莫長明，謝文娟，郭文鋒，張燕玲，黃 江，張馨丹，李 忠，唐 其，馬小軍

? 藥材與資源 ?

羅漢果遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)及核心種質(zhì)研究

莫長明1，謝文娟2#，郭文鋒1，張燕玲3，黃 江2，張馨丹3，李 忠1，唐 其4*，馬小軍5*

1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，廣西 南寧 530007 2. 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541001 3. 桂林吉福思羅漢果生物技術(shù)股份有限公司，廣西 桂林 541006 4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128 5. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

分析羅漢果種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，以為其資源保護、品種改良和性狀遺傳結(jié)構(gòu)解析提供依據(jù)。采用SSR熒光分子標記對325份羅漢果及其近緣物種資源進行親緣關(guān)系鑒定，并且進一步分析羅漢果遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建其核心種質(zhì)。優(yōu)選出的15對SSR熒光引物共檢測到185個等位基因（平均為12.33個），平均香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon’s information index，）為1.67，多態(tài)性信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC）≥0.54；325份種質(zhì)親緣關(guān)系聚類在遺傳距離0.95附近被劃分為赤瓟、翅子羅漢果和羅漢果3個亞群，其中羅漢果亞群發(fā)現(xiàn)大量幾乎無遺傳差異個體，共鑒別獲得140份具遺傳差異的羅漢果初級核心種質(zhì)。這些初級核心種質(zhì)遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation coefficient，F(xiàn)ST）為0.140，群體間、群體內(nèi)、個體內(nèi)遺傳變異分別占總變異的14.0%、19.0%和67.0%，野生、地方和栽培種平均遺傳距離分別為0.802 1、0.576 8、0.422 0，分別為1.798、1.092、0.603；Jaccard遺傳距離聚類分析在遺傳距離0.8處被劃分為9個亞群，群體結(jié)構(gòu)和主成分分析均被劃分為4個亞群。通過10%～70%比例隨機抽樣法，構(gòu)建了32份核心種質(zhì)，其采集地點占原始種質(zhì)的94.12 %，等位基因數(shù)與原始種質(zhì)的符合率為96.13%，值為1.944 9。優(yōu)選出的15對SSR熒光引物多態(tài)性高，能有效鑒別羅漢果及其近緣物種赤瓟、翅子羅漢果。羅漢果初級核心種質(zhì)存在中等程度遺傳分化，遺傳變異主要來自群體與個體內(nèi)部，野生種與地方種遺傳多樣性高，栽培種遺傳多樣性低，存在4個明顯基因庫。構(gòu)建的32份核心種質(zhì)能充分代表原始種質(zhì)地理來源與遺傳多樣性。

羅漢果；SSR熒光標記；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)；核心種質(zhì)

羅漢果(Swingle) C. Jeffrey是具有重要經(jīng)濟價值的葫蘆科珍稀藥用與甜料植物，其干燥果實為馳名中外的傳統(tǒng)中藥材，享有“東方神果”的美譽，為第一批國家藥食兩用中藥材品種，也是《中歐地理標志協(xié)定》保護的中國地理標志產(chǎn)品，具有祛痰止咳[1]、清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便[2]、降糖調(diào)脂[3]、抗炎平喘[4-5]、抗氧化[6]、抗癌[7]、抗纖維化[8]和增強免疫[9]等功效，其重要藥理活性物質(zhì)羅漢果甜苷還是世界上高強度非糖甜味物質(zhì)之一。其中，羅漢果苷Ⅳ、苷V、賽門苷I和異羅漢果苷V甜度分別是0.5%蔗糖溶液的300、378、465[10]和500倍[11]。羅漢果甜苷是為數(shù)不多源自中藥的非營養(yǎng)型、高甜度、低熱量、安全無毒[12-14]、無后苦味、穩(wěn)定易溶的功能性天然甜味劑，可為糖尿病和肥胖癥人食用，2011年便通過美國FDA的GRAS認證成功進入美國市場[15]，目前已獲得超過20國家的市場準入，應(yīng)用產(chǎn)品超過5000種，具有廣闊的市場前景。但是，由于羅漢果甜苷在鮮果中含量較低（0.45%左右），原料成本過高問題一直困擾著其甜味劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展，急需培育優(yōu)良品種提高種植效率來破解這一難題。種質(zhì)資源是作物優(yōu)良品種選育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其親緣關(guān)系、遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和核心種質(zhì)構(gòu)建研究，對指導(dǎo)作物種質(zhì)資源保護和育種利用具有重要意義，已有多種糧食、飼料、蔬菜作物和花卉、林果植物開展了相關(guān)研究，例如青稞、糜子、新麥草、扁豆、建蘭、山荊子、千年桐、核桃[16-23]。2005年，彭云滔[24]和周俊亞[25]也利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、簡單序列重復(fù)區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）分子標記分別對170份野生和75份栽培羅漢果種質(zhì)分析顯示，野生種質(zhì)遺傳多樣性高、居群間遺傳分化大、居群內(nèi)遺傳多樣性低，栽培種質(zhì)遺傳多樣性低、僅少數(shù)品種遺傳差異較大。解兵斌[26]通過葉綠體間隔區(qū)序列片段trnR-atpA、trnH-psbA、trnL-trnF和單拷貝核基因、，對13個野生種群和21個栽培品種共151個種質(zhì)分析也顯示，野生種群遺傳多樣性高、種群間遺傳分化大，栽培品種遺傳多樣性明顯降低，并推測羅漢果在第4紀冰期存在廣西東北部、萌渚嶺、大庾嶺與武功山和云開山脈4個避難所。與AFLP、RAPD、ISSR等分子標記相比，SSR標記由于多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳和操作簡單等優(yōu)點，已成為開展上述研究的理想分子標記。王要芳[27]利用24份野生和74份栽培種質(zhì)開發(fā)了15對羅漢果SSR引物。王娟等[28]利用一個野生居群的21份樣品開發(fā)了27對羅漢果EST-SSR引物。但是，SSR熒光分子標記分析羅漢果親緣關(guān)系、遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建其核心種質(zhì)的研究未有報道。此外，受開荒種植、伐木修路等影響，羅漢果野生資源仍遭受著嚴重的持續(xù)破壞；受病蟲害流行和市場對果實品質(zhì)要求嚴苛等影響，羅漢果地方與栽培品種資源也在不斷銳減，拉江果、爆棚果、長灘果等品種已幾乎滅絕。前人研究過程中對種質(zhì)保存重視不夠，多年過去以后，現(xiàn)有羅漢果種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)與育種潛力狀況不明。再有，生產(chǎn)中具一定規(guī)模的育苗場就有數(shù)十家，各自聲稱其種苗為自家培育品種，品種名稱繁多然而性狀表現(xiàn)則大同小異，因而栽培品種狀況也不明朗。因此，本研究首次廣泛收集并保存野生與栽培區(qū)羅漢果近緣種、野生種、地方種和栽培種等種質(zhì)資源，并運用檢測通量更大、準確度更高、靈敏度更好的SSR熒光分子標記，分析羅漢果種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建其核心種質(zhì)庫，以摸清羅漢果這一中國特有物種資源現(xiàn)有家底，更好指導(dǎo)羅漢果種質(zhì)資源保護及育種利用、優(yōu)質(zhì)栽培和性狀遺傳研究，也為其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要物質(zhì)保障。

1 材料與儀器

1.1 材料

廣泛收集野生與栽培區(qū)羅漢果(Swingle) C. Jeffrey的野生種（YSZ）、地方種（DFZ）和栽培種（ZPZ），以及其近緣屬（JYS）赤瓟L.、近緣種（JYZ）翅子羅漢果的種質(zhì)325份。實驗材料經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所馬小軍研究員鑒定。其中，近緣屬包括采自廣西金秀縣、黑龍江哈爾濱市的4份赤瓟種質(zhì)，近緣種為采自那坡縣的1份翅子羅漢果；野生種包括江西省九江市、龍南縣、信豐縣、安福縣，湖南道縣、雙牌縣，廣西區(qū)賀州市、三江縣、興安縣、臨桂區(qū)、永福縣、柳州市、金秀縣、博白縣，以及廣東省南雄市、乳源縣采集的171份種質(zhì)；地方種均為早年栽培中心收集保存的，共計69份種質(zhì)；栽培種包括羅漢果主產(chǎn)區(qū)廣西區(qū)和湖南省不同育苗場采集的80份種質(zhì)。通過SRR熒光分子標記從中鑒別出140份具遺傳差異的初級核心種質(zhì)（表1）用于進一步遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)等分析。

1.2 儀器

KingFisher? Flex型核酸提取儀（美國ThermoFisher公司），Mikro 120型臺式離心機（德國Hettich公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），NanoDROP 8000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher公司），Veriti 384 well型PCR儀（美國Applied Biosystems公司），3730XL型基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 基因組DNA提取與質(zhì)量檢測

采用天根生化磁珠法植物基因組提取試劑盒，配合King Fisher? Flex核酸提取儀和Mikro 120臺式離心機對羅漢果嫩葉樣本進行基因組DNA核酸提取。取2 μL提取DNA樣本添加2 μL 6×Loading Buffer，于DYY-6C電泳儀進行濃度1%、電壓120 V、時間20 min的瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性。取2 μL DNA樣本，采用NanoDROP 8000超微量分光光度計進行核酸濃度和純度檢測。

2.2 SSR引物合成與篩選

采用接頭熒光PCR法，從發(fā)表的引物[27-28]中選取37對多態(tài)性引物，由天一輝遠公司合成上游接頭引物（添加21 bp序列5’-GAAGGTGACCA- AGTTCATGCT-3’）或熒光接頭引物（接頭引物添加熒光基團），以及下游普通引物，針對25個表型遺傳差異大的品種樣本，在Veriti 384 well PCR儀上，分別進行2輪PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：GeneTech 2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL、Mix primer 2.0 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 4.5 μL。PCR擴增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62～52 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，運行10個循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運行25個循環(huán)；72 ℃延伸20 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物采用3730XL基因分析儀進行熒光毛細管電泳檢測。上樣混合物：Applied Biosystems Hi-Di Formamide 10 μL、Applied Biosystems GeneScan 500 LIZ Size Standard內(nèi)標0.5 μL、PCR產(chǎn)物1.0 μL。使用GeneMarker3.0.0軟件對結(jié)果進行分析，從中篩選到15對多態(tài)性良好的引物（表2）。

表1 初級核心種質(zhì)信息

Table 1 Information of primary core collections

種質(zhì)編號群體類型采集地點采集年份種質(zhì)編號群體類型采集地點采集年份種質(zhì)編號群體類型采集地點采集年份 1YSZ廣西永福縣202148YSZ廣西賀州市2021 95YSZ廣東南雄市2021 2YSZ廣西三江縣202149YSZ廣西賀州市2021 96YSZ湖南道縣2021 3YSZ廣西永?？h202150DFZ廣西永?？h2005 97YSZ廣東南雄市2021 4DFZ廣西永?？h200451DFZ廣西雁山區(qū)2017 98YSZ廣東南雄市2021 5DFZ廣西臨桂區(qū)200852DFZ廣西雁山區(qū)2018 99YSZ湖南道縣2021 6DFZ廣西臨桂區(qū)200453DFZ廣西雁山區(qū)2018100YSZ湖南道縣2021 7DFZ廣西龍勝縣200454DFZ廣西雁山區(qū)2019101YSZ廣東南雄市2021 8DFZ廣西臨桂區(qū)200455DFZ廣西雁山區(qū)2019102YSZ江西信豐縣2021 9DFZ廣西永?？h200456DFZ廣西雁山區(qū)2019103YSZ江西信豐縣2021 10DFZ廣西龍勝縣200457DFZ廣西雁山區(qū)2019104YSZ湖南道縣2021 11DFZ廣西永?？h200458DFZ廣西雁山區(qū)2019105YSZ湖南道縣2021 12DFZ廣西永?？h200459DFZ廣西臨桂區(qū)2017106YSZ湖南道縣2021 13DFZ廣西龍勝縣200460DFZ廣西雁山區(qū)2019107YSZ湖南道縣2021 14DFZ廣西臨桂區(qū)200461DFZ廣西雁山區(qū)2019108YSZ湖南道縣2021 15DFZ廣西永福縣200462DFZ廣西雁山區(qū)2019109YSZ廣西賀州市2021 16DFZ廣西永?？h200463DFZ廣西臨桂區(qū)2017110YSZ廣西博白縣2021 17DFZ廣西永?？h200464DFZ廣西永福縣2017111YSZ廣西博白縣2021 18DFZ廣西永?？h200765DFZ廣西興安縣2018112ZPZ廣西雁山區(qū)2020 19JYZ廣西那坡縣202166DFZ廣西臨桂區(qū)2017113ZPZ廣西永?？h2018 20DFZ廣西永?？h200467DFZ廣西永?？h2019114YSZ廣西臨桂區(qū)2021 21DFZ廣西永福縣200468DFZ廣西永?？h2019115YSZ湖南雙牌縣2021 22DFZ廣西龍勝縣200469YSZ廣西三江縣2017116YSZ湖南雙牌縣2021 23DFZ廣西永福縣200470YSZ廣西金秀縣2016117YSZ廣西興安縣2021 24DFZ廣西永?？h200471DFZ廣西臨桂區(qū)2017118YSZ廣西永?？h2021 25DFZ廣西臨桂區(qū)200472YSZ廣西金秀縣2021119YSZ廣西賀州市2021 26DFZ廣西永福縣200473YSZ廣西金秀縣2021120YSZ廣西臨桂區(qū)2021 27DFZ廣西臨桂區(qū)200474YSZ廣西永?？h2021121YSZ江西九江市2021 28DFZ廣西永?？h200475YSZ廣西金秀縣2021122YSZ廣東南雄市2021 29YSZ廣西臨桂區(qū)201876YSZ廣西金秀縣2021123YSZ廣西賀州市2021 30DFZ廣西永?？h200477YSZ江西九江市2021124YSZ廣西賀州市2021 31DFZ廣西永?？h200478YSZ湖南道縣2021125YSZ廣西永?？h2021 32ZPZ廣西永?？h202179YSZ江西龍南縣2021126YSZ廣西永福縣2021 33YSZ江西信豐縣202180YSZ廣東乳源縣2021127YSZ廣西永?？h2021 34YSZ江西龍南縣202181YSZ江西龍南縣2021128YSZ廣西永福縣2021 35YSZ江西龍南縣202182YSZ江西龍南縣2021129YSZ廣西三江縣2021 36YSZ江西龍南縣202183YSZ江西龍南縣2021130YSZ廣西三江縣2021 37YSZ江西信豐縣202184YSZ江西龍南縣2021131YSZ廣西三江縣2021 38YSZ廣東南雄市202185YSZ江西信豐縣2021132YSZ廣西興安縣2021 39YSZ廣西永?？h202186YSZ江西信豐縣2021133YSZ廣西興安縣2021 40YSZ廣西興安縣202187YSZ江西信豐縣2021134YSZ廣西興安縣2021 41YSZ廣西興安縣202188YSZ江西信豐縣2021135YSZ江西龍南縣2021 42YSZ廣西博白縣202189YSZ江西信豐縣2021136YSZ江西龍南縣2021 43DFZ廣西臨桂區(qū)200890YSZ江西信豐縣2021137ZPZ廣西永福縣2021 44YSZ廣西永?？h202191YSZ江西信豐縣2021138YSZ湖南雙牌縣2021 45YSZ廣西賀州市202192ZPZ廣西雁山區(qū)2021139ZPZ湖南武岡市2021 46YSZ廣西金秀縣202193YSZ湖南道縣2021140ZPZ湖南武岡市2021 47YSZ廣西臨桂區(qū)202194YSZ湖南道縣2021

2.3 群體樣本SSR分型

在篩選出的15對引物的上游引物5’端加上不同的熒光標記，與下游普通引物一起，采用直接熒光PCR法，對325份羅漢果種質(zhì)樣本進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物通過熒光毛細管電泳檢測。PCR擴增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和熒光毛細管電泳檢測方法同“2.2”項引物篩選實驗。檢測結(jié)果通過GeneMarker3.0.0軟件分析獲得每份種質(zhì)樣本的等位基因數(shù)、峰圖和基因型。

表2 優(yōu)選出的15對多態(tài)性引物信息

Table 2 Information of 15 pairs of selective polymorphic primers

熒光引物重復(fù)單元正向引物（5’→3’）反向引物（5’→3’）產(chǎn)物大小/bp Sg3-FAM(CT)10TCTGGAGAGGAAAACTTAGAAATGACAAAATAGGAGATCCCTGAAACC191～226 Sg7-FAM(GA)_x001E_11TGCCGACATCCTTCTATTCCCTCCTCTCCGTAGCTCCATC167～178 Sg13-HEX(CT)12CTTCCATCTCCTTGAAAACAGACTCCTCCATTCTTCCTCT143～170 Sg14-HEX(TC)8 ... (TC)6GACTCAACGACGAACGGGAAAGAAAAGCAAACACCACC316～347 Sg25-FAM(TTC)10ATTATTTGTCGGGGTTGTGGTGGAGATGGGTTCTGAGTTG194～222 Sg26-TAMRA(CAA)6TCCACAACCCAAAATCATACAAGGGAGACCCACAAT200～218 Sg27-FAM(CT)6TCCATCAACAGTAGCCCTAGAGGGACGAAATGAAGA138～149 Sg29-HEX(CT)6TGCCTGCCTTCACTTTCAGCAAAAACAGAGGGACGA130～140 Sg31-HEX(CCA)6ATGATTCAGAACCCAGCATCGGTATCGGTGGAGTTA185～194 Sg34-HEX(AT)12AACTGTGGAAAAGAACCCTTACCCTCTCTAACCATTCCAA241～268 Sg35-FAM(CT)14ATCCCCAAGTTCACAGCGTATCGTCGTACTCTTTTGGGTA250～269 Sg36-HEX(GA)13TCATGCCTCTGAGTAAAACGACTGCCTCTCTTGTTGGTTT264～277 Sg37-HEX(GA)16CACAGGAAAATTGGTGCTCTGTTTTCGCCATCAAGATCAGG222～248 Sg38-TAMRA(GA)9AAACAACCGCCCTCCGCCTTTGGTGGCTCCTTGTAGTCCT206～249 Sg42-HEX(CT)13CTCCATTGAAGCCCCATATGATGCCAACTTTGTCGC192～211

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件整理基因型數(shù)據(jù)，統(tǒng)計標記位點等位基因在不同群體的百分數(shù)和私有等位基因數(shù)，按照不同軟件要求進行相應(yīng)數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換。采用GenAlex6.5軟件計算種質(zhì)標記位點和群體的有效個體數(shù)（effective number of alleles，）、等位基因數(shù)（observed number of individuals，a）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，e）、香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon’s information index，）、觀測雜合度（observed heterozygosity，o）、期望雜合度（expected heterozygosity，e）、固定指數(shù)（fixation index，F(xiàn)）、遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation coefficient，F(xiàn)ST）、基因流（gene flow，m）和基因差異分化系數(shù)（gene differentiation coefficient，ST）等遺傳多樣性參數(shù)。采用Cervus3.0.7軟件計算多態(tài)信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC）。

種質(zhì)間系統(tǒng)聚類使用NTsys2.10e軟件根據(jù)Jaccard遺傳距離分析畫樹。群體間系統(tǒng)聚類根據(jù)Nei's遺傳距離，運用Phylip軟件對其進行UPGMA方法畫樹。群體間的遺傳距離，以及分子方差分析采用GenAlex6.5軟件計算。群體結(jié)構(gòu)分析使用STRUCTURE 2.3.4，設(shè)置＝3～10，Burn-in周期為10000，Markov Chain Monte Carlo設(shè)為100000，每個值運行20次，并利用在線工具STRUCTURE HARVESTER（https://taylor0.biolo gy.ucla.edu/structureHarvester/）算出最佳△值（即為最佳群體分群數(shù)）。根據(jù)最佳值結(jié)果，使用CLUMMP和DISTRUCT軟件繪制結(jié)果圖。種質(zhì)主坐標分析（principal co-ordinate analysis，PCoA）利用GenAlex 6.5軟件。

采用隨機取樣法，利用R package corehunter對每個類群按照個體數(shù)量的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%抽樣比例來提取核心種質(zhì)子集。其中，外群各組樣本數(shù)量很少，且與其他樣本差異較大，故無需提取子集，直接保留作為核心種質(zhì)。使用軟件Popgene32分析獲得的每個抽樣子集的，從中選取最優(yōu)的子集作為核心種質(zhì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 SSR熒光標記引物優(yōu)選評價

3.1.1 引物擴增羅漢果及其近緣物種多態(tài)性評價 從37對普通引物中篩選出15對擴增位點多態(tài)性好的SSR熒光標記引物（表3）。利用此15對引物對325份羅漢果及其近緣種質(zhì)進行擴增，每對引物擴增的有效個體數(shù)在284個以上，平均為318個；所有引物對共擴增出185個等位基因，每對引物擴增出的a在6個以上、平均a為12.33個；各對引物在不同群體中擴增出等位基因的百分數(shù)存在明顯差異，但均為野生種＞地方種＞栽培種，其中野生種中擴增出等位基因的百分數(shù)在80.00%以上、平均值為91.92%。每對引物擴增位點的在0.70～2.12、平均值為1.67，PIC在0.54～0.81、平均值0.70，F(xiàn)ST在0.041 4～0.248 7、平均值為0.128 0，GST在0.038 7～0.244 2、平均值為0.124 5。185個等位基因中有21個為私有等位基因（表4），其中那坡縣近緣種種質(zhì)19攜帶私有等位基因數(shù)最多、達到7個，其次乳源縣和南雄市野生種種質(zhì)80、98均攜帶3個私有等位基因，再有金秀縣和雙牌縣野生種種質(zhì)70、138則均攜帶2個私有等位基因，信豐縣、南雄市和臨桂區(qū)野生種種質(zhì)37、87、101、114也各攜帶1個私有等位基因。

表3 15對引物的遺傳多樣性參數(shù)

Table 3 Genetic diversity parameters of 15 pairs of primers

熒光引物NNa群體等位基因百分數(shù)/%IPICFSTGST 野生種地方種栽培種 Sg3-FAM28410 80.0050.0020.001.640.730.195 80.191 7 Sg7-FAM31710 90.0030.0020.001.600.700.131 40.128 2 Sg13-HEX32315 93.3326.6713.331.970.780.055 70.052 3 Sg14-HEX32211 90.9145.4518.181.580.680.099 70.096 2 Sg25-FAM31913100.0061.5415.381.880.750.041 40.038 7 Sg26-TAMRA31815 80.0046.6713.331.850.760.146 90.143 7 Sg27-FAM321 7 85.7157.1457.141.460.710.108 50.105 6 Sg29-HEX318 7 85.7157.1457.141.440.700.112 60.109 5 Sg31-HEX322 6100.0066.6733.331.090.540.248 70.244 2 Sg34-HEX32220 95.0030.0015.002.080.800.178 50.173 8 Sg35-FAM32116 93.7531.2512.502.020.810.122 70.120 2 Sg36-HEX32210 90.0030.0010.000.700.270.096 40.092 6 Sg37-HEX32118100.0022.2211.111.930.730.125 60.122 9 Sg38-TAMRA31918 94.4427.7822.222.120.810.084 60.080 4 Sg42-HEX321 9100.0055.5633.331.620.710.171 60.167 3 平均值31812.33 91.9242.5423.471.670.700.128 00.124 5

表4 種質(zhì)攜帶的私有等位基因

Table 4 Private alleles of germplasms

種質(zhì)編號群體類型采集地點基因數(shù)量私有等位基因名稱 19JYZ那坡縣7Sg3-FAM-172、Sg3-FAM-176、Sg7-FAM-142、Sg14-HEX-322、Sg26-TAMRA-191、Sg26-TAMRA-195、Sg36-HEX-240 80YSZ乳源縣3Sg31-HEX-161、Sg34-HEX-238、Sg34-HEX-250 98YSZ南雄市3Sg27-FAM-115、Sg29-HEX-106、Sg35-FAM-267 70YSZ金秀縣2Sg13-HEX-139、Sg35-FAM-233 138YSZ雙牌縣2Sg26-TAMRA-186、Sg35-FAM-249 37YSZ信豐縣1Sg36-HEX-260 87YSZ信豐縣1Sg13-HEX-127 101YSZ南雄市1Sg42-HEX-194 114YSZ臨桂區(qū)1Sg34-HEX-233

編號與表1中種質(zhì)編號對應(yīng)，以下同

The germplasm codes in the table represent the germplasm codes in Table 1, same as below

3.1.2 引物對羅漢果及其近緣物種鑒定評價 325份種質(zhì)親緣關(guān)系Jaccard遺傳距離系統(tǒng)聚類結(jié)果鑒定結(jié)果見圖1，在遺傳距離0.95附近所有種質(zhì)可分為3個亞群。其中，亞群I為羅漢果近緣屬物種赤瓟?shù)?份種質(zhì)，亞群II為羅漢果近緣種翅子羅漢果的1份種質(zhì)，亞群III則均為羅漢果種質(zhì)。3個亞群親緣關(guān)系由遠及近依次為赤瓟、翅子羅漢果和羅漢果。羅漢果種質(zhì)群體中存在大量幾乎無遺傳差異的個體，例如三江縣、賀州市和道縣等野生種群體，而且個體數(shù)量較少的雙牌縣和博白縣野生種群體這一現(xiàn)象會更明顯。地方種群體也存在一定數(shù)量幾乎無遺傳差異的個體。栽培種群體種質(zhì)間幾乎無遺傳差異的現(xiàn)象最為突出，主產(chǎn)區(qū)不同育苗場繁育的雌性和雄性栽培種群體均存在大量幾乎無遺傳差異的個體，采集的80份種質(zhì)中雌性栽培品種只剩下1個大面積種植的青皮果品種和2個少量種植的紅毛果品種，雄性栽培品種也僅有4個品種。

圖1 羅漢果及其近緣物種親緣關(guān)系鑒定

3.2 初級核心種質(zhì)遺傳分析

3.2.1 群體間遺傳分化分析 因羅漢果種質(zhì)資源稀少，所以去除325份種質(zhì)中近緣屬與幾乎無遺傳差異的種質(zhì)后，將剩余140份存在遺傳差異的種質(zhì)作為羅漢果初級核心種質(zhì)（表1）。這140份初級核心種質(zhì)群體間親緣關(guān)系由遠及近依次為近緣種、野生種、地方種、栽培種（圖2），F(xiàn)ST由大到小分別為近緣種與栽培種群體、近緣種與地方種群體、近緣種與野生種群體、野生種與栽培種群體、地方種與栽培種群體、野生種與地方種群體，Nei’s遺傳距離由大到小順序除野生種與地方種群體和地方種與栽培種群體互換外，其余與FST排序一致（表5）。當0＜FST＜0.05、0.05≤FST＜0.15、0.15≤FST＜0.25、0.25≤FST＜1時，分別表明群體間具有較弱、中等、較強或非常強的遺傳分化[29]。分子方差分析結(jié)果（表6）表明，這些初級核心種質(zhì)群體間FST為0.140，存在中等程度遺傳分化；大多數(shù)變異來自群體與個體內(nèi)部（86.00%），而群體間的變異僅貢獻了14.00%（表6）；群體間m＝1.535＞1（表6），存在一定頻率的基因交流。

圖2 初級核心種質(zhì)群體的遺傳分化關(guān)系

表5 初級核心種質(zhì)群體間遺傳分化系數(shù)和遺傳距離

Table 5 Genetic differentiation coefficient and genetic distance among primary core collection populations

群體類型JYZYSZDFZZPZ JYZ02.3722.4012.523 YSZ0.32900.4010.657 DFZ0.4090.08400.261 ZPZ0.5110.1770.1230

對角線下方數(shù)據(jù)為遺傳分化系數(shù)FST，對角線上方數(shù)據(jù)為Nei’s遺傳距離

The data below the diagonal is FSTValues, and above the diagonal is Nei’s genetic distance

表6 初級核心種質(zhì)群體分子方差分析

Table6 Molecular analysis of variance of primary core collection populations

變異來源自由度變異組分變異百分數(shù)/%FSTNmP值 群體間 20.846 14.00.1401.5350.001 群體內(nèi)1361.166 19.0 個體內(nèi)1394.032 67.0 總數(shù)2776.044100.0

3.2.2 群體內(nèi)遺傳多樣性分析 原始種質(zhì)近緣種、野生種、地方種和栽培種入選初級核心種質(zhì)個體比例由高到低分別為近緣種100%、地方種68.12%、野生種49.12%、栽培種8.75%，其中野生種和栽培種中種質(zhì)重復(fù)比例均很高（表7）。安?？h和雙牌縣野生居群入選比例非常低，且二者存在種質(zhì)重復(fù)現(xiàn)象（表7）。野生種、地方種和栽培種群體遺傳距離范圍分別為0.038 5～0.979 2、0.035 7～0.829 3、0.041 7～0.743 6，平均遺傳距離分別為0.802 1、0.576 8、0.422 0（表7）。其中，野生種16個縣市區(qū)居群入選初級核心種質(zhì)個體數(shù)多且比例高的為信豐縣、龍南縣、永福縣居群，遺傳距離范圍較寬的為永?？h、興安縣和賀州市居群，其遺傳距離范圍分別為0.041 7～0.902 4、0.043 5～0.900 0、0.040 0～0.878 0，平均遺傳距離較大的為雙牌縣、臨桂區(qū)和龍南縣居群，其平均遺傳距離分別為0.878 2、0.732 9、0.686 1（表7）。野生種、地方種和栽培種群體遺傳多樣性參數(shù)a、e、、e等由大到小均分別為野生種、地方種、栽培種群體，其中a平均值分別為11.333、5.533、2.133，平均值分別為1.798、1.092、0.603（表8）。

3.2.3 群體聚類分析 140份初級核心種質(zhì)在遺傳距離0.8處可分為具有較明顯地理來源的9個亞群（見圖3）。亞群I為來自那坡縣的1份近緣種。亞群II為來自乳源縣的1份野生種。亞群Ⅲ包括74份野生、地方和栽培種質(zhì)，其中野生種來自雙牌縣2份、臨桂區(qū)3份、永?？h9份、三江縣1份、興安縣5份，地方種47份，栽培種7份，主要為永?？h、臨桂區(qū)和興安縣種質(zhì)。亞群Ⅳ為5份野生種質(zhì)，其中來自三江縣4份、南雄市1份，基本為三江縣種質(zhì)。亞群V為來自南雄市的4份野生種。亞群VI為8份野生種質(zhì)，其中來自雙牌縣1份、永福縣1份、賀州市6份，基本為賀州市種質(zhì)。亞群VII為32份野生種質(zhì)，其中來自南雄市1份、道縣11份、龍南縣8份、信豐縣1份、賀州市1份、博白縣3份、臨桂區(qū)1份、金秀縣6份，主要為道縣、龍南縣、金秀縣和博白縣。亞群Ⅷ為4份野生種質(zhì)，其中來自龍南縣2份、九江市2份。亞群Ⅸ為來自信豐縣的11份野生種。雖然除翅子羅漢果和乳源縣野生種分別單獨聚為一個亞群外，其余同一地理來源或遺傳群體種質(zhì)均與1個以上其他地理來源或遺傳群體種質(zhì)聚為1個亞群，但是種質(zhì)分布仍呈現(xiàn)一定程度的地理來源或遺傳群體類型相關(guān)性，鄰近的縣區(qū)市種質(zhì)趨向形成1個亞群，同時可能通過自然傳播或人工引種方式與其它亞群存在一些基因交流。例如，亞群Ⅲ主要為永福、臨桂和興安鄰近縣區(qū)種質(zhì)，同時包含外圍三江縣和雙牌縣少量種質(zhì)；亞群VII包括道縣、龍南縣及其外圍南雄市、信豐縣、賀州市種質(zhì)，這可能是由于種質(zhì)自然傳播所致，以及包括與二者相距較遠的金秀縣、博白縣種質(zhì)，這可能與人工引種有關(guān)。

3.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 羅漢果為異花授粉植物，雜合度較高，不僅群體間存在遺傳變異，群體內(nèi)個體遺傳變異也不盡相同，為了揭示羅漢果種質(zhì)的遺傳組分，參考Evanno等[30]的方法當Δ值變化出現(xiàn)明顯的峰值時值作為最優(yōu)群體數(shù)的方法，對140份初級核心種質(zhì)進行類群劃分。將設(shè)置為3～10，繪制與Δ的關(guān)系圖，當＝4時，Δ出現(xiàn)最大峰值（圖4），因此羅漢果初級核心種質(zhì)可劃分為4個亞群（圖5）。Cluster1亞群共包括37份近緣種與野生種種質(zhì)，其中近緣種來自那坡縣1份，野生種來自信豐縣10份、龍南縣10份、南雄市4份、賀州市1份、金秀縣6份、九江市2份、乳源縣1份、道縣1份；Cluster2亞群共包括28份野生種與地方種種質(zhì)，其中野生種來自永?？h9份、三江縣4份、興安縣5份、臨桂區(qū)2份、南雄市1份、雙牌縣1份，地方種6份；Cluster3亞群為23份野生種種質(zhì)，其中來自博白縣3份、永?？h1份、賀州市6份、道縣11份、南雄市1份、雙牌縣1份；Cluster4亞群共包括52份野生種、地方種和栽培種種質(zhì)，其中野生種來自臨桂區(qū)2份、柳州市1份、雙牌縣1份，地方種41份，栽培種7份。

表7 初級核心種質(zhì)4個類型群體及野生居群內(nèi)遺傳距離

Table 7 Genetic distance within four types of populations and wild populations of primary core collections

群體分群采樣數(shù)量入選數(shù)量入選比例/%遺傳距離范圍平均遺傳距離 JYZ 1 1100.00NDND YSZ17184 49.120.038 5～0.979 20.802 1 DFZ 6947 68.120.035 7～0.829 30.576 8 ZPZ 80 7 8.750.041 7～0.743 60.422 0 九江市居群 2 2100.00NDND 龍南縣居群 1510 66.670.045 5～0.833 30.686 1 信豐縣居群 1611 68.750.038 5～0.833 30.669 9 安?？h居群 3 0 0.00NDND 道縣居群 2111 52.380.050 0～0.741 90.393 3 雙牌縣居群 29 3 10.340.756 8～0.977 80.878 2 賀州市居群 16 7 43.750.040 0～0.878 00.555 3 三江縣居群 12 4 33.330.038 5～0.354 90.189 9 興安縣居群 8 6 75.000.043 5～0.900 00.625 9 臨桂區(qū)居群 5 4 80.000.611 1～0.809 50.732 9 永福縣居群 1410 71.430.041 7～0.902 40.659 7 柳州市居群 1 1100.00NDND 金秀縣居群 8 5 62.500.080 0～0.822 20.550 7 博白縣居群 14 3 21.430.041 7～0.153 80.105 2 南雄市居群 6 6100.000.095 2～0.864 90.676 4 乳源縣居群 1 1100.00NDND

ND表示無相應(yīng)數(shù)據(jù)

ND represent no date

表8 初級核心種質(zhì)群體遺傳多樣性參數(shù)

Table 8 Genetic diversity parameters of primary core collection populations

群體類型NNaNeIHoHeF YSZ84.000±0.54311.333±1.1205.100±0.6701.798±0.1270.530±0.0370.752±0.0300.291±0.047 DFZ46.667±0.504 5.533±0.4462.562±0.1761.092±0.0850.579±0.0570.572±0.0420.014±0.058 ZPZ 5.733±0.267 2.133±0.2361.926±0.1980.603±0.1220.522±0.1150.375±0.0750.411±0.125 平均值45.467±4.826 6.333±0.6983.196±0.3131.164±0.0980.543±0.0440.566±0.0380.001±0.060

STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)分析中，當某一種質(zhì)在某類群中的Q≥0.6時，則認為該種質(zhì)血緣關(guān)系相對比較單一，否則認為該種質(zhì)血緣關(guān)系來源復(fù)雜[31]。圖5顯示，Cluster1亞群除賀州市和金秀縣野生種種質(zhì)45、75、76的Q值分別為0.384 2、0.583 7、0.598 1外，其余種質(zhì)Q值均大于0.6。Cluster2亞群除地方種種質(zhì)23、66和南雄市野生種種質(zhì)97的Q值分別為0.502 6、0.505 8、0.383 9外，其余種質(zhì)Q值均大于0.6。Cluster3亞群除博白縣野生種種質(zhì)42的Q值為0.56 1，永福縣野生種種質(zhì)44的Q值為0.498 4，賀州市野生種種質(zhì)48、49和109、119、123、123的Q值為0.499 4、0.495 5、0.499 6、0.498 4、0.495 6、0.497 8，雙牌縣野生種種質(zhì)138的Q值為0.479 4外，其余種質(zhì)Q值均大于0.6。Cluster4亞群除地方種種質(zhì)7、21的Q值為0.570 9、0.571 2，臨桂區(qū)野生種種質(zhì)114的Q值為0.495 6外，其余種質(zhì)Q值均大于0.6。140份初級核心種質(zhì)中有122份種質(zhì)Q≥0.6，占所有種質(zhì)材料的87.14%。這些說明羅漢果初級核心種質(zhì)及其各亞群中大部分種質(zhì)血緣關(guān)系比較單一，但是也有少數(shù)種質(zhì)含有其他亞群基因成分，尤其是Cluster3亞群來自賀州市野生種種質(zhì)。

圖3 140個初級核心種質(zhì)系統(tǒng)進化樹

圖4 140個初級核心種質(zhì)ΔK隨K值變化的分布

Cluster1亞群種質(zhì)對應(yīng)聚類分析的亞群I、II、V、VII、Ⅷ和Ⅸ種質(zhì)。Cluster2亞群種質(zhì)對應(yīng)聚類分析的亞群Ⅲ、Ⅳ和VII種質(zhì)。Cluster3亞群種質(zhì)對應(yīng)聚類分析的亞群VI和VII種質(zhì)。Cluster4亞群種質(zhì)對應(yīng)聚類分析的亞群Ⅲ種質(zhì)。其中，因亞群間基因交流而血緣關(guān)系混雜，使得亞群Ⅲ種質(zhì)歸屬Cluster2和Cluster4 2個亞群，亞群VII種質(zhì)歸屬Cluster1、2和3 3個亞群外，其余聚類分析劃分亞群種質(zhì)均單一歸屬群體結(jié)構(gòu)分析劃分的1個亞群。

3.2.5 群體主坐標分析 140份羅漢果初級核心種質(zhì)主坐標分析顯示，第1、第2、第3主坐標分別能解釋這些種質(zhì)27.929%、12.518%、10.853%的遺傳變異。按照近緣種、野生種、地方種和栽培種分群，它們被明顯劃分成2個亞群（圖6-A），其中近緣種、野生種成為1個亞群，地方種、栽培種成為1個亞群。若按照群體結(jié)構(gòu)分析劃分的4個亞群分群（圖6-B），則與群體結(jié)構(gòu)劃分的亞群結(jié)果相吻合，被明顯劃分成與群體結(jié)構(gòu)分析Cluster1、2、3、4亞群相對應(yīng)的K1、K2、K3、K4共4個亞群。2種分群方式主坐標分析結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，地方種與栽培種亞群對應(yīng)K4亞群，近緣種與野生種亞群則進一步被劃分成K1、K2、K3 3個亞群。K1、K2、K3、K4 4個亞群間m＝1.128＞1，說明亞群間存在低頻率的基因交流情況。

圖5 140份初級核心種質(zhì)遺傳群體結(jié)構(gòu)

3.3 核心種質(zhì)構(gòu)建分析

采用最大限度保留多態(tài)性位點的隨機取樣方法，從去除赤瓟后321份羅漢果及近緣種種質(zhì)中分別構(gòu)建抽樣比例70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%的11個候選核心種質(zhì)子集，表9結(jié)果顯示，當抽樣比例減少至15%時，a開始減少；當抽樣比例小于35%后，e和均逐漸增加。抽樣量過少會導(dǎo)致丟失過多遺傳變異，抽樣量過大又會增加遺傳冗余度和重復(fù)度從而拉低核心種質(zhì)遺傳多樣性，Brown[32]認為多數(shù)植物核心種質(zhì)的抽樣比例為5%～10%。10%抽樣比例時羅漢果核心種質(zhì)子集a為174個，與原始種質(zhì)a（181個）相符率達96.13%，e（5.726 7）和值（1.944 9）最高，符合Brown[32]提出的原始樣本的5%～10%所構(gòu)成的核心種質(zhì)代表70%以上的遺傳變異的標準。因此，最終確定抽樣比例為10%，共獲得32份羅漢果核心種質(zhì)（表10）。這些核心種質(zhì)包括近緣種1份、野生種28份、地方種3份，分別占原始種質(zhì)中相應(yīng)遺傳群體種質(zhì)數(shù)量的100%、16.37%、4.35%，它們來源于16個縣市區(qū)，占原始種質(zhì)來源地點（17個縣市區(qū)）的94.12%，能很好地代表原始種質(zhì)的遺傳和地理多樣性。栽培種系統(tǒng)聚類、群體結(jié)構(gòu)和PCoA分析時均與地方種形成1個亞群，無栽培種入選核心種質(zhì)，這可能是其均由地方種衍生而來所致。

A-按遺傳類型JYZ、YSZ、DFZ、ZPZ分群 B-按遺傳群體結(jié)構(gòu)K1、K2、K3、K4分群

表9 不同抽樣比例核心種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)

Table 9 Genetic diversity parameters of core collections with different sampling percentages

抽樣比例/%NNaNeI 702251813.984 61.611 0 601931813.994 41.625 1 501601813.831 81.607 8 451441814.088 71.663 7 401281813.885 21.634 9 351121814.267 91.707 5 30 961814.447 01.747 4 25 801814.706 91.799 3 20 641815.131 31.865 2 15 481785.428 51.891 9 10 321745.726 71.944 9

4 討論

藥材生產(chǎn)和育種過程中明確其基原植物的種屬范圍至關(guān)重要，以防止不當選材培育品種和種苗而影響藥材藥效，導(dǎo)致類似“金銀花與山銀花真假藥之爭”的著名事件。1941年，美國學(xué)者Swingle將羅漢果劃歸為葫蘆科苦瓜屬植物。1979年，英國植物學(xué)家C. Jeffrey又將羅漢果從苦瓜屬轉(zhuǎn)移到赤瓟亞屬。中國科學(xué)院植物研究所路安民則認為羅漢果類群植物的雌雄花梗均無苞片，雄蕊5枚、果皮平滑，明顯不同于苦瓜屬雄蕊3枚、果皮有瘤狀凸起，不應(yīng)該放在苦瓜屬，另外其雄蕊藥室弓曲或折曲，種子顯著大，也明顯不同于赤瓟亞屬成員，歸屬赤爮亞屬也不恰當，提出應(yīng)將羅漢果類群植物從赤爬亞屬獨立出來。在與中國學(xué)者們探討后，1980年C. Jeffrey在其《東方葫蘆科植物》一書中重新確立了Merrill提出的羅漢果屬L，并將赤瓟亞屬的種類轉(zhuǎn)隸到中，將羅漢果學(xué)名定為(Swingle) C. Jeffrey。謝文娟[33]基于ITS2進化分析顯示苦瓜屬單獨成支，赤瓟屬與羅漢果屬在一個分支；LEAFY內(nèi)含子2進化分析則顯示，羅漢果屬單獨成支，赤瓟屬與苦瓜屬在1個分支。葫蘆科轉(zhuǎn)錄組和基因組測序進化分析顯示赤瓟屬、羅漢果屬、苦瓜屬單獨成支，進化先后順序為赤瓟屬、羅漢果屬、苦瓜屬[34]。這些研究結(jié)果表明羅漢果與其近緣種屬物種的系統(tǒng)進化地位仍存在一定的不確定性。本研究優(yōu)選出的15對SSR熒光標記引物PIC值均大于0.5，具有高度多態(tài)性，將羅漢果及其近緣物種種質(zhì)劃分成赤瓟、翅子羅漢果和羅漢果3個亞群，進化關(guān)系為赤瓟、翅子羅漢果和羅漢果，與前人葫蘆科轉(zhuǎn)錄組和基因組測序系統(tǒng)進化研究結(jié)果一致，支持羅漢果單獨成屬的觀點，還發(fā)現(xiàn)羅漢果種質(zhì)存在大量重復(fù)種質(zhì)，說明這些SSR熒光標記引物不僅能在種屬水平有效鑒別羅漢果及其近緣物種，還能在種下水平有效鑒別其種質(zhì)親緣關(guān)系。由于羅漢果野外開花結(jié)果少，其野生資源采集時物種識別具有一定困難，因此這些SSR熒光標記引物將可為羅漢果種質(zhì)收集和育種過程中材料鑒定提供了有效方法。

表10 32份核心種質(zhì)信息

Table10 Information of 32 accessions of core collections

種質(zhì)編號群體類型采集地點入選比例/%種質(zhì)編號群體類型采集地點入選比例/% 19JYZ那坡縣100.00100YSZ道縣 1YSZ永?？h16.37101YSZ南雄市 37YSZ信豐縣109YSZ賀州市 39YSZ永福縣114YSZ臨桂縣 70YSZ金秀縣115YSZ雙牌縣 76YSZ金秀縣121YSZ九江市 80YSZ乳源縣124YSZ賀州市 82YSZ龍南縣125YSZ永?？h 83YSZ龍南縣129YSZ三江縣 84YSZ龍南縣132YSZ興安縣 87YSZ信豐縣134YSZ信豐縣 88YSZ博白縣136YSZ龍南縣 90YSZ信豐縣138YSZ雙牌縣 91YSZ信豐縣 15DFZ 4.35 95YSZ南雄市 17DFZ 98YSZ南雄市 50DFZ

羅漢果雌雄異株，花粉具粘性且花朵缺乏蜜露，風(fēng)媒與蟲媒傳粉困難，種植需要人工授粉才能結(jié)果。此外，羅漢果野生植株開花結(jié)果數(shù)量有限，且種子失水活力喪失較快，還存在明顯近交衰退現(xiàn)象。這些表明羅漢果野外通過有性繁殖后代能力可能有限。種質(zhì)采集過程中發(fā)現(xiàn)野生羅漢果植株莖端伸入濕潤枯枝落葉和巖石、土壤縫隙中膨大形成帶不定根小薯塊的現(xiàn)象普遍。本研究發(fā)現(xiàn)三江縣、賀州市和道縣等野生種居群，尤其是居群較小的雙牌縣和博白縣野生種居群均存在大量幾乎無遺傳差異個體，這些個體應(yīng)是通過莖無性克隆繁殖而來，表明通過莖無性克隆繁殖是野生羅漢果擴張種群的重要方式，改變了長期以來人們以為羅漢果野外主要依靠種子繁衍群體的認識。地方種群體也存在一定數(shù)量幾乎無遺傳差異的個體，栽培種群體種質(zhì)間幾乎無遺傳差異的現(xiàn)象則最為突出，雌性和雄性栽培種群體均存在大量幾乎無遺傳差異的個體，尤其是主栽雌性青皮果品種已變得非常單一，這些表明羅漢果種植過程中不同產(chǎn)區(qū)和不同育苗場間存在過度相互引種問題，是栽培種遺傳基礎(chǔ)變得較為狹窄的重要原因。

羅漢果不同群體進化關(guān)系依次為近緣種、野生種、地方種、栽培種，符合作物由野生種到地方種再到栽培種的一般馴化規(guī)律。野生種、地方種、栽培種群體a、e、、e等遺傳多樣性參數(shù)由大到小均分別為野生種、地方種、栽培種，其中a分別為11.333、5.533、2.133，分別為1.798、1.092、0.603，平均遺傳距離分別為0.802 1、0.576 8、0.422 0。這些結(jié)果均表明野生種保留了最豐富的遺傳多樣性，地方種的遺傳多樣性次之，栽培種遺傳多樣性已較低，與前人研究結(jié)果類似[24-26]。因此，要培育具有突破性的良種，羅漢果育種過程中要充分發(fā)掘野生種和地方種優(yōu)異基因資源來拓寬栽培種的遺傳基礎(chǔ)以獲取更高的雜種優(yōu)勢。再有，如上所述，野生羅漢果主要以莖無性克隆方式繁衍種群，那么其遺傳進化速度將會比較慢。種質(zhì)采集過程中發(fā)現(xiàn)，因墾荒、伐木和修路活動影響，文獻原記載的肇慶市、興安縣和博白縣居群已遭毀滅，三江縣和乳源縣居群個體數(shù)量也已銳減，永?？h和金秀縣居群正瀕臨破壞。因此，及早從不同亞群中野生居群，尤其像遺傳關(guān)系遠、攜帶私有等位基因較多、個體稀少的乳源縣居群，以及永福縣和龍南縣等遺傳豐富且距離差異大的居群中，鑒定出存在遺傳差異個體進行收集保存，對防止羅漢果種質(zhì)遭破壞而遺傳多樣性流失具有重要作用，也可為探究羅漢果起源進化歷史留存關(guān)鍵材料。

雖然140份羅漢果初級核心種質(zhì)在遺傳距離0.8處可分為9個亞群，但是群體結(jié)構(gòu)和主坐標分析均將這些種質(zhì)最終劃分為四個亞群，其中近緣種與野生種可劃分為3個亞群，地方種及栽培種歸屬一個亞群，表明羅漢果種質(zhì)存在4個明顯基因庫，雖然與解兵斌[26]推測羅漢果在第4紀冰期存在廣西東北部（廣西興安縣、三江縣、永福縣、臨桂區(qū)和金秀縣）、萌渚嶺（湖南道縣、廣西賀州市和廣東肇慶市）、大庾嶺與武功山（廣東韶關(guān)市、江西龍南縣、廣東乳源、江西萍鄉(xiāng)）和云開山脈（廣西浦北縣）4個避難所數(shù)量相吻合，但是除Cluster1、2、3亞群分布區(qū)域分別與大庾嶺與武功山、廣西東北部、萌渚嶺3個避難所基本一致外，Cluster4亞群種質(zhì)則主要為源自永?？h與臨桂區(qū)兩個栽培起源中心地方種、栽培種和臨桂區(qū)、柳州市、雙牌縣野生種，其分布區(qū)域與云開山脈避難所廣西合浦縣不一致。二者不一致的原因可能是本研究分析的為核基因組而非細胞器基因組，使得2個避難所群體種質(zhì)因基因交流合并為1個亞群，或是未采集到云開山脈避難所廣西浦北縣群體種質(zhì)所致。Cluster4亞群種質(zhì)來自廣西東北部避難所區(qū)域，但與同來自該避難所區(qū)域興安縣、三江縣和永?？h的Cluster2亞群種質(zhì)劃分為不同亞群，表明其是該避難所區(qū)域中以往尚未發(fā)現(xiàn)的1個新基因庫，可能由羅漢果栽培起源中心人們在栽培過程中引種臨桂區(qū)等野生種質(zhì)并有性繁殖而形成。

重要性狀基因發(fā)掘是作物種質(zhì)資源分子評價的重要內(nèi)容。GWAS為近年作物重要性狀基因挖掘、連鎖標記開發(fā)和遺傳結(jié)構(gòu)解析等研究廣泛應(yīng)用的有效方法，其具有使用自然群體作為研究材料、分析精度達到單基因水平、同時分析多個性狀等優(yōu)勢，有助于克服羅漢果雜合度高、生長周期長、遺傳連鎖作圖群體構(gòu)建難度大等問題，也必將在羅漢果重要性狀遺傳結(jié)構(gòu)解析和連鎖標記開發(fā)中獲得重要應(yīng)用。遺傳基礎(chǔ)廣、變異豐富、代表性強遺群體材料可減少GWAS研究所需種質(zhì)數(shù)量和提高其分析精度與效率。本研究廣泛收集代表性區(qū)域近緣種、野生種、地方種和栽培種等資源325份，通過SSR熒光標記從中鑒別獲得140份具有遺傳差異的羅漢果初級核心種質(zhì)，為羅漢果重要性狀的GWAS和群體遺傳進化等研究提供了重要基礎(chǔ)材料。但是，這140份初級核心種質(zhì)與GWAS所需的理想種質(zhì)數(shù)目存在一定差距，并且群體結(jié)構(gòu)和主坐標分析表明它們存在由4個血緣較單一亞群組成的遺傳分層結(jié)構(gòu)，亞群間基因交流頻率低（m＝1.128），加之羅漢果野生居群小而且個體數(shù)量相差很大，這可能導(dǎo)致亞群間等位基因頻率分布不均衡，GWAS分析時增加染色體間連鎖不平衡性，產(chǎn)生大量的假陽性關(guān)聯(lián)。為了控制復(fù)雜群體結(jié)構(gòu)對羅漢果性狀GWAS分析結(jié)果的影響，除了可以使用不同統(tǒng)計分析模型外，從構(gòu)建的32份核心種質(zhì)中選取代表性種質(zhì)構(gòu)建羅漢果巢式關(guān)聯(lián)群體（nested association mapping，NAM）或者多親本高級世代互交系群體（multi-parent advanced generation inter-cross，MAGIC）用于研究是一個理想選擇。這既可為羅漢果性狀GWAS分析提供充足個體數(shù)量，也有利于保留羅漢果進化過程中累積的重組事件，降低群體連鎖不平衡性，提高分析精度。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on genetic diversity and population structure and core collection of

MO Chang-ming1, XIE Wen-juan2, GUO Wen-feng1, ZHANG Yan-ling3, HUANG Jiang2, ZHANG Xin-dan3, LI Zhong1, TANG Qi4, MA Xiao-jun5

1. Guangxi Key Laboratory of Crop Genetic Improvement Biotechnology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China 2. Guilin Medical University, Guilin 541001, China 3. Guilin GFS Monk Fruit Corporation, Guilin 541006, China 4. College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China 5. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To analyze the genetic basis ofgermplasm resources in order to provide the basis for germplasm protection, variety improvement, and genetic structure of traits.The genetic relationship of 325 germplasm resources ofand its relative species were analyzed by fluorescently labeled SSR markers. Based on this, the genetic diversity and population genetic structure ofwere analyzed and its core collection was constructed.A total of 185 alleles weredetected by 15 pairs of optimized SSR fluorescent primers (average 12.33 per pair of SSR primer) in these 325 germplasm resources, average Shannon’s information index of these alleles was 1.67, and polymorphism information content (PIC) were equal to or above 0.54. The 325 germplasm resources were divided into three subgroups by relative clustering analysis, namely,andat a genetic distance of 0.95. Among them, a great number of individuals of thesubgroup were found to have almost no genetic differences. A total of 140 germplasm resources ofwith genetic differences were identified as a raw core collection. The genetic differentiation coefficient Fstof this raw core collection was 0.140. The percentages of genetic variation among populations, within populations, and among individuals in total variation of raw core collection were 14.0%, 19.0%, and 67.0%, respectively. The average genetic distance was respectively 0.802 1, 0.576 8 and 0.422 0, and Shannon’s information index I were respectively 1.798, 1.092, 0.603 for wild species, landraces, and cultivars. The raw core collection was divided into nine subgroups where genetic distance was 0.8 by clustering analysis of Jaccard genetic distance and four subgroups by population structure and principal component analysis. Random sampling ratios of 10%—70% were performed to establish a core collection with 32 germplasm resources. The core collection accounted for 94.12 % of original germplasm, and the coincidence rate between the allele number and the original germplasm was 96.13%, and Shannon’s information index was 1.944 9.The polymorphism of selective 15 pairs of SSR fluorescent primers was high and could effectively identifyand its related species,and. The raw core collection ofis moderately genetically differentiated, with genetic variations mainly occurred within populations and individuals, high genetic diversity between wild and local species, low genetic diversity between cultivated species, and the existence of four distinct gene pools. The constructed 32 core collection could fully represent the original germplasm resources' geographical origin and genetic diversity.

(Swingle) C. Jeffrey; SSR fluorescent markers; genetic diversity; population structure; core collection

R286.12

A

0253 - 2670(2023)18 - 6040 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.022

2023-02-03

國家自然科學(xué)基金區(qū)域創(chuàng)新發(fā)展聯(lián)合基金重點項目（U20A2004）；國家自然科學(xué)基金項目（32270398）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項目（桂農(nóng)科2022JM65，桂農(nóng)科2018JZ36）；湖南省重點研發(fā)項目（2022NK2004）

莫長明，男，博士，副研究員，研究方向為植物遺傳資源評價與分子育種。E-mail: mochming@126.com

唐 其，男，博士，副教授，博士生導(dǎo)師，從事藥用植物遺傳育種研究。E-mail: tangqi@hunau.edu.cn

馬小軍，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事分子生藥學(xué)研究。E-mail: xjma@implad.ac.cn

#共同第一作者：謝文娟E-mail: xiewenjuan@glmc.com

[責任編輯 時圣明]