■ 劉莉莉 陳 敏

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

乳腺炎被定義為乳腺感染和炎癥，是一種常見的疾病，它不僅對婦女健康構(gòu)成威脅，也嚴(yán)重影響奶牛泌乳能力和乳品質(zhì)，導(dǎo)致乳品行業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳腺炎可由多種微生物引起，包括革蘭氏陽性病原體（如金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性病原體（如大腸桿菌）[1-2]。這些細(xì)菌可以通過乳頭管侵入乳腺，導(dǎo)致乳腺炎癥。脂多糖（LPS）是大腸桿菌細(xì)胞壁外膜具有的內(nèi)毒素，被鑒定為乳腺炎的重要毒力因子，它可以使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫原性反應(yīng)[3-4]。Toll 樣受體4（TLR4）是一種跨膜蛋白，可以直接識別LPS，已被證明不僅是抵御病原體入侵的第一道防線，也是識別核因子κB（NF-κB）信號通路上游配體的重要受體[5]。NF-κB信號通路在乳腺炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用[6]。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB 與其抑制蛋白IκBα結(jié)合，以無活性的三聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到病毒、細(xì)菌、LPS 等外界刺激時(shí)，IκBα蛋白發(fā)生磷酸化和泛素化，NF-κB從三聚體中游離、活化，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核中，與炎性因子如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等目標(biāo)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子的轉(zhuǎn)錄合成及表達(dá)。同時(shí)這些炎性因子的釋放又會進(jìn)一步加強(qiáng)NF-κB 的活化，使炎癥信號不斷放大，加重炎癥反應(yīng)[7]。哺乳動(dòng)物的乳腺炎如果治療不及時(shí)或不徹底，很難恢復(fù)正常泌乳狀態(tài)，并且有復(fù)發(fā)和乳腺膿腫的風(fēng)險(xiǎn)。因此，抗炎處理對于乳腺炎的治療非常重要。雖然臨床上使用抗生素可以殺死致病微生物，但對于一些耐藥菌株仍然沒有可靠和有效的治療方法。

中藥源自天然并具有毒副作用小、不產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，而且越來越多的天然藥物被確認(rèn)具有抗炎、抗癌和抗衰老等功能。漏蘆來源于菊科植物祁州漏蘆[Rhaponticum uniflorum(L.) DC.]的干燥根，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、鎮(zhèn)痛、抗缺氧、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等[8]。然而，目前關(guān)于漏蘆能否抑制乳腺炎的研究未見報(bào)道。本研究以LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞為體外炎癥模型，旨在探討漏蘆乙醇提取物對LPS 誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的抗炎作用及其潛在機(jī)制，為天然藥物治療泌乳動(dòng)物乳腺炎的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥漏蘆，購自黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)于丹副教授鑒定為菊科藥用植物祁州漏蘆；小鼠乳腺上皮細(xì)胞（HC11），購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 主要試劑

LPS，購自Sigma 公司；MTT 法細(xì)胞活力檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640干粉、胎牛血清，購自Gibco公司；Trizol，購自Invitrogen公司；Prime ScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，購自TaKaRa 公司；IκBα、p-IκBα、NFκB p65、p-NF-κB p65 和β-actin 一抗，購自Cell Signaling Technology公司。

1.3 漏蘆提取物的制備

將祁州漏蘆剪碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮至稠膏，冷凍干燥，得到漏蘆乙醇提取物（RUEE）干品。使用前用完全培養(yǎng)基配成試驗(yàn)所需濃度，過濾除雜除菌，備用。

1.4 HC11細(xì)胞的培養(yǎng)

采用生長培養(yǎng)基（RPMI-1640+10% FBS）于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HC11 細(xì)胞，每隔24 h 更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 RUEE對HC11細(xì)胞活力的影響

試驗(yàn)分為對照（CON）組（接種細(xì)胞但不加藥處理）、不同濃度（20、40、80、160、200、240 μg/mL）RUEE 組。每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔。將處于對數(shù)生長期的HC11 細(xì)胞接種于96孔板中（1×104個(gè)/孔）培養(yǎng)過夜，更換新鮮培養(yǎng)基并添加藥物處理24 h后，各孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸出培養(yǎng)液，各孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min 后用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm的吸光度（OD）值并進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞活力的影響

試驗(yàn)分為對照（CON）組（接種細(xì)胞但不加藥處理）、LPS（1 μg/mL）組、RUEE（80 μg/mL）組以及RUEE（80 μg/mL）+LPS（1 μg/mL）組（先添加RUEE 預(yù)處理1 h 后再加入LPS）。LPS 添加濃度參考文獻(xiàn)[9-10]中的添加濃度。每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞活力檢測方法同1.5。

1.7 RUEE 對LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.6。將處于對數(shù)生長期的HC11 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，添加藥物作用24 h 后收集細(xì)胞，Trizol法提取RNA，根據(jù)Prime ScriptTMRT Reagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用qRT-PCR 試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM）檢測HC11 細(xì)胞TLR4、TNF-α、COX-2、IL-6、IL-1β基因的mRNA 表達(dá)水平。試驗(yàn)所用基因的引物序列見表1，選用β-actin 作為內(nèi)參基因。qRT-PCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt相對定量的方法計(jì)算各基因的mRNA表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.8 RUEE 對LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組及藥物處理方法同1.6，將處于對數(shù)生長期的HC11 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，添加藥物作用24 h后收集細(xì)胞體蛋白，Western blotting 方法檢測IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 22.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞活力的影響

為了檢測RUEE 對HC11 細(xì)胞是否有毒性作用，利用MTT法檢測不同濃度RUEE 對HC11細(xì)胞活力的影響。由圖1可知，20、40、80 μg/mL RUEE對HC11細(xì)胞的活力無顯著影響（P＞0.05），160、200、240 μg/mL RUEE組HC11細(xì)胞活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖1 RUEE對HC11細(xì)胞活力的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)80 μg/mL RUEE 對LPS 誘導(dǎo)HC11細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果最好，故本研究進(jìn)一步檢測了RUEE（80 μg/mL）、LPS（1 μg/mL）單獨(dú)處理以及RUEE（80 μg/mL）+LPS（1 μg/mL）共處理對HC11 細(xì)胞活力的影響。由圖2 可知，與對照組相比，LPS（1 μg/mL）、RUEE（80 μg/mL）單獨(dú)處理和RUEE（80 μg/mL）+LPS（1 μg/mL）共處理對HC11細(xì)胞活力均無顯著影響（P＞0.05），上述試驗(yàn)結(jié)果表明，1 μg/mL LPS、80 μg/mL RUEE 及二者共處理對HC11 細(xì)胞活力無影響，故后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果不受細(xì)胞活力變化的影響。后續(xù)試驗(yàn)選擇80 μg/mL RUEE 處 理HC11 細(xì) 胞，以 探 究 其 對HC11細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。

圖2 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞活力的影響

2.2 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞TLR4基因mRNA表達(dá)的影響

由圖3 可知，與對照組相比，LPS 處理后HC11 細(xì)胞TLR4mRNA相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與LPS組相比，RUEE 組顯著降低LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)（P＜0.05）。

圖3 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞TLR4基因mRNA表達(dá)的影響

2.3 RUEE 對LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞p-IκBα、IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

由圖4 可知，與對照組相比，LPS 組HC11 細(xì)胞IκBα和NF-κB p65磷酸化水平顯著提高（P＜0.05）；與LPS 組相比，RUEE 能顯著下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞IκBα和NF-κB p65磷酸化水平（P＜0.05）。

圖4 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞IκBα和NF-κB p65磷酸化的影響

2.4 RUEE 對LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1β基因mRNA表達(dá)的影響

由如圖5 可知，與對照組相比，LPS 處理后HC11細(xì)胞內(nèi)TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1βmRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，RUEE 組顯著降低LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1βmRNA的表達(dá)量（P＜0.05）。

圖5 RUEE對LPS誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞內(nèi)TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1β基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

乳腺炎的特點(diǎn)是乳腺炎癥，哺乳期婦女容易發(fā)生乳房炎，影響其健康及乳質(zhì)量。在乳制品行業(yè)，奶牛乳腺炎會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳腺中含有大量的乳腺上皮細(xì)胞，直接與入侵病原體接觸，啟動(dòng)針對病原體的免疫反應(yīng)，因此乳腺感染的嚴(yán)重程度取決于乳腺上皮細(xì)胞對主動(dòng)防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)[11]。乳腺炎常與細(xì)菌感染有關(guān)，通常用抗生素治療或預(yù)防。然而，乳中抗生素殘留會對人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，利用天然產(chǎn)品進(jìn)行控制和預(yù)防的新策略在乳房炎的防治中越來越受到重視。LPS 作為大腸桿菌細(xì)胞壁外膜的組成成分，利用其誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞建立體外炎癥模型在乳房炎的防治研究中被廣泛應(yīng)用[12-13]。本研究利用LPS 誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，探討了漏蘆醇提物對LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞的抗炎作用，結(jié)果表明，RUEE 可明顯抑制TLR4/NF-κB 通路的激活，并抑制LPS 刺激的小鼠HC11 細(xì)胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。

Toll 樣受體信號在免疫應(yīng)答各種細(xì)胞內(nèi)病原體中發(fā)揮重要作用。TLR4 作為NF-κB 的上游受體，特異性識別病原體相關(guān)分子。據(jù)報(bào)道，LPS 可通過TLR4/NF-κB 通路引起炎癥反應(yīng)[14-15]。NF-κB 被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵的作用。NF-κB 的激活不僅能誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)，還能誘導(dǎo)促炎基因（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的轉(zhuǎn)錄[16-17]。NF-κB 是一種由p65 和p50 亞基組成的二聚體，正常情況下，NF-κB 二聚體與其抑制蛋白IκBα結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[18]。不同炎癥反應(yīng)中，IκBα被磷酸化和降解，釋放NFκB，NF-κB p65 亞基暴露并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)[19]。Somensi等[20]發(fā)現(xiàn)，香芹酚可以顯著抑制LPS引起的巨噬細(xì)胞RAW 264.7 NF-κB 的活化，發(fā)揮抗炎作用。Yang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，紫草素通過抑制NF-κB 信號通路對LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎起保護(hù)作用。這些研究表明NF-κB 在LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用，因此抑制NF-κB 的激活可以緩解細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。為了更深入地了解RUEE 抑制LPS 誘發(fā)的HC11 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制，本研究檢測了RUEE 對TLR4mRNA 表達(dá)及NF-κB p65 和IκBα蛋白磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)LPS處理組HC11 細(xì)胞TLR4mRNA 表達(dá)及NF-κB p65 和IκBα磷酸化水平顯著升高；RUEE 單獨(dú)處理HC11 細(xì)胞對TLR4基因表達(dá)及NF-κB p65 和IκBα磷酸化水平無明顯影響；而RUEE 能明顯下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的TLR4mRNA水平，同時(shí)抑制了LPS刺激的NF-κB p65和IκBα的磷酸化。這些結(jié)果提示HC11 細(xì)胞在未受到LPS 外源刺激時(shí)，細(xì)胞中NF-κB 以無活性形式存在，未誘發(fā)炎癥反應(yīng)，此種狀態(tài)的HC11細(xì)胞單獨(dú)添加RUEE 對細(xì)胞中未被活化的TLR4/NF-κB 通路無顯著影響。但當(dāng)HC11 細(xì)胞受到LPS 刺激后，激活TLR4/NF-κB 通路，細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，RUEE 此時(shí)會發(fā)揮抗炎活性，明顯抑制LPS 激活的TLR4/NF-κB 信號通路，減輕HC11細(xì)胞炎癥損傷。

炎癥是機(jī)體為確保有害刺激被清除而做出的保護(hù)性反應(yīng)，也是受損組織修復(fù)治愈的過程。炎癥細(xì)胞因子在宿主防御入侵病原微生物中起著關(guān)鍵作用。乳腺炎與多種炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，包括TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1β等，被認(rèn)為是參與乳腺炎發(fā)生和發(fā)展必要的炎癥介質(zhì)[22-24]。LPS 激活的TLR4/NF-κB 通路可促進(jìn)TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放。這些促炎細(xì)胞因子在引發(fā)炎癥反應(yīng)和招募白細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）到靶位點(diǎn)方面發(fā)揮重要作用。免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足夠水平的促炎細(xì)胞因子是重要的，但過量釋放的炎性細(xì)胞因子會導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，對組織和細(xì)胞產(chǎn)生有害影響。一些植物的提取物被發(fā)現(xiàn)能緩解乳腺炎的炎癥反應(yīng)，辣木提取物能明顯降低LPS 誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA 表達(dá)，也能降低COX-2的蛋白表達(dá)[25]。瓜蔞水提物能顯著減少金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞TNF-α及IL-1β的表達(dá)[26]。研究發(fā)現(xiàn)漏蘆醇提物能以劑量依賴的方式顯著抑制LPS 刺激的巨噬細(xì)胞TNFα、IL-6和IL-1β的分泌，并能降低COX-2的mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激的HC11 細(xì)胞中 炎 癥 細(xì) 胞 因 子TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著升高，RUEE單獨(dú)處理對HC11細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的基因表達(dá)無明顯影響；但RUEE 可顯著降低LPS 誘導(dǎo)的HC11 細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNFα、COX-2、IL-6和IL-1β的mRNA 表 達(dá)。這 表 明RUEE對未受LPS刺激、未發(fā)生炎癥反應(yīng)的HC11細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)無顯著影響；但當(dāng)LPS 誘導(dǎo)HC11 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，RUEE 可以下調(diào)炎癥HC11 細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)，這些結(jié)果提示RUEE 可能通過抑制LPS 激活的TLR4/NF-κB 信號通路，進(jìn)而抑制炎癥HC11細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解HC11細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

漏蘆醇提物可通過抑制TLR4/NF-κB 通路的激活，下調(diào)相關(guān)炎性因子的過度表達(dá)而緩解LPS 誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這可能是漏蘆保護(hù)乳腺對抗感染的原因之一。