陸 珠，紀(jì)淑娟，任梓銘，王 月，謝孟樂，楊 陽**，于延申**，張 桐

（1.吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，吉林 長春 130033；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101；3.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；4.吉林省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，吉林 長春 130033)

猴頭菇（Hericium erinaceus Bull. Pers.） 因子實(shí)體外形與猴的頭部極其相似而得名[1]。在古代時(shí)，就有“山珍猴頭，海味燕窩”的說法[2]。猴頭菇不僅在我國歷史傳統(tǒng)文化中占據(jù)一席之地，其營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值也得到了大眾認(rèn)可[3]。猴頭菇是藥食兼用菌，清除自由基能力比較好[4]，可以提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力，延緩體力疲勞，治療胃炎[5]、胃潰瘍[6]。除此之外，猴頭菇還具有降低膽固醇、降血糖、抗抑郁、增強(qiáng)免疫力[7-8]、抗腫瘤[9]、抗感染、抗病毒、抗菌、抗炎和抗凝血[10]等多種活性。

野生猴頭菇廣泛分布于西歐、北美、日本、俄羅斯等地區(qū)。在中國，野生猴頭菇分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、河北、浙江、福建等20 多個(gè)省份、自治區(qū)[11]。我國是世界上最早進(jìn)行野生猴頭菇人工馴化栽培的國家，距今已有150 余年歷史[12]。栽培規(guī)模較大的地區(qū)有吉林、黑龍江、福建、山東、浙江、江蘇、山西等[13]。最有名的猴頭菇產(chǎn)地是黑龍江省海林市，因此該地也被譽(yù)為中國的猴頭菇之鄉(xiāng)[14]。但隨著猴頭菇栽培的不斷推廣，新的猴頭菇種質(zhì)資源需求愈加迫切。目前，杜忠偉等[15]對(duì)一株野生猴頭菇生物學(xué)特性及農(nóng)藝形狀進(jìn)行了研究，篩選出一株適合人工栽培的猴頭菇菌株。然而，其他涉及野生馴化栽培和栽培模式的研究仍較少。

通過對(duì)采集到的2 株野生猴頭菇進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，明確其分類學(xué)地位。分析其生物學(xué)特性，篩選各菌株的菌絲最適生長條件并進(jìn)行馴化栽培。研究目的旨在為不同來源的猴頭菇野生菌株的馴化栽培提供參考，建立新的猴頭菇種質(zhì)資源信息。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)使用的3 個(gè)猴頭菇菌株詳細(xì)信息見表1，2個(gè)野生菌株子實(shí)體形態(tài)特征見圖1。

表1 供試猴頭菇菌株信息Tab.1 Information of test Hericium erinaceus strains

如表1 和圖1 所示，以采自龍泉市和海林市的2 個(gè)野生猴頭菇菌株（菌株A、菌株B） 為試驗(yàn)材料。以引自福建省的1 個(gè)栽培猴頭菇菌株（菌株C）為對(duì)照，菌株C 栽培種的特點(diǎn)是菌絲濃白、粗壯，抗雜菌能力強(qiáng)，菌球大、白色，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，約50 d出菇。所有菌株保存在吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院食用菌研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生菌株的鑒定

使用基因組DNA 提取試劑盒分別提取3 個(gè)猴頭菇菌株的DNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度與純度。以猴頭菇DNA為模板，對(duì)其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔ITS 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，選取通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)體系為25 μL：10× PCR Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，10 mmol·L-1dNTP Mixture 0.6 μL，基因組DNA 0.5 μL，20 μmol·L-1的上游引物0.3 μL，20 μmol·L-1的下游引物0.3 μL，5 U·L-1Taq 酶0.3 μL，ddH2O 18.0 μL。

ITS 的PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計(jì)34 個(gè)循環(huán)。

PCR 產(chǎn)物由吉林省庫美生物科技有限公司測(cè)序。在NCBI 中進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)。

1.2.2 野生菌株生物學(xué)特性試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，配方包含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 自然。

分別對(duì)碳源、氮源、溫度和補(bǔ)充元素4 個(gè)因素進(jìn)行研究。1） 碳源篩選試驗(yàn)：分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉為碳源替代PDA 培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量均為20 g，pH 自然。2） 氮源篩選試驗(yàn)：分別以酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、麥麩汁為氮源，添加量均為0.2%，以葡萄糖為固定碳源，pH 自然。3） 溫度篩選試驗(yàn)：使用PDA 培養(yǎng)基，pH 自然，接種后分別于15、20、25、30、35 ℃培養(yǎng)。4） 補(bǔ)充元素篩選試驗(yàn)：在PDA 培養(yǎng)基中添加不同的元素進(jìn)行配制，分別以KH2PO40.15%（補(bǔ)充K 元素）、MgSO40.1% （補(bǔ)充Mg 元素）、KH2PO40.15%+MgSO40.1% （補(bǔ)充K 和Mg 元素）、CaCO30.1%（補(bǔ)充Ca 元素）、維生素B10.05%為供試條件。

在培養(yǎng)基中間位置接入直徑為6 mm 的菌塊，于23 ℃（除溫度篩選試驗(yàn)外） 恒溫培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。每24 h 觀察1 次，并用平板劃線法測(cè)量、標(biāo)記菌絲生長，連續(xù)測(cè)量直至某一平板長滿菌絲，同時(shí)觀察并記錄菌絲長勢(shì)。

1.2.3 馴化栽培試驗(yàn)

將猴頭菇菌株在PDA 培養(yǎng)基上活化，23 ℃恒溫暗培養(yǎng)10 d，接種至麥粒培養(yǎng)料（小麥粒78%、木屑10%、麥麩8%、石膏2%、葡萄糖1%、過磷酸鈣1%，含水量60%）。待菌絲爬滿麥粒，再轉(zhuǎn)接到木屑培養(yǎng)料（木屑78%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣1%，含水量62%）。將菌袋置于20～24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲的濃密程度、滿袋時(shí)間。菌絲滿袋后，將溫度降至18 ℃，后熟7 d。用滅菌后的刀具在菌袋中部劃“一”字口，長度為3 cm，并轉(zhuǎn)入濕度約60%的出菇室中進(jìn)行恢復(fù)生長。待開口處長出潔白、粗壯的菌絲后，調(diào)節(jié)溫度為16～22 ℃，濕度逐漸升到85%～90%，每天上午和下午各通風(fēng)1 h。統(tǒng)計(jì)原基形成時(shí)間。

以栽培菌株C 為對(duì)照，在相同條件下進(jìn)行出菇試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)和分析主要農(nóng)藝性狀，包括生育期（d）、出菇產(chǎn)量（g）、生物學(xué)效率、子實(shí)體形態(tài)等。

1.2.4 栽培模式比較試驗(yàn)

采用3 種栽培模式進(jìn)行對(duì)比，分別為棚內(nèi)立體床架擺放式栽培、棚內(nèi)立體旋轉(zhuǎn)架栽培和猴頭菇-草莓立體栽培。每種栽培模式放置100 袋，均在菌袋中部劃“一”字口，長度為3 cm。3 種栽培模式的出菇管理相同，培養(yǎng)溫度為16～25 ℃，濕度為85%～90%，每日通風(fēng)。記錄出菇的農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株鑒定結(jié)果

通過基因組提取、ITS1/ITS4（650 bp） PCR 擴(kuò)增和基因組測(cè)序，獲得2 個(gè)野生猴頭菇菌株（菌株A、菌株B） 的ITS 序列，序列號(hào)為OP648265 和OP648266。在NCBI 進(jìn)行序列比對(duì)，2 個(gè)菌株的ITS序列與已公布的猴頭菇ITS 序列的相似性均達(dá)99%。因此，鑒定2 個(gè)野生菌株均為猴頭菇。

2.2 野生猴頭菇菌株的生物學(xué)特性

2.2.1 菌絲生長最適碳源

篩選2 個(gè)野生猴頭菇菌株菌絲生長的最適碳源，數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，結(jié)果詳見圖2。

圖2 不同碳源對(duì)猴頭菇菌株菌絲生長的影響Fig. 2 The effects of different carbon sources on mycelial growth of Hericium erinaceus

如圖2 所示，2 個(gè)野生猴頭菇菌株在5 種供試碳源培養(yǎng)基上均可生長，但生長速度與長勢(shì)存在差異。菌株A 在蔗糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上生長速度最快，且兩者間無顯著差異，但在可溶性淀粉培養(yǎng)基上長勢(shì)不如蔗糖，因此其最適碳源為蔗糖。菌株B 在麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上長速最快，菌絲濃密，且無顯著性差異，麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉為最適碳源。比較發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)菌株的最適碳源存在一定差異，但蔗糖是通用的最適碳源。

2.2.2 菌絲生長最適氮源

篩選2 個(gè)野生猴頭菇菌株菌絲生長的最適氮源，數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，結(jié)果詳見圖3。

圖3 不同氮源對(duì)猴頭菇菌株菌絲生長的影響Fig. 3 The effects of different nitrogen sources on mycelial growth of Hericium erinaceus

如圖3 所示，2 株野生猴頭菇在尿素為氮源的培養(yǎng)基上不能生長。菌株A 在供試氮源為酵母粉和蛋白胨時(shí)，菌絲生長速度最快且兩者間無顯著差異，長勢(shì)均為最好，因此其最適氮源為酵母粉和蛋白胨。菌株B 在供試氮源為酵母粉、蛋白胨、硫酸銨和麥麩汁時(shí)，菌絲生長速度最快且無顯著差異，但在酵母粉和麥麩汁為氮源的培養(yǎng)基上菌絲長勢(shì)均為最好，所以最適氮源為酵母粉和麥麩汁?？梢?，2 個(gè)菌株的生長最適氮源也存在差異，但酵母粉為通用的最適氮源。

2.2.3 菌絲生長最適溫度

篩選2 個(gè)野生猴頭菇菌株菌絲生長的最適溫度，數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，結(jié)果詳見圖4。

圖4 不同溫度對(duì)猴頭菇菌株菌絲生長的影響Fig.4 The effects at different temperatures on mycelial growth of Hericium erinaceus

如圖4 所示，隨著溫度的升高，2 株野生猴頭菇的菌絲生長速度均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，在25 ℃時(shí)生長速度達(dá)到最高。結(jié)合菌絲長勢(shì)發(fā)現(xiàn)，在20 ℃和25 ℃下，2 個(gè)菌株的菌絲生長情況無顯著差異。因此，2 株野生猴頭菇的最適生長溫度均為20～25 ℃。

2.2.4 菌絲生長最適元素

篩選2 個(gè)野生猴頭菇菌株菌絲生長的最適元素，數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，結(jié)果詳見圖5。

圖5 不同元素對(duì)猴頭菇菌株菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different microelement on the mycelial growth of Hericium erinaceus

如圖5 所示，2 株野生猴頭菇菌絲在5 種供試元素的培養(yǎng)基上均能生長。菌株A 在同時(shí)補(bǔ)充了K和Mg 元素的KH2PO40.15%+MgSO40.1%培養(yǎng)基上生長速度最快且長勢(shì)最好，且與添加了其他元素的培養(yǎng)基相比存在顯著差異，因此可將其作為菌株A 菌絲生長的最適元素。菌株B 在僅補(bǔ)充了Mg 元素的MgSO40.1%培養(yǎng)基和同時(shí)補(bǔ)充K 和Mg 元素的KH2PO40.15%+MgSO40.1%培養(yǎng)基上生長速度最快且長勢(shì)最好，兩者間無顯著性差異?？梢?，MgSO4和KH2PO4更有利于2 株猴頭菇的菌絲生長。

2.3 馴化栽培結(jié)果

對(duì)2 株野生猴頭菇（菌株A、菌株B） 進(jìn)行馴化栽培，以國內(nèi)栽培猴頭菇菌株（菌株C） 為對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

表2 猴頭菇馴化栽培試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of domestication cultivation experiment of Hericium erinacers

如表2 所示，2 株野生猴頭菇在以木屑為主料的栽培基質(zhì)中均可正常生長、馴化出菇，生育期分別為45 d（菌株A）、56 d（菌株B）。菌株A 的抗雜菌能力強(qiáng)，子實(shí)體縱長為6～12 cm，子實(shí)體橫長為8～13 cm，單菇平均鮮質(zhì)量為255 g，平均生物學(xué)效率為110.87%。菌株B 抗雜菌能力較強(qiáng)，子實(shí)體縱長為5～11 cm，子實(shí)體橫長為7～11 cm，單菇平均鮮質(zhì)量為235 g，平均生物學(xué)效率為102.17%。與對(duì)照栽培猴頭菇菌株（菌株C） 相比，各菌株發(fā)育成熟的子實(shí)體形態(tài)和顏色差異不大，但野生菌株A 比栽培菌株C 的抗雜菌能力強(qiáng)，平均鮮質(zhì)量更高，平均生物學(xué)效率也更高。

2.4 栽培模式試驗(yàn)結(jié)果

采用3 種不同的栽培模式栽培3 個(gè)猴頭菇菌株，結(jié)果詳見表3。

表3 猴頭菇栽培模式試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Cultivation patterns experiment of Hericium erinaceus

如表3 所示，3 株猴頭菇菌株在3 種栽培模式下均能出菇，原基形成時(shí)間無差異，但子實(shí)體形狀、顏色、菌刺長度、緊實(shí)度以及抗雜菌能力和產(chǎn)量均有較大變化。在棚內(nèi)立體床架擺放式栽培和棚內(nèi)立體旋轉(zhuǎn)架栽培模式下，菇體形狀、顏色、菌刺長度、菇體緊實(shí)度以及抗雜菌能力無變化。在猴頭菇-草莓立體栽培模式下，3 株猴頭菇菌株均出現(xiàn)了不同程度的畸形菇，菌株B 和對(duì)照菌株C 的菇體顏色也由白色變?yōu)槠榘咨?，此栽培模式? 株猴頭菇子實(shí)體均相對(duì)松散，抗雜菌能力下降。比較發(fā)現(xiàn)，3 株菌株在棚內(nèi)立體床架擺放式栽培模式下，平均鮮質(zhì)量最高，平均生物學(xué)效率最高，其次是棚內(nèi)立體旋轉(zhuǎn)架栽培，最后是猴頭菇-草莓立體栽培。因此，最優(yōu)栽培模式為棚內(nèi)立體床架擺放式栽培。此模式下，菌株A 平均鮮質(zhì)量為254 g，平均生物學(xué)效率最高達(dá)110.43%，均高于菌株B 和對(duì)照菌株C。

3 討論與結(jié)論

以采自不同地區(qū)的野生猴頭菇菌株為材料，從菌絲體生物學(xué)特性、野生馴化和栽培模式三方面進(jìn)行研究，可為不同來源的猴頭菇野生菌株的馴化栽培提供參考，為猴頭菇的育種工作提供材料。

食用菌菌絲生長特性，是衡量優(yōu)質(zhì)菌種的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，會(huì)優(yōu)先考慮菌絲生長速度快、生長勢(shì)好、潔白、粗壯、濃密的菌種，作為生產(chǎn)用菌種[16]。供試的2 株野生猴頭菇菌株菌絲在馴化栽培中體現(xiàn)出優(yōu)良的特性，可作為生產(chǎn)用菌種。2 個(gè)野生菌株除最適溫度一致外，其他生物學(xué)特性存在一定差異，這一結(jié)果可能與野生猴頭菇的不同生長環(huán)境相關(guān)，氣候及植被差異導(dǎo)致菌絲體代謝水平不同，因此對(duì)碳源、氮源和微量元素等的偏好性和代謝能力不同。這與孔怡等[17]研究中的野生猴頭菇分解能力很強(qiáng)，能廣泛氮源、礦質(zhì)元素及維生素等的結(jié)果一致。但是，2 個(gè)菌株都有相同的最適碳源、氮源和微量元素，說明其營養(yǎng)需求相近，可能遺傳差異較小[18]。2 株野生猴頭菇在木屑栽培配方（木屑78%，麥麩20%，石膏1%，過磷酸鈣1%，含水量62%） 中，均可成功出菇。為更好的評(píng)價(jià)野生猴頭菇菌株的出菇性狀，將2 個(gè)菌株與國內(nèi)1 株栽培菌株進(jìn)行出菇評(píng)比。結(jié)果顯示，菌株A 具有明顯優(yōu)勢(shì)，可用作猴頭菇菌種選育的優(yōu)勢(shì)材料。在栽培模式研究試驗(yàn)中，猴頭菇的顏色、性狀、大小等性狀均發(fā)生了變化，可見猴頭菇的農(nóng)藝性狀受環(huán)境變化影響較大。也有相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)，猴頭菇的生長狀態(tài)受溫度、濕度、光照、二氧化碳濃度影響較大，只有在適合條件下才能長出形態(tài)好的子實(shí)體[19]。

此次采集獲得的野生猴頭菇菌株，在生育期、平均生物學(xué)效率等方面具有一定優(yōu)勢(shì)，可以作為猴頭菇新品種選育的寶貴新資源。其生物學(xué)特性和馴化栽培試驗(yàn)結(jié)果，也可為猴頭菇栽培提供數(shù)據(jù)參考。