李海洲，陳正余，王小平，孫新濤，賀才厚

（1.安康市蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，陜西 安康 725000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100）

蛹蟲草 (Cordyceps militaris） 有特殊的營養(yǎng)價(jià)值，如蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD）、硒等，故其也具有明顯的藥用價(jià)值[1]。蛹蟲草的藥理成分和作用與野生冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis） 相近，都能提高機(jī)體免疫功能，明顯降低血清膽固醇，還有雄性激素樣作用及鎮(zhèn)靜功效，但價(jià)格僅為野生冬蟲夏草的1/10，是野生冬蟲夏草的理想替代品[2]。蛹蟲草作為補(bǔ)益類中藥，其藥效成分及生物學(xué)活性研究已有幾十年的歷史，且應(yīng)用越來越廣泛[3]。蠶蛹蟲草既可食用也可藥用，并且食用方法便捷，泡酒、泡茶、煮燉均可。隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蠶蛹蟲草已成為人們餐桌上的美味佳肴和常用保健食品。2009 年，衛(wèi)生部批準(zhǔn)蛹蟲草為新資源食品，在未來的功能性食品和保健性食品開發(fā)中具備較大潛力。近年來，因野生蠶蛹蟲草資源日漸匱乏，因此人工栽培的蠶蛹蟲草以良好的保健功效深受歡迎，需求量逐年上漲，使蠶蛹蟲草栽培業(yè)具有更加廣闊的發(fā)展空間。

人工栽培蠶蛹蟲草，是用蠶蛹蟲草菌種浸染蛹體，菌種從蛹體內(nèi)吸取養(yǎng)分而迅速增殖，約半個(gè)月菌絲即長滿蛹體，隨后蛹體僵硬最終形成僵蛹。通過人工誘導(dǎo)，約1 周即在蛹體的頭、胸、腹各環(huán)節(jié)間膜處形成許多子實(shí)體原基，再經(jīng)約10 d 子實(shí)體即成熟[4]。雖然蠶蛹蟲草的人工培養(yǎng)在我國已獲得成功并進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，但生產(chǎn)中仍存在許多難題，較突出的就是蠶蛹蟲草菌種退化的問題。因?yàn)樾Q蛹蟲草的生長機(jī)制及所需生態(tài)環(huán)境與一般食用菌不同，長期進(jìn)行無性繁殖及多次轉(zhuǎn)管的菌種，其母種基因容易變異，表現(xiàn)為子實(shí)體畸形甚至無法產(chǎn)生子實(shí)體，產(chǎn)量和品質(zhì)均不穩(wěn)定，生物轉(zhuǎn)化率較低[5]。這給批量栽培帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)。因此獲取適應(yīng)性強(qiáng)、子實(shí)體產(chǎn)量高的菌種是蠶蛹蟲草栽培成功的關(guān)鍵因素[6]。蠶蛹蟲草生長需要的營養(yǎng)成分有碳、氮、礦物質(zhì)元素、維生素等，不同成分和含量的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)蟲草的產(chǎn)量和品質(zhì)有明顯影響。營養(yǎng)成分配比不當(dāng)會(huì)造成蠶蛹蟲草子實(shí)體生長推遲，嚴(yán)重時(shí)甚至無法產(chǎn)生子實(shí)體，因此需要根據(jù)蠶蛹蟲草的生長特性篩選適合的液體菌種培養(yǎng)基配方，保證培養(yǎng)基營養(yǎng)均衡。同時(shí)，蠶蛹蟲草的寄主是活體蠶蛹，具有一定的抗菌性，選擇不同的接種方法對(duì)蠶蛹感菌、僵化、轉(zhuǎn)色子實(shí)體形成等的效果都有決定性作用，需要對(duì)不同接種方法進(jìn)行試驗(yàn)，以篩選出最優(yōu)的接種方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蠶蛹蟲草菌株

菌株1（C1）：子實(shí)體采自安康漢陰鳳凰山，菌株由孢子分離獲得。

菌株2（C2）：子實(shí)體采自安康漢濱雙龍鎮(zhèn)，菌株由孢子分離獲得。

菌株3（C3）：菌株來自中國科學(xué)院微生物研究所，菌種編號(hào)為3.4655。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖（AR） 500 g，天津市北辰方正試劑廠；蔗糖（AR） 500 g，天津市北辰方正試劑廠；磷酸二氫鉀（AR） 500 g，天津市化學(xué)試劑三廠；硫酸鎂（AR） 500 g，天津市北辰方正試劑廠；蛋白胨，北京鴻潤寶順科技有限公司；維生素B1、B6，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酵母粉，北京鴻潤寶順科技有限公司；增產(chǎn)靈，江蘇省江都市天達(dá)食用菌研究所；土豆、玉米粉、食用油、食鹽，均為市售。

蠶蛹粉，新鮮蠶蛹經(jīng)60 ℃烘干后粉碎而成；營養(yǎng)強(qiáng)化劑，每1 000 克含酵母粉10 g、葡萄糖20 g、維生素B14 片、維生素B64 片。

1.1.3 液體培養(yǎng)基配方

液體菌種培養(yǎng)基配方F1：300 g 土豆去皮切片，加清水1 000 mL 煮沸后取濾液備用；稱取葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂1 g、食鹽1 g、維生素B115 mg，加入土豆濾出液中攪拌均勻；加入純凈水定容至1 000 mL。將培養(yǎng)液分裝入容積為500 mL 的錐形瓶，每瓶約300 mL，并加入2～3 滴食用油（防止通氣培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生泡沫），用脫脂棉封口。121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻到30 ℃以下備用。

液體菌種培養(yǎng)基配方F2：稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、玉米粉20 g、酵母粉5 g、磷酸二氫鉀10 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B13 片，加純凈水定容至1 000 mL，分裝入容積為500 mL 的錐形瓶中，每瓶約300 mL，加入2～3 滴食用油（防止通氣培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生泡沫），用脫脂棉封口。121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻到30 ℃以下備用。

液體菌種培養(yǎng)基配方F3：200 g 土豆去皮切片，加清水1 000 mL 煮沸后取濾液備用；取蔗糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、維生素B12 片、增產(chǎn)靈0.5 mg，加純凈水定容至1 000 mL，分裝入容積為500 mL 的錐形瓶中，每瓶約300 mL，加入2～3滴食用油（防止通氣培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生泡沫），用脫脂棉封口。121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻到30 ℃以下備用。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-160 型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；YC-D205 超聲波加濕器，北京亞都環(huán)保科技股份有限公司；ACS-25S 電子秤，上海衡器總廠；KB-900 智能脫色搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1810D 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海申生科技有限公司；WJ-JZX 無菌接種箱，濟(jì)南潔康空氣凈化設(shè)備廠；DHG-9075A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選試驗(yàn)

將野生蠶蛹蟲草菌種C1、C2，以及引入的蠶蛹蟲草菌種C3 進(jìn)行活化，分別接種至F1 配方的液體培養(yǎng)基中制備成液體菌種，隨后進(jìn)行菌株篩選試驗(yàn)。取30 個(gè)蠶蛹蟲草栽培罐（瓶），分為3 組，每組10個(gè)，每罐（瓶） 包含25 個(gè)蠶蛹。將3 種蠶蛹蟲草液體菌種以注射的方式分別接種至蠶蛹中，每個(gè)蠶蛹菌種接種量為0.2 mL，將接種了不同菌種的試驗(yàn)組分別記為C1、C2、C3。通過觀察蠶蛹感染后變僵和子實(shí)體形成過程，根據(jù)相應(yīng)參數(shù)及菌株活性，確定最優(yōu)菌種。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化試驗(yàn)

液體菌種的制備方法。在滅菌的接種箱內(nèi)，按無菌操作的要求分別在3 種液體培養(yǎng)基中接入試管母種，每瓶接入5 mm×5 mm 大小的C3 菌種4 塊，并加入5～6 粒小玻璃珠或潔凈沙石（可使菌球分布更均勻）。隨后將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)速為80～120 r·min-1的搖床上，在22～25 ℃條件下震蕩培養(yǎng)5～7 d，待菌球直徑達(dá)0.3～1.0 mm 或菌球充滿液體培養(yǎng)基時(shí)，即液體菌種制作完成。

取30 個(gè)蠶蛹蟲草栽培盒，分為3 組，每組10個(gè)，每盒準(zhǔn)確加入320 g 優(yōu)質(zhì)大米、蠶蛹粉2 g、營養(yǎng)強(qiáng)化劑430 mL，聚乙烯薄膜封口，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻到30 ℃以下備用。將3 種配方制備的蠶蛹蟲草液體菌種分別接種到大米復(fù)合培養(yǎng)基中，將不同培養(yǎng)基配方的試驗(yàn)組記為F1、F2、F3。完成接種后將栽培盒至于溫度為16 ℃、濕度為65%的條件下黑暗培養(yǎng)14 d。觀察菌種在培養(yǎng)基中的生長情況，確定液體培養(yǎng)基的配方。

1.2.3 接種方法優(yōu)化試驗(yàn)

以蠶蛹為寄主，分別采用噴灑（P1）、浸泡（P2）、注射（P3） 3 種方式接種優(yōu)選的蠶蛹蟲草液體菌種（即菌種為C3，液體培養(yǎng)基配方為F1），觀察其發(fā)菌情況，確定最優(yōu)接種方法。

取30 個(gè)蠶蛹蟲草栽培罐（瓶），分為3 組，每組10 個(gè)，分別采用噴灑、浸泡、注射3 種方式接種蠶蛹，每種方法接種10 罐（瓶），每罐（瓶） 25 個(gè)，通過對(duì)比試驗(yàn)觀察蠶蛹變僵情況，確定最優(yōu)接種方法。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌種篩選試驗(yàn)結(jié)果

各試驗(yàn)組中蠶蛹蛹體變僵硬、出現(xiàn)白色菌絲、出現(xiàn)芽孢、芽孢見光轉(zhuǎn)黃色、子實(shí)體形成等情況詳見表1。

表1 蠶蛹蟲草菌株活性對(duì)照表Tab.1 Comparison table of Cordyceps militaris strains

由表1 可知，C1 和C3 接種后的感菌率都在80%以上，C2 的感菌率為78.4%；在5～8 ℃的溫差刺激后，3 個(gè)菌株形成子實(shí)體所占比率分別為78.1%、82.6%、80.3%，C1 菌株的子實(shí)體形成率低于C2 和C3；感光轉(zhuǎn)色率分別為93.7%、93.8%、95.7%，3 個(gè)菌株的轉(zhuǎn)色率都達(dá)到92%以上，轉(zhuǎn)色好；3 個(gè)菌株在轉(zhuǎn)色后子實(shí)體的生長情況均良好。

綜合考慮，C3 菌株接種后，感菌率、子實(shí)體形成率、轉(zhuǎn)色率都達(dá)到80%以上。C3 菌株接種后的生長情況見圖1。

圖1 C3 菌株子實(shí)體形成過程Fig.1 The formation process of fruit body of C3 strain

由圖1 所示，C3 菌株性狀穩(wěn)定、成功率較高，因此選擇C3 為最優(yōu)的蠶蛹蟲草菌種。

篩選出的菌種栽培一段時(shí)間后，為防止菌種退化，必須進(jìn)行分離純化。對(duì)已經(jīng)開始退化的菌種要定期進(jìn)行復(fù)壯，盡可能保持菌種原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不變異。

2.2 液體菌種培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)結(jié)果

各液體菌種培養(yǎng)基表面白色菌絲形成（感菌）情況見圖2，各配方條件下菌種在大米培養(yǎng)基上形成的子實(shí)體見圖3。

圖2 蠶蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)對(duì)照?qǐng)DFig.2 Comparison chart for screening test of liquid spawn for Cordyceps militaris

圖3 蛹蟲草在大米培養(yǎng)基上形成的子實(shí)體Fig.3 Fruit body formed by Cordyoeps mtlttarts on rice culture-medium

由圖2 和圖3 可知，液體菌種培養(yǎng)基配方F1 具有發(fā)菌快，感菌率高的優(yōu)點(diǎn)。配方F1 確定為最優(yōu)配方。

2.3 接種方法篩選試驗(yàn)結(jié)果

接種方法篩選試驗(yàn)情況見圖4。

圖4 蠶蛹蟲草接種方法篩選試驗(yàn)對(duì)照?qǐng)DFig.4 Comparison chart of screening test for inoculation methods of Cordyceps militaris

由圖4 可知，采用噴灑及浸泡的方式接種蠶蛹，蠶蛹感菌率極低，不宜采用。注射接種法接種后蠶蛹感染變僵率較高，因此接種推薦采用注射法。

3 結(jié)論及討論

試驗(yàn)以感菌率高、子實(shí)體整齊、轉(zhuǎn)色發(fā)菌快、菌絲長勢好的3 種優(yōu)良菌種為對(duì)象，通過菌種生長活性對(duì)比試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)菌種。蠶蛹蟲草人工栽培中常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、果膠等，其中以葡萄糖、蔗糖等小分子糖類的利用效果最好；蠶蛹蟲草能利用的有機(jī)氮類很多，其中氨基酸、蛋白胨、豆餅粉、蠶蛹粉、酵母膏等利用效果最好；蠶蛹蟲草所需礦物質(zhì)元素以磷、鉀、鈣、鎂等為主，加入B 族維生素有利于蠶蛹蟲草菌絲的生長和發(fā)育[7]。用無菌注射器吸取液體菌種進(jìn)行注射接種效果最好，液體菌種接種量以0.2 mL 為宜，全過程按無菌操作要求進(jìn)行[8]。

通過對(duì)蠶蛹蟲草菌種、液體培養(yǎng)基配方、接種方法3 個(gè)因素進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以接種后蠶蛹感菌率、子實(shí)體整齊度、轉(zhuǎn)色情況、菌絲長勢為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出感菌率、子實(shí)體形成率、轉(zhuǎn)色率都達(dá)到80%以上，性狀穩(wěn)定的蠶蛹蟲草菌種C3。通過液體菌種培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)，篩選出發(fā)菌快的液體菌種培養(yǎng)基配方F1。分別采用噴灑、浸泡、注射的方式接種蠶蛹蟲草液體菌種，噴灑及浸泡方式雖然操作相對(duì)簡單，但蠶蛹感菌率極低，而注射接種法接種后蠶蛹感染變僵率達(dá)到80%以上，因此注射為最優(yōu)的接種方法。