許伊云,張沁欣,胡 平,許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院,南京 210004)

根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示,約34%的致病突變由大于單個堿基的變異構(gòu)成[1]。基因組結(jié)構(gòu)變異(structural variation,SV),包括拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNV)以及大于50bp的插入缺失、易位、倒位等累及基因組的范圍遠(yuǎn)大于其它類型的遺傳變異。自20世紀(jì)60年代以來,核型分析作為診斷染色體變異的金標(biāo)準(zhǔn)一直被用于染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的檢測,然而其分辨率極大地限制了其檢測效能。盡管染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)等技術(shù)的出現(xiàn)使高通量、自動化、高分辨率檢測CNV成為了可能,但對于平衡性和復(fù)雜性的SV以及<50kb的插入缺失等同樣無法檢出。目前全基因組測序以及三代測序能進(jìn)行SV的檢測,然而由于算法尚不完善、成本仍較高等問題尚未實(shí)現(xiàn)臨床普及。基因組光學(xué)圖譜技術(shù)(optical genome mapping,OGM),又被稱下一代細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),是一種高分率構(gòu)建全基因組限制性內(nèi)切酶圖譜的方法,近年來已在遺傳病診斷領(lǐng)域初露鋒芒。本文圍繞基因組光學(xué)圖譜技術(shù)的發(fā)展歷程、工作流程及技術(shù)特點(diǎn)以及其于遺傳病診斷中的應(yīng)用展開闡述。

1 OGM技術(shù)的發(fā)展歷程

1993年Schwartz等[2]首次提出了光學(xué)圖譜技術(shù),其利用限制性內(nèi)切酶消化固定于瓊脂糖凝膠中的單個DNA分子,并通過熒光顯微鏡成像構(gòu)建了釀酒酵母染色體結(jié)構(gòu)。此后近30年間,該項技術(shù)逐步優(yōu)化與進(jìn)步?？紤]到瓊脂糖凝膠會導(dǎo)致光散射、影響熒光信號強(qiáng)度,1995年研究者們通過將DNA分子固定于特殊化學(xué)物質(zhì)處理后的玻璃表面,改善了DNA分子的拉伸率及限制性內(nèi)切酶的酶切效率,從而提高了該項技術(shù)的準(zhǔn)確性及分辨率,也使得自動化分析成為了可能[3-4]。直至1998年,自動化生成限制性內(nèi)切酶圖譜的方法首次被提出[5]。2004年Tegenfeldt等[6]的一項研究使長度大于1000000bp的DNA分子在納米通道內(nèi)延伸,證明了基于納米通道進(jìn)行DNA分子長度測量的優(yōu)勢所在,由此推動了納米通道在光學(xué)圖譜技術(shù)中的應(yīng)用研究。2007年Jo等[7]利用納米夾縫和酶標(biāo)記方法構(gòu)建了一種單分子條碼系統(tǒng)用于DNA分析,使光學(xué)圖譜技術(shù)的通量及精度再次得到提升。2010年OpGen推出了第一個商業(yè)化的光學(xué)圖譜系統(tǒng)并發(fā)布了Argus平臺及MapSolver分析軟件。然而,目前市場主流的OGM檢測平臺由Bionano Genomics公司提供。該公司于2012年發(fā)布了第一代Irys系統(tǒng)并于2017年完成了升級及優(yōu)化。當(dāng)前使用的Saphyr系統(tǒng)在分辨率、通量、算法等各方面均更為完善,已逐步被應(yīng)用于基因組組裝、血液病、惡性腫瘤、遺傳病診斷等各個領(lǐng)域。

2 OGM的工作流程及技術(shù)特點(diǎn)

目前適用于OGM遺傳學(xué)檢測的樣本類型主要包括新鮮或冷凍血液、培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞、絨毛組織等。其工作流程主要為,提取超高分子量(ultra-High Molecular Weight,uHMW)DNA,電泳質(zhì)控合格后對雙鏈DNA進(jìn)行DLS(Direct Label and Stain)序列特異性標(biāo)記。該技術(shù)應(yīng)用一種熒光轉(zhuǎn)移酶(DLE-1)特異性識別全基因組中的CTTAAG 6核苷酸序列并轉(zhuǎn)移上綠色熒光標(biāo)記。在將雙鏈DNA骨架過夜染為藍(lán)色后,即可獲得帶有綠色熒光標(biāo)簽的藍(lán)色DNA分子。標(biāo)記后DNA被載入Saphyr芯片,并在電泳作用下通過大量并行的納米通道陣列從而實(shí)現(xiàn)線性化[8]。通過循環(huán)加載和數(shù)字化處理,熒光信號最終被轉(zhuǎn)化為分子條形碼樣圖像,由Bionano Solve和Bionano Access軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析,如進(jìn)行基因組的從頭組裝以及將樣本基因組與參考基因組比對從而實(shí)現(xiàn)SV的檢出。其中下機(jī)數(shù)據(jù)需要達(dá)到的質(zhì)控指標(biāo)包括N50讀長>230kb、平均標(biāo)記密度在14～17/100kb、比對率≥70%、有效數(shù)據(jù)深度>80×等[9]。由于DNA分子讀長長、全程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增,因此OGM能盡可能減少序列比對時定位錯誤的發(fā)生以及PCR過程中的GC偏移。當(dāng)前OGM的檢測范圍涵蓋了除累及著絲粒的整臂易位以外各種類型的染色體變異,且最高分辨率能夠達(dá)到500bp,見表1。

表1 OGM與CMA及核型分析的檢測范圍對比

3 OGM在遺傳病診斷中的應(yīng)用

3.1 基因組結(jié)構(gòu)變異的全面檢測 目前臨床常用的部分遺傳學(xué)檢測手段均具有較強(qiáng)的針對性,如CMA、CNV-seq主要被用于CNV、非整倍體等染色體變異的檢測,對于不引起遺傳物質(zhì)劑量改變的平衡性染色體重排則缺乏檢出能力。臨床主要通過核型分析、FISH等技術(shù)進(jìn)行染色體易位、倒位等SV的診斷,前者分辨率較低,后者僅能進(jìn)行靶向檢測而無法實(shí)現(xiàn)全局分析,因此檢測效能有限。此外,聯(lián)合應(yīng)用多項檢測手段的成本及診斷周期均會有所增加。因此,一項高分辨率、檢測范圍能囊括各類染色體變異的綜合性檢測技術(shù)對于提高遺傳病診斷的成本效益、減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)具有重要的意義和價值。由此,研究者開始嘗試完善二代測序?qū)V的檢測,并開發(fā)了一系列生物信息學(xué)算法及分析工具[10],但二代測序的短讀序列始終無法跨越大部分復(fù)雜重復(fù)區(qū)域,因此檢測靈敏度尚不穩(wěn)定。三代測序有望彌補(bǔ)這一劣勢,實(shí)現(xiàn)SV的全面探索,但相較于OGM,其讀長較短、通量較低、成本高、生物信息學(xué)算法尚不完備,臨床應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)[11]。

目前,OGM以其長讀長和高分辨率已逐步被應(yīng)用于基因組SV的全面檢測。2019年Levy-Sakin等[12]利用OGM技術(shù)對千人基因組計劃中154個個體的大片段SV(>2kb)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)該項技術(shù)使大片段插入和缺失的檢出率分別提高了8.5倍和35%,證實(shí)了OGM在SV檢測中的巨大潛力。2021年,人類基因組結(jié)構(gòu)變異聯(lián)盟聯(lián)合應(yīng)用測序技術(shù)以及OGM從32個個體中組裝出了64個單倍型的人類基因組;在對SV的檢測中,三代測序僅檢出了OGM提示的大片段(大于5kb)SV中的72%,而OGM則額外檢出了1175個獨(dú)特的SV位點(diǎn),再次展現(xiàn)了OGM在復(fù)雜性SV全面檢測中的獨(dú)特優(yōu)勢[13]。

近年來,已有多項研究對OGM的檢測效能進(jìn)行了分析。有學(xué)者對85例已明確變異類型的樣本進(jìn)行了OGM檢測,發(fā)現(xiàn)在未累及著絲粒區(qū)域的染色體變異的分析中,OGM與常規(guī)遺傳學(xué)檢測手段的檢測結(jié)果均一致,認(rèn)為OGM以其全面的檢測范圍和優(yōu)越的檢測效能有望成為核型、FISH、CMA的可靠替代方案[14]。Sahajpal等[15]則對OGM應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的可行性及有效性進(jìn)行了雙盲、回顧性研究,94例產(chǎn)前樣本中,OGM取得了與標(biāo)準(zhǔn)檢測方法完全一致的結(jié)果。然而,有研究發(fā)現(xiàn)盡管OGM能為存在變異的樣本額外提供斷點(diǎn)區(qū)間、重排模式等遺傳信息,但其對于斷點(diǎn)位于片段重復(fù)區(qū)的大片段倒位以及X染色體亞端粒區(qū)的微缺失同樣存在漏檢的情況,認(rèn)為OGM的算法尚存改進(jìn)空間,目前可將其與CMA、核型分析等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,作為傳統(tǒng)檢測方法的有力補(bǔ)充[16]。由此可見,OGM真正邁向臨床之前,仍需積累更多的研究數(shù)據(jù)和應(yīng)用經(jīng)驗,實(shí)現(xiàn)對該項技術(shù)優(yōu)劣勢的全面探索。

3.2 重排模式的構(gòu)建與斷點(diǎn)描繪 基因組的不穩(wěn)定性不斷推動著人類基因組進(jìn)化過程中突變的發(fā)生。由非等位同源重組、非同源末端鏈接、復(fù)制錯誤、長散在重復(fù)序列介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座等機(jī)制導(dǎo)致的染色體重排主要通過引起基因組劑量改變、導(dǎo)致基因破壞或融合、影響基因調(diào)控而致病[17-18]。然而,受限于分辨率以及短讀長測序無法準(zhǔn)確識別位于片段重復(fù)區(qū)的斷裂點(diǎn)等因素[19],目前在染色體重排的識別和致病性評估中,研究者主要面臨以下幾個困境:首先,常規(guī)技術(shù)對于隱匿性平衡易位以及復(fù)雜性結(jié)構(gòu)重排的檢測能力有限;其次,為了重構(gòu)重排模式,明確插入片段的方向及位置通常需要聯(lián)合應(yīng)用多項檢測手段,因此費(fèi)時費(fèi)力;最后,精確定位斷裂點(diǎn)位置,判斷斷點(diǎn)是否累及基因無疑為另一大挑戰(zhàn)。而OGM則能在單一檢測中同時應(yīng)對上述問題,目前已在科研及臨床實(shí)踐中印證了其優(yōu)勢所在。

盡管隱匿性平衡易位不引起遺傳物質(zhì)劑量改變,但其與不良孕產(chǎn)史以及不孕不育的發(fā)生息息相關(guān),且當(dāng)易位斷點(diǎn)累及基因時,可能導(dǎo)致單基因病的發(fā)生。Zhang等[20]對11對具有不良孕產(chǎn)史但核型正常的夫妻進(jìn)行了OGM檢測,在11對夫妻中均檢出了隱匿性平衡性染色體重排。Wang等[21]則應(yīng)用OGM對9例生育能力低下的平衡易位攜帶者進(jìn)行了分析,3例病例中發(fā)現(xiàn)易位斷點(diǎn)累及了男性不育相關(guān)基因。此外,研究者還利用OGM診斷了首例平衡易位斷點(diǎn)累及FBN1基因?qū)е埋R凡氏綜合征的病例[22]。上述研究均提示,作為診斷隱匿性平衡易位的有力工具,OGM在植入前遺傳學(xué)檢測以及新發(fā)隱匿性平衡易位的致病性評估等方面大有助益。

復(fù)雜性染色體重排(complex chromosomal rearrangement,CCR)指累及至少兩條染色體,存在三個或以上斷點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)異常[23]。OGM不僅能有效檢出CCR,而且能提供重排模式及斷點(diǎn)信息。如有研究報道,1例有不良孕產(chǎn)史的孕婦本人及本次妊娠胎兒進(jìn)行OGM檢測,發(fā)現(xiàn)孕婦存在6號、12號和15號染色體之間的CCR,并明確了易位片段插入的位置及方向,為患者的遺傳咨詢和再次妊娠指導(dǎo)提供了詳細(xì)的遺傳信息[24]。另有研究團(tuán)隊對1例確診為家族性腺瘤性息肉病但無法明確遺傳學(xué)病因的患者進(jìn)行了OGM檢測,結(jié)果提示患者5號和10號染色體之間發(fā)生了CCR,其中5號染色體1處斷點(diǎn)位于APC基因內(nèi)部,導(dǎo)致基因破壞、mRNA表達(dá)下調(diào)而致病[25]。由此可見,OGM為一站式識別CCR、重構(gòu)基因組結(jié)構(gòu)提供了新思路。

3.3 特定動態(tài)突變疾病的診斷 OGM的另一應(yīng)用熱點(diǎn)為利用其進(jìn)行特定動態(tài)突變疾病,如面肩肱型肌營養(yǎng)不良(facioscapulohumeral muscular dystrophy,FSHD)1型以及脆性X染色體綜合征(Fragile X syndrome,FXS)全突變的診斷。FSHD 1型是一種由于4q35區(qū)帶D4Z4重復(fù)單元缺失導(dǎo)致的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病。該病發(fā)病年齡、病程及疾病嚴(yán)重程度差異較大,并具有不完全外顯性,其外顯率隨年齡增長和重復(fù)單元的縮短而升高[26]。目前對于FSHD 1型的診斷仍主要依靠Southern印記雜交,然而該方法對實(shí)驗人員技術(shù)要求較高且僅能進(jìn)行半定量分析。而OGM通過可視化光學(xué)圖譜則能對D4Z4重復(fù)單元進(jìn)行直觀的描繪,其優(yōu)勢主要在于其能區(qū)分4qA、4qB單倍型,并避免10q26同源序列的干擾;此外,OGM能準(zhǔn)確定量D4Z4重復(fù)單元數(shù)目,區(qū)分嵌合體突變;再者,其自動化、高通量等特點(diǎn)極大地提高了檢測效率[27]。目前已有多項研究以Southern印記法為對比,驗證了OGM在FSHD 1型診斷中的應(yīng)用價值[28-29]。

過去十余年間,CMA一直作為一線檢測手段被用于發(fā)育遲緩、智力障礙、自閉癥譜系障礙患者遺傳學(xué)病因的診斷[30]。而對于男性患兒,除對CNV的檢測外,還需結(jié)合臨床表型考慮聯(lián)合進(jìn)行FXS的診斷[31]。因此,一項能同時實(shí)現(xiàn)CNV和FXS檢測的技術(shù)無疑能為該類疾病的診斷提供便利,縮短診斷周期,減輕對患者家庭的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。OGM通過測量FMR1基因組上相鄰標(biāo)記的距離,能實(shí)現(xiàn)對大于200個CGG重復(fù)單元數(shù)目的定量,從而實(shí)現(xiàn)FXS的診斷。盡管目前鮮有相關(guān)應(yīng)用報道,但結(jié)合OGM的檢測范圍和技術(shù)優(yōu)勢,其在未來或許能夠成為該類疾病診斷的新策略。

3.4 罕見遺傳變異的挖掘 盡管近半個世紀(jì)以來各項遺傳檢測技術(shù)的出現(xiàn)不斷為遺傳病診斷帶來新突破,目前仍有約半數(shù)遺傳病無法得到診斷。究其根本,除部分遺傳變異與疾病之間的關(guān)聯(lián)尚未明確外,現(xiàn)有檢測手段的技術(shù)局限性同樣為研究者無法進(jìn)一步探索的原因之一。而OGM的出現(xiàn)則填補(bǔ)了目前常規(guī)綜合性遺傳檢測技術(shù)的技術(shù)盲區(qū),為罕見遺傳變異的識別帶來了新機(jī)遇。考慮到OGM作為細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)其檢測能力及精度受標(biāo)簽分布及標(biāo)記的影響,因而其無法識別堿基序列,亦無法實(shí)現(xiàn)單核苷酸變異的診斷,且對于部分OGM檢出的插入及缺失,若能得到測序技術(shù)的輔助,則能精準(zhǔn)定位變異所處的位置和累及的范圍,從而對變異致病性進(jìn)行更全面的評估。目前認(rèn)為,聯(lián)合應(yīng)用OGM與二代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS),對全面覆蓋檢測范圍,提高罕見遺傳變異檢出率具有重要的意義。研究人員對50例遺傳病因不明的病例(其中23例家系外顯子測序陰性,42例CMA陰性),利用OGM聯(lián)合NGS為其中20例病例提供了診斷,并為另外18例受試者找到了候選變異,證實(shí)了OGM在罕見遺傳病診斷中的價值[32]。

4 總結(jié)與展望

作為新一代細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),OGM以其高分辨率以及其它技術(shù)無法媲美的長讀長,近年來在遺傳病診斷領(lǐng)域已展現(xiàn)出其巨大潛力。盡管在SV的全面檢測、明確重排模式、定位斷裂點(diǎn)區(qū)間、同時提供FSHD 1型和FXS的診斷以及深入挖掘罕見遺傳病病因中優(yōu)勢顯著,其同樣存在進(jìn)一步完善的空間。一方面,OGM在著絲粒區(qū)以及大片段復(fù)雜重復(fù)序列的組裝中尚存困難;另一方面,目前OGM對樣本要求較高,且通量有待進(jìn)一步提升;此外,其檢測效能和穩(wěn)定性仍需更多研究數(shù)據(jù)的積累。2022年5月,T2T聯(lián)盟完成了第一個無間隙的人類基因組[33],若今后OGM能以T2T為參考基因組組裝,完成算法的優(yōu)化升級,相信能取得進(jìn)一步突破。