■ 龍?zhí)茣?歐陽可寒 方藝恬 陳新鋒 王成斌 李艷嬌 歐陽克蕙 邱清華*

（1.江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，營(yíng)養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南方草地研究所，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.贛州綠林灣農(nóng)牧有限公司，江西贛州 341103）

反芻動(dòng)物瘤胃中棲息的大量微生物（細(xì)菌、原蟲、真菌等）可將高纖維物質(zhì)和非蛋白氮轉(zhuǎn)化成自身維持和宿主生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作為瘤胃微生物中多樣性最高的群體，瘤胃細(xì)菌在近些年被廣泛研究和報(bào)道[1-3]。瘤胃微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)受到宿主、日糧組成和環(huán)境條件等因素的影響[4]，其中日糧因素包括日糧營(yíng)養(yǎng)水平、飼料原料類型和配比、飼料添加劑類型和劑量等。諸多研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物組成與反芻動(dòng)物的生產(chǎn)效率高度相關(guān)[5-8]。因此，從瘤胃微生物多樣性和群落組成的角度進(jìn)行探討，可以為日糧供給影響反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能提供機(jī)理層面的解釋。

賴氨酸（lysine，Lys）是反芻動(dòng)物的限制性氨基酸之一，其與蛋氨酸一同被認(rèn)為是玉米型奶牛日糧中的第一限制性氨基酸[9]。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，日糧中添加過瘤胃賴氨酸可以提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)效率、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量[10-13]。這些研究將賴氨酸的促進(jìn)作用靶點(diǎn)集中在后腸道的代謝吸收，考慮到日糧、瘤胃微生物和反芻動(dòng)物表觀生產(chǎn)性能三者之間的密切聯(lián)系，是否可以通過改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境為瘤胃微生物營(yíng)造更好的生長(zhǎng)繁殖條件，進(jìn)而合成更多宿主需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)呢？已有研究發(fā)現(xiàn)，額外添加精氨酸和谷氨酸均能改善瘤胃發(fā)酵[14]。韋肖等[15]的體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，添加0.10%和0.20%的賴氨酸可以提高瘤胃pH 和總揮發(fā)性脂肪酸的含量。然而，上述賴氨酸改善瘤胃發(fā)酵的結(jié)論是在體外條件下開展得出的，額外添加賴氨酸對(duì)瘤胃發(fā)酵改善效果如何、對(duì)瘤胃微生物是否有影響均需要進(jìn)一步探究。為此，本試驗(yàn)基于體外試驗(yàn)篩選的最佳劑量，開展體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)，探究賴氨酸對(duì)瘤胃發(fā)酵特性、微生物多樣性和群落組成的影響，以期為賴氨酸促進(jìn)瘤胃發(fā)酵的效果和機(jī)理研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用4 頭健康、體重[（336.25±16.71）kg]和年齡[（6±0.32）歲]接近且安裝永久瘤胃瘺管的錦江牛，隨機(jī)分為2 組（對(duì)照組和試驗(yàn)組），每組2 頭，采用有重復(fù)的2×2 拉丁方設(shè)計(jì)，對(duì)照組（C）飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組（L）飼喂基礎(chǔ)日糧+0.20%的Lys?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。選用的Lys 為畜禽用Lys 鹽酸鹽（飼料級(jí)，98.5%），添加量根據(jù)韋肖等[15]的梯度試驗(yàn)確定?？傇囼?yàn)期30 d，每期15 d，其中前10 d 為預(yù)試期，后5 d 為正試期。試驗(yàn)前2 個(gè)月所有試驗(yàn)牛均飼喂基礎(chǔ)日糧，單欄飼養(yǎng)，提供充足飲水，飼養(yǎng)管理均由相同飼養(yǎng)員完成；試驗(yàn)期內(nèi)除兩組日糧不同外，其他飼養(yǎng)管理均一致。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集

瘤胃內(nèi)容物樣品在正試期的第4天和第5天晨飼后2 h從瘤胃瘺管中采集。取出瘤胃內(nèi)容物后立即采用便攜式pH 計(jì)測(cè)定pH。將瘤胃內(nèi)容物過四層紗布后得到瘤胃液，分裝于5 mL 凍存管中，保存在-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)瘤胃發(fā)酵參數(shù)和瘤胃微生物的檢測(cè)。瘤胃發(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)和瘤胃微生物DNA 提取均在采樣后1周內(nèi)完成。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

瘤胃發(fā)酵參數(shù)包括pH、氨態(tài)氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸）。其中瘤胃pH 在采樣時(shí)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，NH3-N 采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]測(cè)定，MCP的濃度采用改良Lowry法[17]測(cè)定。VFA采用氣相色譜儀基于相對(duì)保留時(shí)間確定單個(gè)揮發(fā)性脂肪酸種類，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得出具體含量，儀器運(yùn)行參數(shù)采用Qiu 等[18]建立的方法。支鏈揮發(fā)性脂肪酸為異丁酸、戊酸和異戊酸之和，某種揮發(fā)性脂肪酸占比為該種揮發(fā)性脂肪酸與總揮發(fā)性脂肪酸含量之比（%）。

將同一頭牛每期2 d的瘤胃液樣品均勻混合后進(jìn)行DNA的提取，提取采用微生物DNA提取試劑盒。提取的DNA純度用1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估，濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）對(duì)瘤胃細(xì)菌V3～V4 區(qū)域片段進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。純化后的PCR 產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司采用Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量雙尾測(cè)序。原始下機(jī)數(shù)據(jù)在QIIME 2 平臺(tái)完成，具體數(shù)據(jù)處理軟件和參數(shù)設(shè)置與Wei等[19]相同。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)于瘤胃發(fā)酵參數(shù)，先將每個(gè)個(gè)體牛每期連續(xù)2 d采集的瘤胃液數(shù)據(jù)求平均后作為該個(gè)體在對(duì)應(yīng)時(shí)期的數(shù)值。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件中的一般線性模型，固定效應(yīng)為處理、時(shí)期和個(gè)體。顯著性定義為P＜0.05，趨勢(shì)顯著性規(guī)定為0.05≤P＜0.10。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃發(fā)酵特性的影響

由表2 可知，添加0.20%的賴氨酸可趨勢(shì)性提高乙酸的含量（P=0.088），微生物蛋白、丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸含量只在數(shù)值上較對(duì)照組高，但差異均不顯著（P＞0.10）。

表2 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃發(fā)酵特性的影響

2.2 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物多樣性的影響

由表3 可知，日糧添加賴氨酸顯著提高了瘤胃微生物的豐富度（Observed species,P=0.046），而對(duì)其他多樣性指數(shù)均沒有顯著影響（P＞0.05）。

表3 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物多樣性的影響

2.3 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物群落組成的影響

由表4 可知，添加賴氨酸在門水平上顯著提高了髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）的相對(duì)豐度（P=0.010），并趨勢(shì)性提高厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度（P=0.079），但對(duì)其他相對(duì)豐度高于0.1%的菌門均沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物門水平相對(duì)豐度的影響

由表5 可知，添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物屬水平上相對(duì)豐度大于1%的物種均沒有顯著影響（P＞0.05）。

表5 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物屬水平相對(duì)豐度的影響

2.4 瘤胃微生物多樣性綜合分析

相似性分析（ANOSIM）結(jié)果顯示，對(duì)照組（C）和處理組（L）的P值為0.967，說明兩組微生物差異不顯著。通過主坐標(biāo)分析（PCoA）也發(fā)現(xiàn)，C 組和L 組有明顯的聚集（見圖1），說明兩組的微生物群落差異不明顯。

圖1 瘤胃微生物基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）

3 討論

3.1 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃發(fā)酵特性的影響

日糧添加賴氨酸并未改變瘤胃發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵模式。VFA 是反芻動(dòng)物利用能量的主要形式，其含量與日糧組成、碳水化合物消化率、瘤胃微生物活性以及VFA 吸收率相關(guān)[20]。本試驗(yàn)對(duì)照組和處理組的日糧原料類型、組成比例及日糧營(yíng)養(yǎng)成分并未發(fā)生改變，用于合成VFA 的碳水化合物量也相等，因此會(huì)得到VFA 總量、單種VFA 及VFA 占比均未出現(xiàn)顯著差異。賴氨酸的添加可能通過提高部分瘤胃微生物的多樣性促進(jìn)乙酸的合成，但這種促進(jìn)作用不足以引起顯著差異，表現(xiàn)為趨勢(shì)性的提高。MCP是反芻動(dòng)物重要的氨基酸來源，其含量高低與碳水化合物類型、微生物組成和活性相關(guān)[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加賴氨酸組的MCP 濃度只在數(shù)值上高于對(duì)照組，這可能是賴氨酸的添加對(duì)微生物活性提高不大，瘤胃微生物多樣性的提高不足以促進(jìn)MCP的合成。瘤胃pH是衡量瘤胃發(fā)酵環(huán)境的重要指標(biāo)，過高或太低都會(huì)降低瘤胃微生物對(duì)底物的利用效率[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加賴氨酸并未改變瘤胃pH，只在數(shù)值上略微低于對(duì)照組，這可以從數(shù)值上較高的總VFA 和較低的NH3-N 含量間接得到印證。

3.2 日糧添加賴氨酸對(duì)瘤胃微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

日糧添加賴氨酸提高了瘤胃微生物多樣性，改變了部分瘤胃微生物的相對(duì)豐度。瘤胃微生物Observed species 是一個(gè)衡量微生物多樣性中豐富度的指標(biāo)，該指標(biāo)數(shù)值越大，代表微生物多樣性越高。添加賴氨酸提高了瘤胃微生物的Observed species，說明賴氨酸的添加可以提高瘤胃微生物的多樣性，但其具體的促進(jìn)機(jī)制仍需通過多組學(xué)聯(lián)合分析來進(jìn)一步揭示。髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）是地下水中常見的微生物門類，對(duì)不利環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力[23]。添加賴氨酸提高了該門的相對(duì)豐度，暗示賴氨酸的添加可能會(huì)增強(qiáng)動(dòng)物的抗逆能力。擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃微生物中相對(duì)豐度最高的兩個(gè)門類，在本試驗(yàn)中分別占比66.34%和26.30%。添加賴氨酸均未顯著影響這兩個(gè)門類的相對(duì)豐度，只厚壁菌門的相對(duì)豐度趨勢(shì)性高于對(duì)照組。出現(xiàn)厚壁菌門在賴氨酸添加組的相對(duì)豐度較高的原因與該組的瘤胃pH 較低有關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)低瘤胃pH 環(huán)境中的厚壁菌門在瘤胃細(xì)菌中的占比較高[24]。

4 結(jié)論

① 日糧添加0.20%的Lys不影響瘤胃發(fā)酵特性。② 日糧添加0.20%的Lys 會(huì)改變瘤胃微生物多樣性和部分菌門的相對(duì)豐度。