)研究比較少,可能與臨床用量較低有關(guān)。但三類藥物在治療某些細(xì)菌感染的疾病時(shí)起著不可替代的作用,其質(zhì)量安全也應(yīng)引起足夠重視。

3 分析與討論

筆者等通過中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)及維普數(shù)據(jù)庫,分別以“抗生素”“基因毒性雜質(zhì)”“遺傳毒性雜質(zhì)”等關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,篩選并研讀相關(guān)文獻(xiàn),將雜質(zhì)種類、檢測方法及檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):(1)抗生素類藥物基因毒性雜質(zhì)研究以亞硝胺類物質(zhì)為重點(diǎn)研究對(duì)象,約占總數(shù)的34.7%,占β-內(nèi)酰胺類藥物的66.6%;(2)檢測方法以液相色譜及其聯(lián)用方法為主,約占60%,且測定結(jié)果幾乎均為“未檢出”;(3)單次研究次數(shù)最多的藥物為利奈唑胺,作為售價(jià)較為昂貴的藥物,說明基因毒性雜質(zhì)的研究偏向于價(jià)值導(dǎo)向型。見表1。

表1 抗生素中基因毒性雜質(zhì)測定結(jié)果

β-內(nèi)酰胺類抗生素中常見的基因毒性雜質(zhì)為亞硝胺類物質(zhì),此類物質(zhì)的產(chǎn)生主要有以下三點(diǎn)原因:(1)首先與其合成工藝密切相關(guān)。β-內(nèi)酰胺類抗生素合成的關(guān)鍵中間體是7-ACA(7-氨基頭孢烷酸)、6-APA(6-氨基青霉烷酸)、7-ADCA(7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸),在合成中容易產(chǎn)生具有亞硝酰自由基的氮氧化物,通過一定機(jī)理轉(zhuǎn)化為仲胺,在亞硝化試劑的作用下產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。(2)物料污染。生產(chǎn)過程中可能使用N,N-二甲基甲酰胺,其中含有的微量二甲胺或二乙胺和亞硝酸鹽在酸性條件下反應(yīng),產(chǎn)生此類雜質(zhì)。(3)自身降解。某些藥物本身會(huì)降解產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì),如雷尼替丁在高溫下會(huì)產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。

4 發(fā)展趨勢(shì)及研究策略

據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果,抗生素類藥物基因毒性雜質(zhì)的檢測結(jié)果大部分為“未檢出”,但并不能排除毒性危害的存在,因?yàn)樵O(shè)定方法時(shí)多沒有充分考慮基因毒性雜質(zhì)的毒理限度。亞硝胺類雜質(zhì)具有較高的致癌風(fēng)險(xiǎn),指導(dǎo)原則ICH M7(R1)提出的每日1.5 μg的毒理學(xué)閾值(TTC)不太適合。藥品上市許可持有人/藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)工藝路線、生產(chǎn)過程、物料屬性、降解情況、分析測試結(jié)果、監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求等,確定亞硝胺類雜質(zhì)的種類及限度,避免出現(xiàn)測定結(jié)果為“未檢出”,而實(shí)際存在毒性危害的情況。

除此以外,為全面評(píng)價(jià)藥物的安全性,可結(jié)合其他類型藥物的雜質(zhì)研究?？股仡愃幬镏羞€有一種特殊的雜質(zhì)-高分子雜質(zhì),也叫高分子聚合物。在基因毒性雜質(zhì)難以檢測的情況下,結(jié)合高分子雜質(zhì)研究,能更加準(zhǔn)確的反映藥物的質(zhì)量安全信息。與基因毒性雜質(zhì)不同,高聚物對(duì)照品一般難以獲得,自身對(duì)照法是目前最為理想的測定方法,可結(jié)合凝膠色譜、RP-HPLC及質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)制定研究策略。結(jié)合基因毒性和高分子雜質(zhì)研究,具體策略見圖1。