王 睿 任 毅 程宇坤 王 偉,3 張志輝 耿洪偉,*

小麥旗葉形態(tài)相關(guān)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

王 睿1,2任 毅1,2程宇坤1,2王 偉1,2,3張志輝1,2耿洪偉1,2,*

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)專用麥類作物工程技術(shù)研究中心, 新疆烏魯木齊 830052;2新疆小麥產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 新疆烏魯木齊 830052;3安陽(yáng)工學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與信息工程系, 河南安陽(yáng) 455000

小麥旗葉是進(jìn)行光合作用的主要功能葉, 對(duì)產(chǎn)量有著重要貢獻(xiàn)。為了解小麥旗葉形態(tài)的遺傳機(jī)制, 挖掘旗葉形態(tài)相關(guān)性狀的候選基因, 本研究采用300份小麥品種(系), 結(jié)合90K SNP基因芯片對(duì)5種環(huán)境下正常灌溉(NI)和干旱脅迫(DS)條件下的旗葉長(zhǎng)、寬、面積進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明, 旗葉長(zhǎng)、寬、面積在2種水分處理下表現(xiàn)出顯著差異(<0.05), 在不同的環(huán)境下表現(xiàn)出豐富的表型變異, 變異系數(shù)為0.07～0.23。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome- wide association study, GWAS)結(jié)果顯示, 共檢測(cè)到37個(gè)與旗葉長(zhǎng)、寬、面積顯著相關(guān)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn), 分布于1D、2A、2B、3A、3D、4A、5A、5B、6A、6B、7A、7B染色體上, 單個(gè)SNP位點(diǎn)可解釋遺傳變異為3.70%～9.05%, 其中正常灌溉下檢測(cè)到22個(gè)穩(wěn)定遺傳位點(diǎn), 干旱脅迫下檢測(cè)到15個(gè)穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)。2種處理下共同檢測(cè)到的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)有8個(gè), 位于2B、3A、5A、6A、7A、7B染色體上。在2B、3A、6A、7A染色體上檢測(cè)到5個(gè)同時(shí)與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)。對(duì)穩(wěn)定遺傳且貢獻(xiàn)率較大的標(biāo)記處進(jìn)行單倍型分析, 發(fā)現(xiàn)與旗葉長(zhǎng)顯著相關(guān)的Kukri_ c1406_275 (2=9.05%)標(biāo)記存在FLL-Hap1、FLL-Hap2和FLL-Hap3三種單倍型, 與旗葉面積顯著相關(guān)的wsnp_ bq170165A_Ta_1_1 (2=7.88%)標(biāo)記同樣存在FLA-Hap1、FLA-Hap2和FLA-Hap3三種單倍型。結(jié)合表型分析, 在300份冬小麥品種(系)中含有FLL-Hap1 (出現(xiàn)頻率為77.78%)或FLL-Hap2 (18.89%)單倍型品種(系)的旗葉長(zhǎng)顯著高于含有FLL-Hap3 (3.33%)單倍型品種(系)的旗葉長(zhǎng), 含有FLA-Hap1 (48.19%)單倍型品種(系)的旗葉面積顯著高于含有FLA-Hap2 (30.80%)或FLA-Hap3 (21.01%)單倍型品種(系)的旗葉面積(<0.05)。不同單倍型在不同冬小麥品種(系)中分布不同, 單倍型FLL-Hap1在國(guó)外品種(系)占比較大, 單倍型FLL-Hap2、FLL-Hap3分別在北部冬麥區(qū)和西南冬麥區(qū)占比較大。單倍型FLA-Hap1和FLA-Hap2分別在西南冬麥區(qū)和北部冬麥區(qū)出現(xiàn)頻率較高, 單倍型FLA-Hap3在所有冬麥區(qū)無(wú)較高出現(xiàn)頻率。對(duì)多環(huán)境下檢測(cè)到的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)進(jìn)行候選基因挖掘, 篩選出5個(gè)與旗葉形態(tài)相關(guān)的候選基因, 這些候選基因可作為旗葉相關(guān)性狀重要基因。

小麥; 旗葉形態(tài)性狀; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 單倍型; 候選基因

作為三大糧食作物之一的小麥在全世界范圍內(nèi)都有較廣泛的種植[1]。我國(guó)是全球最大的小麥消費(fèi)國(guó)和生產(chǎn)國(guó), 小麥種植面積占糧食作物總面積22%左右[2]。小麥的旗葉通常指抽穗前的最后1片葉或穗下的第1片葉, 旗葉是小麥葉片中進(jìn)行光合作用的主要功能葉, 占小麥葉片總光合作用的50%[3], 同時(shí)對(duì)籽粒中碳水化合物積累的貢獻(xiàn)率可達(dá)40%[4]。王義芹等[5]和王敏等[6]研究發(fā)現(xiàn)旗葉長(zhǎng)、寬、面積均與穗粒重、千粒重、穗粒數(shù)呈極顯著正相關(guān), 旗葉面積和光合速率的乘積與單株產(chǎn)量呈顯著正相關(guān), 旗葉面積與退化小穗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān), 因此旗葉形態(tài)對(duì)產(chǎn)量有著重要貢獻(xiàn)。但隨著近年來(lái)全球氣溫升高, 干旱脅迫已成為限制小麥高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的主要因素[7], 而旗葉形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)隨著環(huán)境的變化發(fā)生改變[8], 因此研究小麥旗葉性狀及其在不同環(huán)境下的遺傳調(diào)控機(jī)制, 對(duì)培育高產(chǎn)抗逆小麥品種有重要意義。

小麥旗葉相關(guān)性狀是受到多個(gè)基因調(diào)控的數(shù)量性狀, 遺傳機(jī)制復(fù)雜[9], 但隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)快速發(fā)展, 分子標(biāo)記輔助育種在數(shù)量性狀研究方面展現(xiàn)出耗時(shí)短, 范圍廣, 精度高等優(yōu)勢(shì)。目前利用小麥不同遺傳群體已經(jīng)定位到了許多與旗葉形態(tài)性狀相關(guān)的位點(diǎn)。Liu等[9]利用213個(gè)家系的RIL群體(ND3331/Zang1817), 對(duì)5個(gè)環(huán)境條件下旗葉形態(tài)相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析, 其中在多個(gè)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)與旗葉長(zhǎng)、寬、面積關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)分別有7個(gè)、3個(gè)、5個(gè), 位于1B、2B、3A、4B、5A染色體上, 分別可解釋遺傳變異的5.87%～12.11%、6.06%～14.70%和5.62%～68.52%。呂學(xué)蓮等[10]以寧春4號(hào)Drasdale構(gòu)建的148個(gè)家系的RIL群體為材料, 在正常和干旱條件下均檢測(cè)到2D、7D染色體上旗葉寬QTL和, 分別解釋遺傳變異的39.83%、18.76%。Fan等[11]通過(guò)RIL群體188份家系對(duì)旗葉性狀進(jìn)行QTL定位, 在6個(gè)環(huán)境下設(shè)置低氮和高氮處理, 發(fā)現(xiàn)位于4B、6B染色體上的旗葉寬QTL和以及5B染色體上的旗葉面積QTL能在多環(huán)境中檢測(cè)到, 分別解釋遺傳變異的12.42%、13.06%和10.07%。Jia等[12]利用280個(gè)重組自交系為材料, 在3個(gè)環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到位于5B染色體的, 可解釋遺傳變異35.6%。Xue[13]利用近等基因系次級(jí)F2群體為材料, 對(duì)Jia等[12]發(fā)現(xiàn)的精細(xì)定位并發(fā)現(xiàn)與赤霉病抗性基因緊密連鎖。此外, 單倍型同樣被認(rèn)定為一種分子標(biāo)記, 已被用于對(duì)小麥不同性狀相關(guān)基因的檢測(cè)和輔助選擇。朱治等[14]對(duì)株高, 千粒重和穗下節(jié)長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行單倍型分析, 檢測(cè)到Hap-3B-1和Hap-3B-2兩種單倍型, 與表型結(jié)合發(fā)現(xiàn)Hap-3B-2是矮稈、高千粒重相關(guān)聯(lián)的單倍型。劉朦朦等[15]對(duì)310份高代育成品種(系)的旗葉寬相關(guān)QTL單倍型分析, 發(fā)現(xiàn)優(yōu)異單倍型(AAA)出現(xiàn)頻率為16.13%, 表明還有較大改良空間。

目前, 對(duì)小麥旗葉形態(tài)的研究多是基于連鎖分析, 并且這些研究主要是在正常灌溉條件下進(jìn)行的, 有關(guān)旗葉形態(tài)相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及干旱脅迫對(duì)其影響的報(bào)道較少。因此, 本研究以300份品種(系)為試驗(yàn)材料, 在正常灌溉和干旱脅迫下對(duì)小麥旗葉相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome- wide association study, GWAS), 以期為小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種和旗葉相關(guān)性狀遺傳機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試冬小麥品種(系)共計(jì)300份, 其中國(guó)外品種(系) 65份, 我國(guó)西南冬麥區(qū)品種(系) 22份, 長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)品種(系) 41份, 黃淮冬麥區(qū)品種(系) 121份, 北部冬麥區(qū)品種(系) 51份。上述材料均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)專用麥類作物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 田間種植 供試材料分別于2020—2021年、2021—2022年種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站(44.30°N, 86.25°E, 2020—2021年簡(jiǎn)稱E1, 2021—2022年簡(jiǎn)稱E2)和新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院澤普試驗(yàn)基地(38.24°N, 77.3°E, 2020—2021年簡(jiǎn)稱E3, 2021—2022年簡(jiǎn)稱E4)。設(shè)置正常滴灌和干旱脅迫2個(gè)處理, 正常灌溉(normal irrigation, NI)、干旱脅迫(drought stress, DS)小區(qū)之間設(shè)置3 m的隔離區(qū), 隔離區(qū)澆水同干旱脅迫區(qū)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 每個(gè)處理2次重復(fù), 干旱脅迫處理為拔節(jié)期后每次滴灌澆水量是正常澆水量的50%。每份材料3行種植, 行長(zhǎng)2 m, 行距0.2 m。試驗(yàn)田土壤肥力、施肥、滴灌、防蟲及除草基本一致。

1.2.2 表型測(cè)定及分析 試驗(yàn)材料開花15 d后每個(gè)品種(系)隨機(jī)取5株測(cè)量旗葉長(zhǎng)、寬, 并計(jì)算旗葉面積, 取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。旗葉面積計(jì)算公式: 旗葉長(zhǎng)×旗葉寬×0.77 (小麥葉面積校正系數(shù))[16]。旗葉長(zhǎng)度量取葉耳至葉尖的直線長(zhǎng)度, 寬度量取葉片最寬處。

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 采用SPSS 22.0 (IBM Corporation, 美國(guó))、QTL IciMapping V4.1[17]軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)描述性分析、廣義遺傳率的估算。廣義遺傳率計(jì)算公式:B2=g2/ (g2+e2), 其中g(shù)2為遺傳方差和e2為環(huán)境方差。對(duì)不同環(huán)境下的表型值進(jìn)行最佳線性無(wú)偏估計(jì)(best linear unbiased estimations), 運(yùn)用R程序包lme4中的混合線性模型獲得各個(gè)性狀的BLUE值[18]。

1.3 群體結(jié)構(gòu)及連鎖不平衡分析

課題組前期對(duì)本研究采用的90K SNP芯片(博奧晶典公司檢測(cè))進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)質(zhì)量控制, 去除缺失率大于20%且最小等位基因頻率(MAF, minor allele frequency)小于5%的SNP標(biāo)記, 共保留16,710個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行下一步關(guān)聯(lián)分析。采用PowerMarker V3.25軟件[17]計(jì)算試驗(yàn)材料多態(tài)性信息(PIC, Polymorphic information content), PIC = 1 ? Σ2(2表示第個(gè)位點(diǎn)的第個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率)[19]。從篩選出的標(biāo)記中選出2000個(gè)在染色體上均勻分布的SNP標(biāo)記, 應(yīng)用Structure 2.3.4軟件[17]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析, 參數(shù)值設(shè)定為length of burn in period=10,000, MCMC Reps after Burn in=100,000, 選擇admixture model模型和allele frequencies independent模式, 設(shè)=2～12, 每個(gè)值重復(fù)運(yùn)行5次。將獲得結(jié)果上傳至Structure Harvester (http://taylor0.biology.ucla.edu/struct harvest/)[20], 獲得最佳值為亞群數(shù)目。使用Tassel 5.0軟件[17]對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行主成分分析(principle component analysis, PCA), 結(jié)果數(shù)據(jù)利用R中g(shù)gplot2工具進(jìn)行可視化處理。

以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方(2)作為衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)參數(shù)。采用Tassel 5.0軟件計(jì)算2, 以第95百分位的2值作為閾值估測(cè)LD衰減距離。關(guān)聯(lián)分析中, LD衰減距離內(nèi)的位點(diǎn)可看作同一個(gè)位點(diǎn)。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因篩選

應(yīng)用Tassel 5.0軟件中的MLM混合線性模型(Q+K模型)對(duì)小麥旗葉形態(tài)相關(guān)性狀在不同環(huán)境下的均值以及BULE值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 以= 1.0×10?3為閾值, 判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性[21]。MLM混合線性模型包含固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)模型, 固定效應(yīng)模型由群體結(jié)構(gòu)(Q)擬合而成, 隨機(jī)效應(yīng)由親緣關(guān)系(K)擬合而成, 群體結(jié)構(gòu)(Q)通過(guò)Structure 2.3.4軟件統(tǒng)計(jì)獲得, 親緣關(guān)系(K)通過(guò)Tassel 5.0軟件中Kinship模塊統(tǒng)計(jì)獲得。曼哈頓圖(Manhattan plot)及Quantile-Quantile圖使用R中CMplot程序包繪制。

在至少2個(gè)環(huán)境中出現(xiàn)的位點(diǎn)視作穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn), 將穩(wěn)定遺傳的SNP標(biāo)記的延伸序列在小麥WheatOmics 1.0數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI網(wǎng)站(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST比對(duì), 對(duì)候選位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

1.5 單倍型分析

為了檢驗(yàn)旗葉性狀相關(guān)位點(diǎn)標(biāo)記的特異性并發(fā)現(xiàn)與旗葉性狀相關(guān)單倍型, 選擇最顯著的標(biāo)記及其前后各3個(gè)標(biāo)記, 在300份自然群體材料基因型數(shù)據(jù)中提取所選擇芯片的SNP標(biāo)記信息。使用Haploview 4.1軟件進(jìn)行單倍型分析[21], Haploview通過(guò)計(jì)算排除不符合Hardy-Weinberg平衡的SNP以及信息缺失超過(guò)50%的個(gè)體基因型, 之后計(jì)算相鄰SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡系數(shù)(′), 采用′置信區(qū)間法(confidence intervals, CI)[22]劃分單倍域,′值95% CI在0.70～0.98范圍內(nèi)的相鄰SNP位點(diǎn)同為一個(gè)單倍域。應(yīng)用Haploview 4.1軟件進(jìn)行單倍型分析前需要將提取出的SNP標(biāo)記信息整理成info文件和ped文件, info文件記載2列信息, SNP的id及在染色體上的位置, ped文件記載樣本信息和基因型信息, 在軟件Linkage Format界面上傳文件并設(shè)定參數(shù)為計(jì)算500 kb范圍內(nèi)標(biāo)記SNP的LD值, 個(gè)體基因型信息缺失超過(guò)50%時(shí)將數(shù)據(jù)排除在外。之后根據(jù)單倍域情況, 結(jié)合材料表型數(shù)據(jù), 找出區(qū)間內(nèi)較優(yōu)異單倍型。

2 結(jié)果與分析

2.1 旗葉形態(tài)性狀表型分析

對(duì)300份品種(系)在正常灌溉和干旱脅迫下的表型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)(表1), 旗葉長(zhǎng)、寬、面積在所有環(huán)境下均表現(xiàn)為正常灌溉顯著高于干旱脅迫(< 0.05), 說(shuō)明干旱脅迫對(duì)旗葉生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。同時(shí), 所有性狀的變異系數(shù)均表現(xiàn)為E1、E2大于E3、E4, 旗葉面積變異系數(shù)總體大于旗葉長(zhǎng)和旗葉寬, 其中旗葉寬變異系數(shù)最小, 因此年份間及不同生態(tài)條件等外部環(huán)境顯著影響旗葉形態(tài)相關(guān)性狀。3個(gè)性狀在群體中的峰度和偏度值的絕對(duì)值都小于1, 符合正態(tài)分布, 表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)。方差分析表明(表2), 不同環(huán)境下測(cè)得旗葉長(zhǎng)、寬、面積的基因型、環(huán)境及基因環(huán)境互作差異極顯著(<0.01),其遺傳力分別為0.77、0.85、0.75, 說(shuō)明旗葉形態(tài)性狀主要受遺傳因素影響。

表1 不同環(huán)境下群體表型變異統(tǒng)計(jì)分析

(續(xù)表1)

NI: 正常灌溉; DS: 干旱脅迫; E1: 2020–2021瑪納斯; E2: 2021–2022瑪納斯; E3: 2020–2021澤普; E4: 2021–2022澤普; BLUE: 最佳線性無(wú)偏估計(jì); 平均值后面的不同小寫字母表示不同類型間差異顯著(< 0.05)。

NI: normal irrigation; DS: drought stress; E1: 2020?2021 Manas; E2: 2021?2022 Manas; E3: 2020?2021 Zep; E4: 2021?2022 Zep; BLUE: the best linear unbiased estimation. Different lowercase letters after the average data indicate significant differences between different types at< 0.05.

表2 不同環(huán)境下群體表型方差分析

FLL: 旗葉長(zhǎng); FLW: 旗葉寬; FLA: 旗葉面積。

FLL: flag leaf length; FLW: flag leaf width; FLA: flag leaf area.

2.2 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

采用PowerMarker V3.25軟件計(jì)算試驗(yàn)材料多態(tài)性信息, 結(jié)果表明, 從小麥90K SNP芯片中篩選出的16,710個(gè)SNP標(biāo)記分布于所有染色體, 平均每條染色體的標(biāo)記間物理距離為0.84 Mb, 3個(gè)染色體組的PIC表現(xiàn)為A、B染色體組大于D染色體組, 全基因組的平均PIC為0.26。利用Structure 2.3.4軟件對(duì)300份小麥品種(系)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析, 對(duì)每個(gè)可能的值模擬運(yùn)算。結(jié)果顯示在=3時(shí), Δ值達(dá)到最大, 曲線程度變化最大, 由此可知供試材料分為3個(gè)亞群(圖1-A, C), PCA分析結(jié)果與Structure軟件分析一致(圖1-B)。亞群1共有81份品種(系), 亞群2共有73份品種(系), 亞群3共有146份品種(系), 3個(gè)亞群所含材料品種(系)分布占總材料品種(系)的27.0%、24.3%和48.7%。應(yīng)用Tassel 5.0 軟件計(jì)算300份小麥品種(系)在全基因組的LD衰減距離為8 Mb。依據(jù)全基因組LD衰減距離, 將物理圖譜上前后8 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個(gè)候選位點(diǎn)。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用Tassel 5.0軟件對(duì)300份小麥品種(系)的3種旗葉形態(tài)性狀結(jié)合90K SNP芯片篩選出的16,710個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 采用MLM (mixed linear model, MLM) Q+K關(guān)聯(lián)混合模型。通過(guò)GWAS分析, 共定位到37個(gè)在2個(gè)及以上環(huán)境中檢測(cè)到的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn), 分布于1D、2A、2B、3A、3D、4A、5A、5B、6A、6B、7A、7B染色體上, 可解釋遺傳變異的3.70%～9.05%。圖2為2種水分處理下BLUE值的旗葉形態(tài)的曼哈頓圖和Quantile- Quantile圖, 可以發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)主要分布于2B、3A、5A、7A染色體上。正常灌溉條件下檢測(cè)到與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的穩(wěn)定遺傳標(biāo)記位點(diǎn)12個(gè), 分布于2A、3A、5A、7A、7B染色體上, 可解釋遺傳變異的3.78%～9.05%, 與旗葉寬相關(guān)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)7個(gè), 分布于1D、2B、4A、5B、6A、7A染色體上, 可解釋遺傳變異的3.79%～7.45%, 與旗葉面積相關(guān)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)3個(gè), 分布于3A、7A染色體上, 可解釋遺傳變異的3.70%～7.88%。干旱脅迫條件下檢測(cè)到與旗葉長(zhǎng)相關(guān)的穩(wěn)定遺傳標(biāo)記位點(diǎn)9個(gè), 分布于2B、3A、5A、6A、6B、7A、7B染色體上, 可解釋遺傳變異的3.74%～8.40%, 與旗葉寬相關(guān)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)3個(gè), 分布于3D、6A、7A染色體上, 可解釋遺傳變異的4.23%～7.30%, 與旗葉面積相關(guān)的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)3個(gè), 分布于2B、7A染色體上, 可解釋遺傳變異的3.94%～7.62%。在2種處理下共同檢測(cè)到與旗葉性狀相關(guān)的穩(wěn)定遺傳標(biāo)記位點(diǎn)8個(gè), 分別是位于2B染色體上的Ra_c19501_1510, 位于3A染色體上的wsnp_Ex_c18747_27625264、位于5A染色體上的BS00022378_51和BobWhite_c8266_227、位于6A染色體上的RFL_Contig2206_1694, 位于7A染色體上的Kukri_c1406_275和wsnp_bq170165A_Ta_1_1,以及位于7B染色體上的BS00067530_51 (表3)。這些位點(diǎn)屬于既不受環(huán)境影響又不受水分影響的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)。

圖1 300份小麥品種(系)群體結(jié)構(gòu)分析

A: 群體的Δ值; B: 主成分分析圖; C: 群體結(jié)構(gòu)示意圖。

A: the estimation of ?value in population; B: principal component analysis; C: group structure diagram.

在穩(wěn)定遺傳的標(biāo)記位點(diǎn)中, 位于2B染色體上的Ra_c19501_1510同時(shí)與旗葉寬、旗葉面積顯著關(guān)聯(lián), 可解釋遺傳變異的3.94%～6.77%, 位于3A染色體上的wsnp_Ex_c18747_27625264、RAC875_c10194_ 673同時(shí)與旗葉長(zhǎng)、旗葉面積顯著關(guān)聯(lián), 可解釋遺傳變異分別為3.85%～6.84%和3.70%～5.04%, 位于6A染色體上的RFL_Contig2206_1694同時(shí)與旗葉長(zhǎng)、旗葉寬顯著關(guān)聯(lián), 可解釋遺傳變異的3.87%～6.45%, 位于7A染色體上的Tdurum_contig66023_89同時(shí)與旗葉寬、旗葉面積顯著關(guān)聯(lián), 可解釋遺傳變異的4.23%～7.62% (表3)。這些顯著關(guān)聯(lián)的穩(wěn)定遺傳標(biāo)記位點(diǎn)可能是控制小麥旗葉形態(tài)的一因多效位點(diǎn), 后續(xù)加以驗(yàn)證, 或?qū)Ψ肿訕?biāo)記聚合育種具有重要意義。

2.4 小麥旗葉形態(tài)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的單倍型分析

選擇位于7A染色體上能夠在2種處理及多環(huán)境下檢測(cè)到且表型變異較大位點(diǎn)Kukri_c1406_275 (2=9.05%)、wsnp_bq170165A_Ta_1_1 (2=7.88%)標(biāo)記進(jìn)行單倍型分析, 結(jié)果如圖3-A所示。與旗葉長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的Kukri_c1406_275標(biāo)記處被分成FLL- Hap1、FLL-Hap2和FLL-Hap3三個(gè)單倍型, 與旗葉面積關(guān)聯(lián)的wsnp_bq170165A_Ta_1_1標(biāo)記處同樣被分成FLA-Hap1、FLA-Hap2和FLA-Hap3三個(gè)單倍型(表4), 對(duì)單倍型出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 發(fā)現(xiàn)在300份品種(系)中FLL-Hap1、FLL-Hap2和FLL-Hap3出現(xiàn)頻率為77.78%、18.89%和3.33%, 正常灌溉和干旱脅迫下含有FLL-Hap1或FLL-Hap2單倍型品種(系)的旗葉長(zhǎng)之間無(wú)顯著差異, 但二者顯著高于含有FLL-Hap3單倍型品種(系)的旗葉長(zhǎng)(<0.05)。單倍型FLA-Hap1、FLA-Hap2和FLA-Hap3在300份品種(系)中的出現(xiàn)頻率分別為48.19%、30.80%和21.01%, 正常灌溉和干旱脅迫下具有FLA-Hap1單倍型品種(系)的旗葉面積要顯著高于具有FLA-Hap2或FLA-Hap3單倍型品種(系)的旗葉面積, 具有FLA-Hap3單倍型品種(系)的旗葉面積要顯著高于具有FLA-Hap2單倍型品種(系)的旗葉面積(<0.05) (表4)。綜上所述, 具有FLL-Hap3單倍型品種(系)的旗葉長(zhǎng)相對(duì)較短, 具有FLA-Hap1單倍型品種(系)表現(xiàn)出了較大的旗葉面積。由于近年來(lái)育種家更傾向于選擇旗葉短且寬, 株型緊湊的材料。因此FLL-Hap3和FLA-Hap1可能是改變旗葉形態(tài)的重要單倍型。

(圖2)

圖2 不同處理下BLUE值的旗葉形態(tài)的曼哈頓圖和Q-Q圖

A: 正常灌溉旗葉長(zhǎng); B: 干旱脅迫旗葉長(zhǎng); C: 正常灌溉旗葉寬; D: 干旱脅迫旗葉寬; E: 正常灌溉旗葉面積; F: 干旱脅迫旗葉面積。

A: normal irrigation flag leaf length; B: drought stress flag leaf length; C: normal irrigation flag leaf width; D: drought stress flag leaf width; E: normal irrigation flag leaf area; F: drought stress flag leaf area.

對(duì)不同來(lái)源小麥品種(系)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)含有FLL-Hap1單倍型品種(系)在國(guó)外品種(系)中出現(xiàn)頻率較高(96.72%), 含有FLL-Hap2單倍型品種(系)在北部冬麥區(qū)(41.67%)中出現(xiàn)頻率較高, 而含有FLL-Hap3單倍型品種(系)在西南冬麥區(qū)出現(xiàn)頻率較高(圖3-B)。具有FLA-Hap1單倍型品種(系)在西南冬麥區(qū)出現(xiàn)頻率較高(90.00%), 具有FLA-Hap2單倍型品種(系)在北部冬麥區(qū)出現(xiàn)頻率較高(79.59%), 而具有FLA-Hap3單倍型品種(系)在所有冬麥區(qū)中沒有較高出現(xiàn)頻率(圖3-C)。其中含有FLL-Hap3或FLA-Hap1單倍型品種(系)主要來(lái)源于西南冬麥區(qū), 猜測(cè)西南冬麥區(qū)在對(duì)小麥產(chǎn)量改良過(guò)程中考慮到了旗葉形態(tài)對(duì)產(chǎn)量的影響, 因此該區(qū)小麥品種的旗葉形態(tài)受到正向選擇。

FLL: 旗葉長(zhǎng); FLA: 旗葉面積; NI: 正常灌溉; DS: 干旱脅迫。平均值后面的不同小寫字母表示不同類型間差異顯著(< 0.05)。

FLL: flag leaf length; FLA: flag leaf area; NI: normal irrigation; DS: drought stress. Different lowercase letters indicate significant differences between different types at< 0.05.

圖3 與旗葉性狀相關(guān)單倍型分析

A: 7A染色體上Kukri_c1406_275和wsnp_bq170165A_Ta_1_1標(biāo)記關(guān)聯(lián)的連鎖區(qū)域; B: 不同麥區(qū)中Kukri_c1406_275標(biāo)記的3個(gè)單倍型分布頻率; C: 不同麥區(qū)中wsnp_bq170165A_Ta_1_1標(biāo)記的3個(gè)單倍型分布頻率; NWWR: 北部冬麥區(qū); FV: 國(guó)外品種(系); YHFWWR: 黃淮冬麥區(qū); SWWR: 西南冬麥區(qū); MLYWWR: 長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)。

A: LD regions associated with Kukri_c1406_275 and wsnp_bq170165A_Ta_1_1 markers on chromosome 7A; B: haplotype distribution frequency of Kukri_c1406_275 in different wheat regions; C: haplotype distribution frequency of wsnp_bq170165A_Ta_1_1 in different wheat regions. NWWR: the northern winter wheat region; FV: foreign varieties; YHFWWR: the Yellow and Huai facultative winter wheat region; SWWR: the Southwestern winter wheat region; MLYWWR: the middle and low Yangtze winter wheat region.

2.5 小麥旗葉形態(tài)候選基因預(yù)測(cè)

將與旗葉長(zhǎng)、寬、面積相關(guān)的穩(wěn)定遺傳SNP標(biāo)記序列在普通小麥中國(guó)春數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLAST進(jìn)行檢索, 并在WheatOmics 1.0數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取基因組區(qū)間的基因信息, 共發(fā)現(xiàn)5個(gè)最有可能與旗葉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的候選基因, 分別編碼F-box家族蛋白(), 2-酮戊二酸(2OG)和Fe(II)依賴性加氧酶超家族蛋白(), GDSL酯酶/脂肪酶()。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)5最有可能與抗旱性相關(guān)的候選基因, 它們是編碼F-box家族蛋白的基因, 編碼GDSL酯酶/脂肪酶的基因以及編碼Myb家族轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的基因(表5)。其中4個(gè)候選基因既和脅迫有關(guān)又和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān), 它們分別編碼F-box家族蛋白(), GDSL酯酶/脂肪酶()。

表5 篩選獲得候選基因信息

FLL: 旗葉長(zhǎng); FLW: 旗葉寬; FLA: 旗葉面積; NI: 正常灌溉; DS: 干旱脅迫。

FLL: flag leaf length; FLW: flag leaf width; FLA: flag leaf area; NI: normal irrigation; DS: drought stress.

3 討論

3.1 旗葉相關(guān)性狀分析

旗葉是小麥葉片中進(jìn)行光合作用的主要功能葉,與產(chǎn)量關(guān)聯(lián)密切[4-6], 但小麥葉片的生長(zhǎng)發(fā)育易受水分影響, 在水分缺失時(shí)導(dǎo)致葉片長(zhǎng)度、寬度、面積變小并加速衰老[11,24]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)300份品種(系)的旗葉長(zhǎng)度、寬度、面積在所有環(huán)境中均表現(xiàn)為正常灌溉條件下顯著高于干旱脅迫(<0.05), 表明在水分缺失的情況下葉片生長(zhǎng)受阻, 旗葉形態(tài)變小, 此時(shí)有助于減少體內(nèi)水分蒸發(fā)。同時(shí)宋霄君等[25]研究發(fā)現(xiàn)小麥在干旱條件下營(yíng)養(yǎng)器官干物質(zhì)對(duì)籽粒的貢獻(xiàn)率變化趨勢(shì)為: 莖>葉>鞘>穎殼, 說(shuō)明葉片雖然受到干旱的影響但是對(duì)產(chǎn)量的貢獻(xiàn)依然較大。本研究還發(fā)現(xiàn)3個(gè)旗葉形態(tài)性狀的遺傳力較高, 表明這些性狀主要受遺傳因素的影響, 這與Chen等[26]研究結(jié)果一致。其中旗葉寬的遺傳力最高且表型變異較低, 說(shuō)明旗葉寬受環(huán)境、基因型與環(huán)境互作的影響更小, 因此在干旱脅迫下屬于有利性狀[27]。

3.2 小麥旗葉性狀關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析目前被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物復(fù)雜性狀遺傳位點(diǎn)挖掘, 具有省時(shí)、廣度大、精度高等優(yōu)點(diǎn), 可同時(shí)對(duì)多個(gè)復(fù)雜性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[28]。前人研究發(fā)現(xiàn)與小麥旗葉長(zhǎng)、寬、面積相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)主要分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5B、6A、6B、7A、7B和7D染色體上[9,11,29-31], 其中部分染色體與本研究檢測(cè)到的旗葉性狀相關(guān)位點(diǎn)所在染色體相同, 不同的是本研究在1D、3D染色體上也定位到影響旗葉性狀的位點(diǎn)。此外, Liu等[9]和Fan等[11]在4B染色體上定位到穩(wěn)定控制旗葉寬的QTL, Jia等[12]、Wu等[29]在5A染色體上發(fā)現(xiàn)與旗葉寬相關(guān)聯(lián)的主效QTL, 說(shuō)明4B與5A染色體在控制旗葉形態(tài)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。與前人研究不同的是, 本研究未在4B染色體上定位到相關(guān)位點(diǎn),但在7A染色體上定位到6個(gè)與旗葉性狀相關(guān)位點(diǎn), 其中3個(gè)與旗葉長(zhǎng)、面積相關(guān)位點(diǎn)位于538.69～ 567.58 Mb區(qū)段內(nèi), 推斷該區(qū)段可能存在控制旗葉相關(guān)性狀的基因。本研究結(jié)果中部分SNP位點(diǎn)與前人研究檢測(cè)到的位點(diǎn)接近, 如本研究在2B (747.18 Mb)和7B (693.00 Mb)染色體上發(fā)現(xiàn)的與旗葉長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)同F(xiàn)an等[11]在2B (739.40 Mb)染色體及連俊方等[31]在7B (704.26～722.60 Mb)上發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)相距7.78 Mb和11.26 Mb, 可能為同一位點(diǎn)。同時(shí)連俊方等[31]發(fā)現(xiàn)的位于7A (709.90 Mb)染色體上與旗葉面積相關(guān)位點(diǎn)與本研究中定位于721.92 Mb處的與旗葉寬、面積相關(guān)位點(diǎn)相距12.02 Mb, 也可視為同一位點(diǎn)。本研究定位于3A (683.07～686.13 Mb)染色體上與旗葉長(zhǎng)、面積相關(guān)位點(diǎn)與Yan等[32]在684.30 Mb處發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)相近。上述這些位置相同或相近的位點(diǎn)具有一定穩(wěn)定性和可靠性。雖然前人對(duì)小麥旗葉性狀遺傳機(jī)制開展過(guò)多項(xiàng)研究, 但是由于多數(shù)研究的試驗(yàn)群體不同, 采用的標(biāo)記類型和標(biāo)記來(lái)源的差異較大, 無(wú)法進(jìn)行可靠的對(duì)比, 是否與本研究發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)一致暫時(shí)無(wú)法確定。此外, 本研究還發(fā)現(xiàn)一些與籽粒性狀相關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 如在6A (600.45～ 608.12 Mb)染色體上發(fā)現(xiàn)的與旗葉長(zhǎng)、寬顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與嚴(yán)勇亮等[33]在600.01～609.00 Mb處發(fā)現(xiàn)與粒長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)位置相近, 這2個(gè)位點(diǎn)可能為同一位點(diǎn), 同時(shí), 在6B (186.70～188.19 Mb)染色體發(fā)現(xiàn)的與旗葉長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與嚴(yán)勇亮等[33]在192.12 Mb處發(fā)現(xiàn)與千粒重顯著相關(guān)位點(diǎn)相距3.93 Mb。說(shuō)明2個(gè)位點(diǎn)可能屬于穩(wěn)定的一因多效位點(diǎn), 因此猜測(cè)控制旗葉形態(tài)性狀與籽粒性狀的基因可能相同。

本研究定位到的貢獻(xiàn)率較高位點(diǎn)RFL_Con-tig2206_1694, 同時(shí)在多個(gè)環(huán)境及2種水分處理下被檢測(cè)到, 對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行候選基因挖掘, 篩選出基因, 其基因編碼Myb轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白, 該轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)ABA介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)響應(yīng)旱脅迫。因此該位點(diǎn)可能是與小麥抗旱性相關(guān)的重要位點(diǎn)。此外, 檢測(cè)到的位點(diǎn)BS00067530_ 51同樣在多個(gè)環(huán)境及2種水分處理下被檢測(cè)到且貢獻(xiàn)率較高, 通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的候選基因挖掘, 發(fā)現(xiàn)編碼F-box家族蛋白的基因, F-box蛋白基因會(huì)影響細(xì)胞分裂從而影響葉片大小。因此認(rèn)為該位點(diǎn)可能是與小麥旗葉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要位點(diǎn)。這些SNP標(biāo)記位點(diǎn)為進(jìn)一步挖掘旗葉生長(zhǎng)發(fā)育及抗旱性的基因提供了依據(jù), 同時(shí)對(duì)后續(xù)進(jìn)行圖位克隆、功能驗(yàn)證和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

3.3 旗葉形態(tài)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的單倍型分析

單倍型是分子標(biāo)記的一種, 指在單個(gè)染色體上多個(gè)標(biāo)記的組合, 是分子育種應(yīng)用的重要手段, 目前在水稻、小麥、玉米等作物中廣泛應(yīng)用[34]。前人認(rèn)為小麥旗葉長(zhǎng)度較短, 寬度較寬為優(yōu)異形態(tài), 在此基礎(chǔ)上能增加面積則更優(yōu)[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)了對(duì)旗葉長(zhǎng), 面積改良有益的單倍型FLL-Hap3和FLA- Hap1。其中單倍型FLL-Hap3在300份品種(系)中出現(xiàn)頻率僅為3.33%, 原因可能是旗葉長(zhǎng)不僅僅只受一個(gè)等位基因影響, 還存在其他等位基因共同作用, 因此, 單倍型FLL-Hap3可能在不同遺傳背景下被其它等位基因所掩蓋。單倍型FLA-Hap1出現(xiàn)的頻率為48.19%, 說(shuō)明在本研究供試材料中獲得了正向的選擇。因此, 對(duì)旗葉形態(tài)有利的單倍型將對(duì)小麥旗葉形態(tài)性狀遺傳改良具有較大的促進(jìn)作用, 同時(shí)可作為小麥旗葉形態(tài)性狀的輔助選擇的實(shí)用性標(biāo)記。

不同來(lái)源小麥品種(系)中, 具有單倍型FLL- Hap3或FLA-Hap1的品種(系)在西南冬麥區(qū)出現(xiàn)的頻率較高, 這可能是由于西南冬麥區(qū)屬于寡日照農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)[35], 小麥生育期日照時(shí)長(zhǎng)短, 導(dǎo)致小麥減產(chǎn), 而小麥產(chǎn)量與旗葉形態(tài)大小呈極顯著正相關(guān)[5], 因此增加旗葉形態(tài)大小有利于該地區(qū)產(chǎn)量的增加, 所以較大旗葉形態(tài)可能是該區(qū)選育高產(chǎn)品種的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。各麥區(qū)氣候類型不同其選育方式也各不相同, 例如黃淮冬麥區(qū)氣候相對(duì)溫和, 因此有意向大穗、多穗方向選育品種[36], 而北部冬麥區(qū)冬季嚴(yán)寒, 降水稀少, 則側(cè)重選擇抗寒性能好, 分蘗能力強(qiáng)的品種[35],因此不同地域品種在遺傳組成上也存在差異。

3.4 候選基因的功能分析

本研究利用中國(guó)春基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了與旗葉形態(tài)性狀相關(guān)的穩(wěn)定遺傳SNP標(biāo)記序列, 根據(jù)基因功能注釋信息推測(cè)出5個(gè)最有可能與旗葉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的候選基因及5個(gè)最有可能和抗旱性相關(guān)的候選基因。基因均編碼F-box家族蛋白, F-box基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中起到重要的作用, 小麥F-box家族的基因能響應(yīng)多種非生物脅迫[37], 在干旱脅迫條件下, 超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)芽率、根長(zhǎng)、葉綠素含量、凈光合速率和體內(nèi)抗氧化酶活性等指標(biāo)都高于野生型。同時(shí)Baute等[38]研究發(fā)現(xiàn)F-box基因家族中在擬南芥中異位表達(dá)能導(dǎo)致擬南芥的葉片增大, 原因是F-box蛋白會(huì)影響細(xì)胞分裂從而影響葉片大小?；蚓幋a2-酮戊二酸(2OG)和Fe(II)依賴性加氧酶超家族蛋白, 可參與褪黑素的降解[39]和赤霉素的合成[40], Arnao等[41]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素的吸收可以增加葉片的面積, MacMillan等[42]研究發(fā)現(xiàn)赤霉素在很多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用, 包括葉片生長(zhǎng)。基因編碼GDSL脂肪酶, GDSL脂肪酶家族中的基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白, 在表皮蠟質(zhì)生物合成中發(fā)揮作用[43], 而干旱脅迫下植物表皮蠟質(zhì)增多可使葉片水勢(shì)下降變慢、氣孔開度減小、光合速率、蒸騰速率下降趨勢(shì)減慢, 增強(qiáng)植物的抗旱性[44], GDSL脂肪酶基因在成熟植株的葉片中有明顯的表達(dá),并呈現(xiàn)出顯著的差異, 可能與葉片發(fā)育生理過(guò)程有關(guān)[45]?；蚓幋aMyb轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白, 該轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)內(nèi)源ABA水平的增加調(diào)控氣孔閉合響應(yīng)干旱脅迫, 其中基因過(guò)表達(dá)時(shí), 增加了與ABA生物合成有關(guān)的基因的表達(dá), 提高了抗旱性[46]。這些候選基因中編碼F-box家族蛋白和GDSL脂肪酶的基因參與旗葉生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)還與干旱脅迫有關(guān), 可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。

4 結(jié)論

本研究對(duì)300份品種(系)的旗葉長(zhǎng)、寬、面積進(jìn)行混合線性模型MLM (Q+K)的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 在2個(gè)以上環(huán)境中檢測(cè)到37個(gè)穩(wěn)定遺傳位點(diǎn), 檢測(cè)到5個(gè)同時(shí)關(guān)聯(lián)多個(gè)性狀的位點(diǎn), 在正常灌溉和干旱脅迫下共同檢測(cè)到的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)有8個(gè)。在定位到的位點(diǎn)中與旗葉長(zhǎng)、寬相關(guān)位點(diǎn)RFL_Contig2206_ 1694, 可能是與小麥抗旱性相關(guān)的重要位點(diǎn), 與旗葉長(zhǎng)相關(guān)位點(diǎn)BS00067530_51, 可能是與小麥旗葉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要位點(diǎn)。單倍型分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)對(duì)旗葉形態(tài)改良有益的單倍型, 分別是Kukri_c1406_ 275位點(diǎn)上與旗葉長(zhǎng)度相關(guān)的FLL-Hap3和wsnp_ bq170165A_Ta_1_1位點(diǎn)上與旗葉面積相關(guān)的FLA-Hap1, 二者主要來(lái)自西南冬麥區(qū)。將篩選出的SNP標(biāo)記在普通小麥中國(guó)春基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索, 共得到5個(gè)與旗葉形態(tài)性狀相關(guān)的候選基因。

[1] Ray D K, Mueller N D, West P C, Foley J A, Hart J P. Yield trends are insufficient to double global crop production by 2050.2013, 8: e66428.

[2] 趙廣才, 常旭虹, 王德梅, 楊玉雙, 馮金鳳. 中國(guó)小麥生產(chǎn)發(fā)展?jié)摿ρ芯繄?bào)告. 作物雜志, 2012, (3): 1–5. Zhao G C, Chang X H, Wang D M, Yang Y S, Feng J F. Research report on development of China’s wheat production potential., 2012, (3): 1–5 (in Chinese with English abstract).

[3] Liu Y X, Tao Y, Wang Z Q, Guo Q L, Wu F K, Yang X L, Deng M, Ma J, Chen G D, Wei Y M, Zheng Y L. Identification of QTL for flag leaf length in common wheat and their pleiotropic effects., 2018, 38: 11.

[4] Sharma S N, Sain R S, Sharma R K. The genetic control of flag leaf length in normal and late sown durum wheat., 2003, 141: 323–331.

[5] 王義芹, 楊興洪, 李濱, 童依平, 李振聲. 小麥葉面積及光合速率與產(chǎn)量關(guān)系的研究. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2008, 23(增刊2): 10–15. Wang Y Q, Yang X H, Li B, Tong Y P, Li Z S. Study on the relationship between leaf area, photosynthetic rate and yield of wheat., 2008, 23(S2): 10–15 (in Chinese with English abstract).

[6] 王敏, 張從宇. 小麥旗葉性狀與產(chǎn)量因素的相關(guān)與回歸分析. 種子, 2004, (3): 17–18. Wang M, Zhang C Y. Correlation and regression analysis of flag leaf traits and yield components in wheat., 2004, (3): 17–18 (in Chinese with English abstract).

[7] 景蕊蓮. 作物抗旱節(jié)水研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2007, (1): 1–5. Jing R L. Advances of research on drought resistance and water use efficiency in crop plants., 2007, (1): 1–5 (in Chinese with English abstract).

[8] Biswal A K, Kohli A. Cereal flag leaf adaptations for grain yield under drought: knowledge status and gaps., 2013, 31: 749–766.

[9] Liu K Y, Xu H, Liu G, Guan P F, Zhou X Y, Peng H R, Yao Y Y, Ni Z F, Sun Q X, Du J K. QTL mapping of flag leaf-related traits in wheat (L.)., 2018, 131: 839–849.

[10] 呂學(xué)蓮, 白海波, 董建力, 惠建, 孫亞寧, 蔡正云, 李樹華. 春小麥旗葉大小相關(guān)性狀的QTL定位分析. 麥類作物學(xué)報(bào), 2016, 36: 1587–1593. Lyu X L, Bai H B, Dong J L, Hui J, Sun Y N, Cai Z Y, Li S H. QTL mapping for size traits of flag leaf in spring wheat., 2016, 36: 1587–1593 (in Chinese with English abstract).

[11] Fan X L, Cui F, Zhao C H, Zhang W, Yang L J, Zhao X Q, Han J, Su Q N, Ji J, Zhao Z W, Tong Y P, Li J M. QTLs for flag leaf size and their influence on yield-related traits in wheat (L.)., 2015, 35: 1–16.

[12] Jia H, Wan H, Yang S, Zhang Z Z, Kong Z X, Xue S L, Zhang L X, Ma Z Q. Genetic dissection of yield-related traits in a recombinant inbred line population created using a key breeding parent in China’s wheat breeding., 2013, 126: 2123–2139.

[13] Xue S L, Xu F, Li G Q, Zhou Y, Lin M S, Gao Z X, Su X H, Xu X W, Jiang G, Zhang S, Jia H Y, Kong Z X, Zhang L X, Ma Z Q. Fine mapping, a major QTL controlling flag leaf width in bread wheat (L.)., 2013, 126: 1941–1949.

[14] 朱治, 李龍, 李超男, 毛新國(guó), 郝晨陽(yáng), 朱婷, 王景一, 常建忠, 景蕊蓮. 小麥轉(zhuǎn)錄因子與株高和千粒重相關(guān). 作物學(xué)報(bào), 2023, 49: 906–916. Zhu Z, Li L, Li C N, Mao X G, Hao C Y, Zhu T, Wang J Y, Chang J Z, Jing R L. Transcription factoris associated with plant height and 1000-grain weight in wheat., 2023, 49: 906–916.

[15] 劉朦朦, 張萌娜, 張倩倩, 劉錫建, 郭宇航. 小麥旗葉寬主效QTL遺傳效應(yīng)解析. 麥類作物學(xué)報(bào), 2019, 39: 1399–1405. Liu M M, Zhang M N, Zhang Q Q, Liu X J, Guo Y H. Genetic analysis of a major stable QTLfor wheat flag leaf width., 2019, 39: 1399–1405 (in Chinese with English abstract).

[16] 李浩然, 李慧玲, 王紅光, 李東曉, 李瑞奇, 李雁鳴. 冬小麥葉面積測(cè)算方法的再探討. 麥類作物學(xué)報(bào), 2018, 38: 455–459. Li H R, Li H L, Wang H G, Li D X, Li R Q, Li Y M. Further study on the method of leaf area calculation in winter wheat., 2018, 38: 455–459 (in Chinese with English abstract).

[17] Cheng Y K, Li J, Yao F J, Long L, Wang Y Q, Wu Y, Li J, Ye X L, Wang J R, Jiang Q T, Kang H Y, Li W, Qi P F, Liu Y X, Deng M, Ma J, Jiang Y F, Chen X M, Zheng Y L, Wei Y M, Chen G Y. Dissection of loci conferring resistance to stripe rust in Chinese wheat landraces from the middle and lower reaches of the Yangtze Rivergenome-wide association study., 2019, 287: 110204.

[18] Li D D, Xu Z X, Gu R L, Wang P X, Lyle D, Xu J L, Zhang H W, Wang G Y. Enhancing genomic selection by fitting large-effect SNPs as fixed effects and a genotype-by-environment effect using a maize BC1F3:4population., 2019, 14: e0223898.

[19] Wang S X, Zhu Y L, Zhang D X, Shao H, Liu P, Hu J B, Zhang H, Zhang H P, Chang C, Lu J, Xia X C, Sun G L, Ma C X. Genome- wide association study for grain yield and related traits in elite wheat varieties and advanced lines using SNP markers., 2017, 12: e0188662.

[20] Zhu C S, Gore M, Buckler E S, Yu J M. Status and prospects of association mapping in plants., 2008, 1: 5–20.

[21] Yu J M, Pressoir G, Briggs W H, Bi L V, Yamasaki M, Doebley J F, Mcmullen M D, Gaut B S, Nielsen D M, Holland J B, Kresovich S, Buckler E. A unified mixed-model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness., 2006, 38: 203–208.

[22] 李天清, 王金堂, 馬真勝, 雷偉, 王林, 李萌. 骨質(zhì)疏松性骨折與OPG-RANK-RANKL系統(tǒng)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2014, 20: 247–255. Li T Q, Wang J T, Ma Z S, Lei W, Wang L, Li M. Correlation analysis of the relationship between the osteoporotic fracture and OPG-RANK-RANKL gene polymorphisms., 2014, 20: 247–255 (in Chinese with English abstract).

[23] Gabriel S B, Schaffner S F, Liu-cordero S N, Rotimi C, Adeyemo A, Cooper R, Ward R, Lander E S, Daly M J, Altshuter D, Nguyen H, Moor J M, Roy J, Blumenstiel B, Higgins J, Defelice M, Lochner A, Faggart M. The structure of haplotype blocks in the human genome., 2002, 296: 2225–2229.

[24] 閆雪, 史雨剛, 梁增浩, 楊斌, 李曉宇, 王曙光, 孫黛珍. 小麥旗葉形態(tài)相關(guān)性狀的QTL定位. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 29: 1253–1259. Yan X, Shi Y G, Liang Z H, Yang B, Li X Y, Wang S G, Sun D Z. QTL mapping for morphological traits of flag leaf in wheat., 2015, 29: 1253–1259 (in Chinese with English abstract).

[25] 宋霄君, 張敏, 李秉昌, 趙城, 劉希偉, 賈曉沛, 王琨, 蔡瑞國(guó).干旱脅迫對(duì)小麥營(yíng)養(yǎng)器官物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和籽粒灌漿特性的影響. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(15): 25–31. Song X J, Zhang M, Li B C, Zhao C, Liu X W, Jia X P, Wang K, Cai R G. Effects of drought stress on material transport and grain-filling characteristics of wheat vegetative organs., 2016, 32(15): 25–31 (in Chinese with English abstract).

[26] Chen S, Liu F, Wu W X, Jiang Y, Zhan K H. A SNP-based GWAS and functional haplotype-based GWAS of flag leaf-related traits and their influence on the yield of bread wheat (L.)., 2021, 134: 3895–3909.

[27] Khanna C R, Singh K, Shukla S, Kadam S, Singh N K. QTLs for cell membrane stability and flag leaf area under drought stress in a wheat RIL population., 2020, 29: 276–286.

[28] 曹英杰, 楊劍飛, 王宇. 全基因組關(guān)聯(lián)分析在作物育種研究中的應(yīng)用. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2019, 33: 1508–1518. Cao Y J, Yang J F, Wang Y. The application of GWAS in crop breeding., 2019, 33: 1508–1518 (in Chinese with English abstract).

[29] Wu Q H, Chen Y X, Fu L, Zhou S H, Chen J J, Zhao X J, Zhao D, Ou-Yang S H, Wang Z Z, Li D, Wang G X, Zhang D Y, Yuan C G, Wang L X, You M S, Han J, Liu Z Y. QTL mapping of flag leaf traits in common wheat using an integrated high-density SSR and SNP genetic linkage map., 2016, 208: 337–351.

[30] Yang D L, Liu Y, Cheng H B, Chang L, Chen J J, Chai S X, Li M F. Genetic dissection of flag leaf morphology in wheat (L.) under diverse water regimes., 2016, 17: 1–15.

[31] 連俊方, 張德強(qiáng), 武炳瑾, 宋曉朋, 馬文潔, 周麗敏, 馮毅, 孫道杰. 利用90K基因芯片進(jìn)行小麥旗葉相關(guān)性狀的QTL定位. 麥類作物學(xué)報(bào), 2016, 36: 689–698. Lian J F, Zhang D Q, Wu B J, Song X P, Ma W J, Zhou L M, Feng Y, Sun D J. QTL mapping of flag leaf traits using an integrated high-density 90K genotyping chip., 2016, 36: 689–698 (in Chinese with English abstract).

[32] Yan X F, Zhao L, Ren Y, Zhang N, Dong Z D, Chen F. Identification of genetic loci and a candidate gene related to flag leaf traits in common wheat by genome-wide association study and linkage mapping., 2020, 6: 40–58.

[33] 嚴(yán)勇亮, 張恒, 張金波, 時(shí)曉磊, 耿洪偉, 肖菁, 路子峰, 倪中福, 叢花. 春小麥主要籽粒性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析. 麥類作物學(xué)報(bào), 2022, 42: 1182–1191. Yan Y L, Zhang H, Zhang J B, Shi X L, Geng H W, Xiao J, Lu Z F, Ni Z F, Cong H. Genome-wide association study of grain traits in spring wheat., 2022, 42: 1182–1191 (in Chinese with English abstract).

[34] 陳玲玲, 劉亭萱, 谷勇哲, 宋健, 王俊, 邱麗娟. 大豆葉柄夾角相關(guān)基因單倍型分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2021, 22: 1698–1707. Chen L L, Liu T X, Gu Y Z, Song J, Wang J, Qiu L J. Haplotype analysis of petiole angle related genein soybean., 2021, 22: 1698–1707 (in Chinese with English abstract).

[35] 趙廣才. 中國(guó)小麥種植區(qū)劃研究(一). 麥類作物學(xué)報(bào), 2010, 30: 886–895. Zhao G C. Study on Chinese wheat planting regionalization (I)., 2010, 30: 886–895 (in Chinese with English abstract).

[36] 茹振鋼, 馮素偉, 李淦. 黃淮麥區(qū)小麥品種的高產(chǎn)潛力與實(shí)現(xiàn)途徑. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48: 3388–3393. Ru Z G, Feng S W, Li G. High-yield potential and effective ways of wheat in Yellow & Huai Rivers valley facultative winter wheat region., 2015, 48: 3388–3393 (in Chinese with English abstract).

[37] Zhao Z X, Zhang G Q, Zhou S M, Ren Y Q, Wang W. The improvement of salt tolerance in transgenic tobacco by overexpression of wheat F-box gene, 2017, 259: 71–85.

[38] Baute J, Polyn S, Block J D, Blomme J, Lijsebettens M V, Baute J. F-box proteinaffects leaf size in., 2017, 58: 962–975.

[39] Byeon Y, Back K. Molecular cloning of melatonin 2-hydroxylase responsible for 2-hydroxymelatonin production in rice ()., 2015, 58: 343–351.

[40] Farrow S C, Facchini P J. Functional diversity of 2-oxoglutarate/ Fe(II)-dependent dioxygenases in plant metabolism., 2014, 5: 524–539.

[41] Arnao M B, Hernández-Ruiz J. Functions of melatonin in plants: a review., 2015, 59: 133–150.

[42] MacMillan J. Occurrence of gibberellins in vascular plants, fungi, and bacteria., 2001, 20: 387–442.

[43] Park J J, Jin P, Yoon J, Yang J, Jeong H J, Ranathunge K, Schreiber L, Franke R, Lee I J, An G. Mutation in wilted dwarf and lethal 1 () causes abnormal cuticle formation and rapid water loss in rice., 2010, 74: 91–103.

[44] 徐文, 申浩, 郭軍, 余曉叢, 李祥, 楊彥會(huì), 馬曉, 趙世杰, 宋健民. 旗葉蠟質(zhì)含量不同小麥近等基因系的抗旱性. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42: 1700–1707. Xu W, Shen H, Guo J, Yu X C, Li X, Yang Y H, Ma X, Zhao S J, Song J M. Drought resistance of wheat NILs with different cuticular wax contents in flag leaf., 2016, 42: 1700–1707 (in Chinese with English abstract).

[45] 凌華. 油菜GDSL脂肪酶基因的克隆及其原核表達(dá). 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, (12): 102–106. Ling H. Cloning of a GDSL lipase gene fromand preliminary study of its recombinant expression in., 2007, (12): 102–106 (in Chinese with English abstract).

[46] Zhao Y, Tian X J, Wang F, Zhang L Y, Xin M M, Hu Z R, Yao Y Y, Ni Z F, Sun Q X, Peng H R. Characterization of wheatgenes responsive to high temperatures., 2017, 17: 208–221.

Genome-wide association analysis of morphological traits of flag leaf in wheat

WANG Rui1,2, REN Yi1,2, CHENG Yu-Kun1,2, WANG Wei1,2,3, ZHANG Zhi-Hui1,2, and GENG Hong-Wei1,2,*

1College of Agronomy / Special High Quality Triticeae Crops Engineering and Technology Research Center, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2Xinjiang Wheat Industry System Innovation Team, Urumqi 830052, Xinjiang, China;3Department of Computer Science and Information Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang 455000, Henan, China

The flag leaf of wheat is the primary functional leaf for photosynthesis and contributes significantly to yield. Therefore, it is essential to investigate the genetic process of flag leaf morphology and identify the candidate genes for flag leaf morpho-logy-related features. We combined 90K SNP gene chips and 300 wheat varieties (lines) for genome-wide association analysis of flag leaf length, width, and area under normal irrigation (NI), and drought stress (DS) conditions in five environments. The results showed that flag leaf length, width, and area exhibited significant differences between the two moisture treatments and displayed rich phenotypic variation with the coefficients of variation ranging from 0.07–0.23 in different environments (<0.05). Moreover, genome-wide association study (GWAS) revealed that a total of 37 stable genetic loci were significantly associated with flag leaf length, width, and area. These loci were distributed on chromosomes 1D, 2A, 2B, 3A, 3D, 4A, 5A, 5B, 6A, 6B, 7A, and 7B, with individual SNP loci explaining 3.70%–9.05% of the genetic variation, including 22 stable genetic loci detected under normal irrigation and 15 stable genetic loci detected under drought stress. Eight stable genetic loci at the same time detected under both water treatments were discovered on chromosomes 2B, 3A, 5A, 6A, 7A, and 7B, while the five stable genetic loci related by several traits were simultaneously detected on chromosomes 2B, 3A, 6A, and 7A. By analyzing haplotypes at markers with stable inheritance and high contribution, it was found that the Kukri_c1406_275 (2=9.05%) marker was significantly associated with flag leaf length, with three haplotypes of FLL-Hap1, FLL-Hap2, and FLL-Hap3, and the wsnp_bq170165A_Ta_1_1 (2=7.88%) marker was also detected in three haplotypes, FLA-Hap1, FLA-Hap2, and FLA-Hap3. In combination with phenotypic analysis, the flag leaf length of 300 winter wheat varieties (lines) containing FLL-Hap1 (77.78% frequency of occurrence) or FLL-Hap2 (18.89%) haplotypes was significantly higher than that of FLL-Hap3 (3.33%) haplotypes. The flag leaf area was significantly higher in haplotypes containing FLA-Hap1 (48.19%) than in haplotypes containing FLA-Hap2 (30.80%) or FLA-Hap3 (21.01%) (<0.05). Different haplotypes were distributed differently in different winter wheat varieties (lines). Haplotype FLL-Hap1 was more frequently distributed in foreign varieties (lines), while haplotypes FLL-Hap2 and FLL-Hap3 were more frequently distributed in the northern winter wheat region and the southwestern winter wheat region, respectively. Haplotypes FLA-Hap1 and FLA-Hap2 were more frequently distributed in the southwestern winter wheat region and the northern winter wheat region, respectively, while haplotypes FLA-Hap3 were no more frequently distributed in all winter wheat regions. Searching for stable genetic loci under both water treatments yielded and screening of five candidate genes associated with flag leaf morphology, which could be used as the important genes for flag leaf-related traits.

wheat; morphological characters of flag leaf; genome-wide association analysis; haplotype; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2023.21085

本研究由新疆自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)任務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目(2022B02001-3)資助。

This study was supported by the Special Project of Key Research and Development Task of Xinjiang Autonomous Region (2022B02001-3).

耿洪偉, E-mail: hw-geng@163.com

E-mail: 506829570@qq.com

2022-12-26;

2023-04-17;

2023-05-05.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230505.0853.002.html

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