■ 凌 翀 于曉蕾 曹慶云 葉 慧 馮定遠(yuǎn) 左建軍 王偉唯

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510630)

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium，S.typhimurium）屬于沙門(mén)氏菌種屬（Salmonellaspp.），是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性人畜共患病原菌[1]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)動(dòng)物具有極其廣泛的致病性并且能夠在動(dòng)物產(chǎn)品（肉、蛋、奶等）中長(zhǎng)期存活，對(duì)畜禽養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生安全具有重大威脅。與宿主上皮細(xì)胞的黏附是沙門(mén)氏菌感染起始也是最關(guān)鍵的一步，這種黏附通過(guò)細(xì)胞膜上的受體與細(xì)菌表面存在的多種黏附因子（菌毛和黏附素等）的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[2]。STM0306（又稱(chēng)PagN）是鼠傷寒沙門(mén)氏菌的黏附素之一，STM0306基因的表達(dá)主要受PhoP/PhoQ 雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，PhoP/PhoQ是沙門(mén)氏菌重要的二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[3]。

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）是一類(lèi)具有益生元活性的短鏈聚合物，是一種功能性寡糖，能夠通過(guò)動(dòng)物腸道細(xì)菌（如雙歧桿菌）對(duì)其代謝所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）對(duì)腸道健康進(jìn)行調(diào)控[4]。研究表明，XOS 具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善腸道形態(tài)、改善腸道微生物組成和促進(jìn)激素分泌等多種功能[5-7]。雖然關(guān)于XOS 在動(dòng)物生產(chǎn)上的研究已有大量報(bào)道，然而，其對(duì)畜禽致病菌毒力影響方面的研究仍較少。已有研究表明[8]，XOS能夠抑制李斯特菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附并下調(diào)其黏附相關(guān)基因inlA和lap的表達(dá)。本研究利用豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2 為模型，探究XOS 對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附宿主腸道上皮細(xì)胞的影響，通過(guò)qRT-PCR對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步探索XOS調(diào)控鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素基因表達(dá)的機(jī)制，為XOS在畜禽養(yǎng)殖中沙門(mén)氏菌感染的緩解提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑：低聚木糖（純度≥95%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

細(xì)菌培養(yǎng)：鼠傷寒沙門(mén)氏菌野生型菌株（ATCC14028），購(gòu)自廣東省微生物食品安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；LB 肉湯培養(yǎng)基、技術(shù)瓊脂粉和一次性細(xì)菌培養(yǎng)皿，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BIOG 細(xì)菌RNA 提取試劑盒，購(gòu)自常州百代生物科技股份有限公司；HiScript?Ⅱ Reverse Transcriptase（R222）和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711），購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠傷寒沙門(mén)氏菌特異性引物，購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；鎂濃度檢測(cè)試劑盒（微量法），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)：IPEC-J2 豬小腸上皮細(xì)胞系由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院印遇龍?jiān)菏空n題組饋贈(zèng)；高糖DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gbico）和無(wú)菌PBS（美國(guó)Hyclone），購(gòu)自廣州致邦生物有限公司；胰酶、雙抗、胎牛血清（美國(guó)Gibco），購(gòu)自廣州昂科生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning），購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)菌黏附能力的測(cè)定

1.2.1 XOS、細(xì)菌、細(xì)胞共孵育黏附試驗(yàn)

在12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種IPEC-J2 細(xì)胞，置于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)，更換培養(yǎng)基，加入PBS 洗滌三次后的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液（1×109CFU/mL，MOI=100），同時(shí)在培養(yǎng)基中加入XOS 至總濃度為20 mg/mL，對(duì)照組加入等體積PBS，37 ℃孵育1 h 后PBS 洗滌三次以去除未黏附的細(xì)菌，加入1 mL 1%Triton-100 常溫30 min 裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液充分吹打混勻后進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)瓊脂平板倒板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算黏附細(xì)菌總數(shù)量。

1.2.2 XOS預(yù)處理細(xì)菌、細(xì)胞黏附試驗(yàn)

黏附試驗(yàn)方法同上，鼠傷寒沙門(mén)氏菌與IPEC-J2細(xì)胞均用20 mg/mL XOS進(jìn)行預(yù)處理，處理方法如下。

細(xì)菌預(yù)處理：在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中加入總濃度為20 mg/mL 的XOS 溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，置于37 ℃空氣搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行后續(xù)處理。

細(xì)胞預(yù)處理：待12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，棄培養(yǎng)基并用PBS 洗滌細(xì)胞一次，加入新鮮培養(yǎng)基，并加入總濃度為20 mg/mL 的XOS 溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，輕搖混勻后置于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 qRT-PCR

培養(yǎng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌并用20 mg/mL XOS 對(duì)菌液進(jìn)行處理，對(duì)照組加入等體積PBS。待細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)BIOG 細(xì)菌RNA 提取試劑盒提取鼠傷寒沙門(mén)氏菌總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，采用表1所示體系進(jìn)行qRT-PCR，以鼠傷寒沙門(mén)氏菌DNA 消旋酶亞基基因gyrA（DNA gyrase subunit A）作為內(nèi)參，對(duì)獲得的信號(hào)、數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的比值以反映其表達(dá)豐度。引物信息見(jiàn)表2。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系

表2 引物序列

1.4 pH測(cè)定

培養(yǎng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌并添加20 mg/mL XOS 溶液，置于37 ℃空氣搖床220 r/min 培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)定一次細(xì)菌培養(yǎng)液的pH，測(cè)定前將菌液進(jìn)行離心以分離菌體與培養(yǎng)液。

1.5 Mg2+濃度測(cè)定

培養(yǎng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌并添加20 mg/mL XOS 溶液，置于37 ℃空氣搖床220 r/min 培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)定一次培養(yǎng)液中的Mg2+濃度，離心后通過(guò)鎂濃度檢測(cè)試劑盒（微量法）測(cè)定Mg2+濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 21.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組之間的差異使用Duncan’s多重比較法進(jìn)行檢驗(yàn)。*表示組間差異顯著（P＜0.05）；**表示組間差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 XOS 共孵育對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附IPEC-J2 細(xì)胞的影響

如圖1 所示，與未加X(jué)OS 組相比，XOS 共孵育能夠極顯著抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的黏附（P＜0.01）。在共孵育處理體系中，XOS、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和IPEC-J2 細(xì)胞三者同時(shí)存在，表明XOS 能通過(guò)影響鼠傷寒沙門(mén)氏菌與IPEC-J2 細(xì)胞之間的互作來(lái)抑制其對(duì)細(xì)胞的黏附作用。

圖1 XOS共孵育對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附IPEC-J2細(xì)胞的影響（n=6）

2.2 XOS 預(yù)處理對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附IPEC-J2 細(xì)胞的影響

為探究XOS 單獨(dú)處理細(xì)菌與細(xì)胞對(duì)細(xì)菌黏附的影響作用，通過(guò)20 mg/mL XOS 分別對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和IPEC-J2 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)定細(xì)菌黏附能力。結(jié)果如圖2 所示，與未加X(jué)OS 組相比，XOS 預(yù)處理的鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的黏附能力顯著降低（P＜0.01）；XOS 預(yù)處理IPEC-J2 細(xì)胞組雖然未達(dá)到顯著性（P＞0.05），但是黏附細(xì)菌數(shù)量在數(shù)值上有一定的降低；另外設(shè)置共孵育處理組，結(jié)果與2.1相同。表明除了參與細(xì)菌與細(xì)胞間的互作外，XOS 還能夠通過(guò)影響鼠傷寒沙門(mén)氏菌本身從而抑制其對(duì)細(xì)胞的黏附能力。

圖2 XOS預(yù)處理對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附IPEC-J2細(xì)胞的影響（n=3）

2.3 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素基因表達(dá)的影響

為了探究XOS 對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附能力的影響是否與其黏附素基因的表達(dá)量變化有關(guān)，進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果如圖3 所示。通過(guò)基因篩選，發(fā)現(xiàn)XOS 極顯著下調(diào)了鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素STM0306基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量（P＜0.01）（無(wú)顯著性變化的基因結(jié)果未展示）。表明XOS可能通過(guò)影響鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306基因表達(dá)進(jìn)而影響其的黏附能力。

圖3 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素基因表達(dá)的影響（n=6）

2.4 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液pH的影響

鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306基因的表達(dá)受PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，該調(diào)控系統(tǒng)的活性主要受菌體細(xì)胞膜外的pH、Mg2+濃度和抗菌肽濃度的影響。由于XOS 單獨(dú)處理細(xì)菌的體系并不涉及宿主細(xì)胞，因此，在該體系中，PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)的活性主要取決于培養(yǎng)環(huán)境中的pH和Mg2+濃度。

為了探究XOS 調(diào)控STM0306基因表達(dá)的機(jī)制，我們測(cè)定了XOS 處理后菌液中的pH，結(jié)果如圖4 所示，XOS 處理組的pH 在2 h 和4 h 均 顯 著低于未加X(jué)OS組（P＜0.05）。

圖4 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液pH的影響（n=3）

2.5 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液中Mg2+濃度的影響

通過(guò)微量法測(cè)定了XOS 處理后菌液中的Mg2+濃度，結(jié)果如圖5所示，XOS處理組培養(yǎng)基中的Mg2+濃度在2～6 h 均低于對(duì)照組，且在4 h 達(dá)到了顯著性（P＜0.05）。表明XOS 可能通過(guò)影響細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境的pH和Mg2+濃度調(diào)控PhoP/PhoQ 雙組分系統(tǒng)的活性，進(jìn)而影響下游STM0306基因的表達(dá)。

圖5 XOS對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液中Mg2+濃度的影響（n=3）

3 討論

3.1 低聚糖對(duì)病原菌黏附的抑制作用

病原菌對(duì)宿主腸道上皮細(xì)胞的黏附主要取決于菌體表面分布的多種菌毛及黏附素，這種黏附過(guò)程是通過(guò)宿主細(xì)胞上的受體與黏附素之間的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。迄今為止，已有大量研究表明益生性低聚糖能夠抑制病原菌黏附宿主腸道上皮細(xì)胞，包括乳果糖[9]、低聚半乳糖[10]、殼寡糖[11]和甘露寡糖[12]等。由于低聚糖在一些理化性質(zhì)上與某些細(xì)菌黏附素或細(xì)胞膜受體具有相似性，因此低聚糖對(duì)黏附的抑制作用可能是由于低聚糖參與了病原菌和宿主腸上皮細(xì)胞的互作。

3.2 XOS 下調(diào)鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306 基因表達(dá)并抑制其對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附

XOS 是通過(guò)木聚糖酶分解富含木聚糖的植物，再進(jìn)行分離純化得到的一類(lèi)非消化性低聚糖，主要由木二糖～木六糖組成[13]。XOS 作為寡糖之一，同樣有抑制病原菌黏附上皮細(xì)胞的作用。Ebersbach 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加20 mg/mL XOS 能夠顯著抑制李斯特菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附，并顯著降低李斯特菌黏附素基因inlA和lap表達(dá)。為了探究XOS 是否同樣有干預(yù)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素表達(dá)抑制其黏附宿主腸道上皮細(xì)胞的能力，本試驗(yàn)將20 mg/mL XOS、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和IPEC-J2 細(xì)胞進(jìn)行共孵育，結(jié)果顯示黏附的鼠傷寒沙門(mén)氏菌數(shù)量顯著降低。為了探究XOS 抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附的作用方式（即XOS影響細(xì)菌、XOS 影響細(xì)胞或XOS 影響細(xì)菌與細(xì)胞互作），分別對(duì)細(xì)菌與細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示XOS預(yù)處理的鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的黏附數(shù)量顯著降低，且預(yù)處理細(xì)胞同樣能降低細(xì)菌黏附數(shù)量，但未達(dá)到顯著性差異。說(shuō)明XOS 不僅影響細(xì)菌與細(xì)胞互作，還能夠通過(guò)直接影響細(xì)菌從而抑制細(xì)菌黏附細(xì)胞。qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)，XOS 處理的鼠傷寒沙門(mén)氏菌中黏附素STM0306的基因表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明XOS 可能通過(guò)干預(yù)鼠傷寒沙門(mén)氏菌黏附素表達(dá)從而抑制其黏附能力。

3.3 XOS 下調(diào)鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306 基因表達(dá)的機(jī)制探究

本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了XOS 抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306基因表達(dá)可能的分子機(jī)制。鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306基因的表達(dá)主要由PhoP/PhoQ 雙組分系統(tǒng)調(diào)控。PhoP/PhoQ 是沙門(mén)氏菌重要的調(diào)控系統(tǒng)，由兩部分組成，分別是跨膜的組氨酸蛋白激酶PhoQ 和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)控蛋白PhoP，當(dāng)細(xì)菌處于特定刺激時(shí)，PhoQ 細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的組氨酸殘基發(fā)生二聚體內(nèi)反式自磷酸化，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)蛋白PhoP 的天冬氨酸殘基上，獲得磷酸基團(tuán)的PhoP 蛋白構(gòu)型發(fā)生改變從而具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性[14]，與DNA 結(jié)合以促進(jìn)活化和抑制基因的表達(dá)[15]。PhoP/PhoQ 雙組分系統(tǒng)的活性主要受Mg2+濃度、pH和抗菌肽影響，外界微環(huán)境這些因素的變化都能導(dǎo)致PhoP/PhoQ 的激活或抑制。Mg2+能夠與PhoQ 的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使其蛋白構(gòu)象改變使其去磷酸化[16]（見(jiàn)圖6），因此，高濃度(1 mmol/L)的Mg2+能夠抑制PhoQ 活性，而低濃度(8 μmol/L)能夠誘導(dǎo)PhoQ發(fā)生自磷酸化啟動(dòng)下游信號(hào)傳遞過(guò)程[17]?？咕呐cPhoQ 的作用機(jī)制類(lèi)似于Mg2+，二者均能與PhoQ周質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合導(dǎo)致其構(gòu)象改變，不同的是，抗菌肽的結(jié)合只激活PhoP/PhoQ 雙組分系統(tǒng)而不會(huì)抑制[18]，且其與PhoQ 的親和力要遠(yuǎn)大于Mg2+[3]。低pH也是PhoQ 的激活信號(hào)之一，該激活過(guò)程依賴(lài)于PhoQ 傳感域酸性殘基的構(gòu)象變化，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。

圖6 鼠傷寒沙門(mén)氏菌PhoP/PhoQ調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)菌外環(huán)境中的pH 和Mg2+濃度，結(jié)果顯示，XOS 處理組細(xì)菌培養(yǎng)基的pH 顯著低于對(duì)照組，Mg2+濃度顯著高于對(duì)照組。其中，XOS 降低pH 的結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致，XOS 能夠降低動(dòng)物腸道的pH，這可能跟細(xì)菌利用XOS 產(chǎn)生的SCFAs 有關(guān)[4]，然而，大量研究表明，SCFAs 是通過(guò)雙歧桿菌等細(xì)菌代謝XOS產(chǎn)生，對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌是否同樣能夠代謝XOS 產(chǎn)生SCFAs 仍未有定論。雖然pH 的降低對(duì)PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)起激活作用，然而，Prost 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，低pH 是1 mmol/L Mg2+存在下PhoQ 的激活信號(hào)，本試驗(yàn)中的Mg2+濃度相比于1 mmol/L 濃度是偏低的，因此，在本試驗(yàn)的Mg2+濃度條件下，pH 的降低并不會(huì)激活PhoQ，即pH 降低的激活信號(hào)有可能被Mg2+升高的抑制信號(hào)所覆蓋，Nú?ez-Hernández 等[19]也提到，PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)三種刺激信號(hào)之間的刺激強(qiáng)度并不相同。Mg2+是一種重要的生物活性物質(zhì)，可以激活多種酶的活性，同時(shí)也是三磷酸腺苷（ATP）和核糖體RNA（rRNA）的組成成分之一[20]。對(duì)于XOS 如何通過(guò)提高M(jìn)g2+濃度抑制PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)活性，需進(jìn)一步研究。

值得一提的是，在本研究中，雖然XOS 能夠抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306基因表達(dá)，但是由XOS處理導(dǎo)致的細(xì)菌的黏附能力下降是否是由STM0306表達(dá)的下調(diào)直接導(dǎo)致的，這個(gè)問(wèn)題仍需進(jìn)一步探究，因?yàn)閄OS可能不只影響STM0306基因的表達(dá)，黏附細(xì)菌的減少可能是多種基因表達(dá)量的變化共同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

綜上所述，XOS 能夠影響細(xì)菌外環(huán)境中的pH 和Mg2+濃度，偏高的Mg2+濃度可能導(dǎo)致鼠傷寒沙門(mén)氏菌PhoP/PhoQ 調(diào)控系統(tǒng)活性受到一定程度抑制，進(jìn)而抑制下游靶基因STM0306表達(dá)。XOS 可能通過(guò)靶向抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM0306表達(dá)，降低其對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力。