血清淀粉樣蛋白A1基因rs12218位點(diǎn)多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系▲

龍 穎 許雪清 韋麗娟 覃素梅 鄒 格 徐鈺鈞 秦和平

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,廣西柳州市 545006)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球常見(jiàn)的慢性肝病之一,患病率約為25%,可導(dǎo)致代謝相關(guān)并發(fā)癥、肝硬化甚至肝癌,嚴(yán)重威脅人類生活質(zhì)量[1-2]。NAFLD是代謝應(yīng)激性肝損傷的表現(xiàn),與遺傳易感性、胰島素抵抗、代謝綜合征、2型糖尿病、動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病等密切相關(guān)[3]。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)主要在肝臟合成,是一個(gè)包含SAA1、SAA2、SAA3和SAA4 4種同源體的高度異質(zhì)性蛋白家族,功能尚未完全明確,與代謝綜合征、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。在人體中,4種SAA同源體對(duì)應(yīng)的4個(gè)編碼基因位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)5帶1亞帶(11p15.1),總長(zhǎng)度約150 Kb,其中SAA1基因編碼SAAl蛋白。有研究表明,SAA1基因rs12218位點(diǎn)多態(tài)性與脂質(zhì)代謝紊亂[5]、心肌梗死[6]、冠心病[7]和缺血性腦卒中[8]等多種疾病的發(fā)生有關(guān),但其與NAFLD的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)告。故本研究探討SAA1基因rs12218位點(diǎn)多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6月至2021年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院就診的74例NAFLD患者作為觀察組,另選取同期在我院體檢的126例健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)性別不限;(2)年齡≥18歲;(3)NAFLD患者的診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(4)所有研究對(duì)象均同意參加本研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、酒精性肝病(每日飲酒量男性>20 g/L、女性>10 g/L)、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝病等其他慢性肝病;(2)繼發(fā)于營(yíng)養(yǎng)不良、藥物、代謝性疾病等的脂肪肝;(3)合并惡性腫瘤;(4)合并嚴(yán)重神經(jīng)及精神性疾病;(5)合并心、肺、腎、腦等重要臟器嚴(yán)重疾病。本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集:收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、身高、體重,并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)。體質(zhì)指數(shù)=體重(kg)/身高2(m2)。

1.2.2 血清SAA1、C反應(yīng)蛋白及生化指標(biāo)水平的檢測(cè):在研究對(duì)象體檢或首次就診時(shí),采集其清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血10 mL,取5 mL置于無(wú)菌的EDTA抗凝管,保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于提取基因組DNA;將其余5 mL置于生化管,室溫下以560 r/min離心20 min,留取上清液。采用ELISA檢測(cè)血清SAA1水平,檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào):ml851423-J),所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀(Roche公司)檢測(cè)血清C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、肌酐、尿素氮、尿酸、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、ALT、AST水平,檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司(貨號(hào)均為61709901)。

1.2.3 SAA1基因rs12218位點(diǎn)基因型的檢測(cè):將置于無(wú)菌的EDTA抗凝管且保存在-80 ℃超低溫冰箱備用的5 mL外周靜脈血取出,迅速將其置于37 ℃水浴鍋進(jìn)行解凍。采用購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒(批號(hào):DP329)提取基因組DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性(電泳條帶清晰可見(jiàn),無(wú)明顯降解,且無(wú)RNA污染,即為完整性良好,見(jiàn)圖1)。采用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度(OD260/280介于1.8～2.0,OD260/230≥2.0,即為純度良好)。將完整度、純度良好的DNA提取物于-20 ℃保存。由Life Technologies公司設(shè)計(jì)并合成引物,上游引物序列為GCCCCATTCATTGGCAGCCTGATCA,下游引物序列為GCCCCATTCATTGGCAGCCTGATCG。采用SNaPshot熒光探針?lè)z測(cè)SAA1基因rs12218位點(diǎn)單核苷酸序列(探針序列為GCCATGGTGCGGAGGACTCGCTGGC)。反應(yīng)體系包括2×PCR Mix 5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.1 μL、下游引物(10 μmol/L)0.1 μL、熒光探針(10 μmol/L)0.2 μL、無(wú)酶水3.6 μL、gDNA 1 μL,總共10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)自帶軟件解讀分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象一般資料及血清SAA1、CRP、生化指標(biāo)水平的比較 觀察組的體質(zhì)指數(shù)及血清CRP、三酰甘油、尿酸、ALT水平均高于對(duì)照組,而HDL-C水平低于對(duì)照組(均P<0.05)。兩組研究對(duì)象的性別、年齡及血清SAA1、總膽固醇、LDL-C、肌酐、尿素氮、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、AST水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料及血清SAA1、CRP、生化指標(biāo)水平的比較

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)結(jié)果 觀察組及對(duì)照組SAA1基因rs12218位點(diǎn)的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=5.736、4.486,P=0.057、0.106)。

2.3 SAA1基因rs12218位點(diǎn)的等位基因與NAFLD的相關(guān)性 SAA1基因rs12218位點(diǎn)的等位基因?yàn)門(mén)、C。兩組SAA1基因rs12218位點(diǎn)的等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中C等位基因會(huì)增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[OR=2.170(95%CI:1.330,3.543)]。見(jiàn)表2。

表2 SAA1基因rs12218位點(diǎn)的等位基因與NAFLD的相關(guān)性[n(%)]

2.4 SAA1基因rs12218位點(diǎn)的基因型與NAFLD的相關(guān)性 SAA1基因rs12218位點(diǎn)有TT、TC、CC 3種基因型。在共顯性模型中,相比于TT基因型,TC基因型會(huì)增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[OR=2.541(95%CI:1.400,4.613)];在顯性模型中,相比于TT基因型,TC/CC基因型會(huì)增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[OR=2.671(95%CI:1.477,4.830)]。見(jiàn)表3。

表3 SAA1基因rs12218位點(diǎn)的基因型與NAFLD的相關(guān)性

3 討 論

NAFLD在不同種族、不同年齡的人群中均可發(fā)病,但患病率、嚴(yán)重程度等存在顯著差異,造成這些差異的原因尚未完全清楚。有研究顯示,NAFLD與“多重打擊”有關(guān),炎癥反應(yīng)是其發(fā)生的核心環(huán)節(jié)[10]?！岸嘀卮驌簟睂W(xué)說(shuō)認(rèn)為,NAFLD是機(jī)體在發(fā)生胰島素抵抗時(shí),由細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子大量釋放、脂肪毒性等多重因素共同引起廣泛的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死[11]。同時(shí),已有研究表明,NAFLD的發(fā)生、發(fā)展與多種基因多態(tài)性密切相關(guān),如磷脂酶域3基因多態(tài)性[12]、跨膜蛋白6超家族成員2基因多態(tài)性[13]、膜結(jié)合O-酰基轉(zhuǎn)移酶7基因多態(tài)性[14],但尚不能完全解釋NAFLD的發(fā)病機(jī)制。探討NAFLD的易感基因及基因多態(tài)性,有助于闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制,從而為NAFLD新藥研發(fā)、分子遺傳學(xué)預(yù)警、預(yù)測(cè)模型建立等提供依據(jù)。

Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)SAA1基因 rs12218位點(diǎn)的C等位基因會(huì)增加缺血性腦卒中及大動(dòng)脈粥樣硬化的易感性。Wang等[6]發(fā)現(xiàn),心肌梗死患者SAA1基因 rs12218位點(diǎn)的CC+CT基因型分布頻率顯著高于健康人群,因此認(rèn)為SAA1基因 rs12218位點(diǎn)多態(tài)性可能與心肌梗死的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,觀察組與對(duì)照組的SAA1基因rs12218位點(diǎn)的等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中C等位基因會(huì)增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);在共顯性模型中,攜帶TC雜合子基因型的個(gè)體罹患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶TT純合子基因型的個(gè)體;在顯性模型中,攜帶TC/CC基因型的個(gè)體罹患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶TT基因型的個(gè)體。這提示SAA1基因rs12218位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)可用于NAFLD高危群體的篩查、患病相關(guān)基因的鑒定、分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等方面。

SAA可引起全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),在創(chuàng)傷、感染性疾病、代謝性疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。SAA難溶于水,需通過(guò)與HDL-C結(jié)合溶解于血液循環(huán)中[16]。但在炎癥狀態(tài)下,白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)刺激肝細(xì)胞大量分泌SAA并釋放入血液,使血液中的SAA水平顯著升高[17],SAA可以取代載脂蛋白A1,與HDL-C結(jié)合,從而損傷HDL-C的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常HDL-C顆粒相比,SAA-HDL顆粒與平滑肌細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合能力明顯增強(qiáng),這可能與SAA的C端第78～104位氨基酸的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)[19]。還有研究表明,SAA可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟,使內(nèi)皮細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞系中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-23等多種炎癥因子的表達(dá)上調(diào),從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)[20-21]。本研究結(jié)果顯示,與健康人群相比,NAFLD患者血清CRP水平升高,HDL-C水平下降(均P<0.05),但兩組血清SAA1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析其原因:(1)盡管基因編碼區(qū)域及非編碼區(qū)域的單核苷酸基因多態(tài)性均與疾病的發(fā)生有關(guān)[22],但SAA1基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,rs12218位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域,當(dāng)rs12218位點(diǎn)的核苷酸T被C取代時(shí),其氨基酸序列并未發(fā)生明顯變化,故該位點(diǎn)基因多態(tài)性不會(huì)導(dǎo)致SAA1水平的差異。(2)在預(yù)測(cè)重型/危重型新型冠狀病毒肺炎時(shí),SAA的敏感度為100%,特異度高于CRP[23],但目前研究認(rèn)為NAFLD是慢性炎癥性疾病[24],可能在NAFLD患者的診斷中,CRP的敏感性高于SAA。(3)本研究測(cè)定的是血清SAA1水平,未測(cè)定血清總SAA水平,SAA發(fā)揮功能作用的主要組分是SAA1和SAA2,但二者在各類的疾病炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用的大小尚未見(jiàn)報(bào)告,SAA2是否在NAFLD的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,NAFLD的發(fā)生與血清SAA1水平無(wú)明顯相關(guān)性,但SAA1基因rs12218位點(diǎn)多態(tài)性與NAFLD相關(guān),SAA1基因rs12218位點(diǎn)的C等位基因、TC基因型、TC/CC基因型可能會(huì)增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),這或許可為NAFLD的防治提供了新思路。