王新宇,陳紫薇,劉江騰,黎蔚欣,彭慧,張新悅,杜琳

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 100010)

胃潰瘍是常見的消化系統(tǒng)疾病,慢性、周期性(飯后30 min)、節(jié)律性的上腹痛是其典型的臨床表現(xiàn)。本病易反復發(fā)作,若未及時診治,可導致胃出血、胃穿孔、幽門梗阻等并發(fā)癥,甚至發(fā)生腸上皮化生,增加患者胃上皮組織惡變幾率,嚴重影響患者生命健康及生活質量[1]。據(jù)文獻報道,歐美地區(qū)消化道潰瘍患病率為6%～15%,國內患病率為13.83%～19.72%,其中胃潰瘍患病率占消化道潰瘍的30%左右[2-6]。胃潰瘍發(fā)病機制尚不明確,目前被廣泛認同的有攻擊因子說和防御因子失衡說。攻擊因子增強或防御因子的破壞,均可導致黏膜的屏障功能損傷,繼而發(fā)生潰瘍[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學對胃潰瘍的治療以緩解癥狀、促進潰瘍愈合、防止并發(fā)癥和預防復發(fā)為目的,具體可通過降低胃酸、保護胃黏膜、根除Hp 等來實現(xiàn)。雖然治療效果較為顯著,但仍然存在復發(fā)率高、不良反應大等問題[1]。

胃潰瘍尚無明確的中醫(yī)學病名。根據(jù)其典型癥狀,可將其歸類于“胃痛”“痞滿”等范疇?，F(xiàn)代研究表明,中藥、針灸等中醫(yī)療法對胃潰瘍能起到很好的治療作用。大量的基礎、臨床研究表明,針刺治療消化道潰瘍療效確切。動物研究顯示胃潰瘍大鼠在電針治療4 d后潰瘍面可基本愈合[8];呂顯威等[9]認為針灸可改善胃潰瘍患者胃小凹及微血管形態(tài),提高潰瘍愈合質量;一項2017 年的系統(tǒng)評價結果顯示,針刺和西藥對消化道潰瘍都能起到良好的效果,但針刺可以顯著降低消化道潰瘍的復發(fā)率[10]。針刺防治胃潰瘍的療效顯著,但其機制尚未闡明。本文基于現(xiàn)代研究,試從生物信息學、網(wǎng)絡拓撲策略[11]等方面,探究針刺治療胃潰瘍的主要作用機制。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

本文通過中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)中文期刊數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)檢索相關文獻,檢索時限為2001 年8 月—2021 年8 月。檢索方式為主題詞檢索。檢索詞為“針刺”“針灸”“體針”“電針”“胃潰瘍”“消化道疾病”。

1.2 納入標準

以毫針或電針治療胃潰瘍的實驗研究文獻;隨機對照的人類試驗或動物實驗,以及非隨機的比較試驗(前瞻性和回顧性);對照干預可采取安慰劑針灸、假針灸、不治療、另一種積極治療或藥物治療的形式;所選取的腧穴有具體定位及歸經(jīng);感興趣的結果。

1.3 排除標準

使用其他形式刺激的研究,包括無針穴位按壓、艾灸、經(jīng)皮電刺激;在干預前后評估結果的單組觀察性研究;僅比較不同針灸形式的研究;以痛點、敏感點為進針點的研究。

1.4 文獻篩選

兩名研究人員使用預先設定的納入和排除標準,獨立檢索數(shù)據(jù)庫,選擇合適的全文版本文獻。研究人員的爭議通過協(xié)商解決,若未達成共識,則由第三位研究員解決爭議。

1.4.1 針刺后機體產生活性成分的蛋白靶點篩選

STITCH 是一個包含43 萬種化學品的聚合數(shù)據(jù)庫,鏈接到一個易于使用的資源,旨在促進蛋白質和化學品之間相互作用的研究。Swiss Target Prediction是一個基于二維和三維相似性度量和已知配體結合的web 服務器,可以準確預測生物活性分子靶標。從STITCH 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中獲得與褪黑素、生長抑素(somatostatin, SS)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、P 物質(substance P,sp)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和神經(jīng)降壓素高結合親和力(Posibility＞0.1)的靶標。合并上述2 個數(shù)據(jù)庫的檢索結果后去除重復值,得到活性化合物作用的靶點。

1.4.2 胃潰瘍潛在治療靶點的篩選

GeneCards 是人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫,包含所有已注釋和可預測的基因信息,整合了約150 個基因數(shù)據(jù)庫資源,包括基因組、轉錄組、蛋白質組、遺傳、臨床和功能信息等。本研究以“gastric ulcer”為關鍵詞檢索了GeneCards 數(shù)據(jù)庫,得到胃潰瘍的相關靶點。

1.4.3 針刺抗胃潰瘍相關靶點的篩選

將所得兩組靶點用Venn 工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)進行分析。通過維恩圖將針灸相關活性成分靶點與胃潰瘍靶點之間的重疊量可視化,重疊部分即為針灸治療胃潰瘍的核心靶點。為明確針刺產生的活性成分與關鍵靶點之間的關系,運用Cytoscape3.8.2 軟件繪制網(wǎng)絡圖,展示活性成分-靶點的關系。

1.4.4 蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建

運用STRING11.5(https://string-db.org/cgi/input.pl)構建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction networks, PPI)網(wǎng)絡。將針灸治療胃潰瘍的可能靶點上傳到搜索工具(STRING11.5)中,選擇人類作為物種檢索相互作用的基因/蛋白質。為明確活性化合物與關鍵靶點之間的關系,將檢索結果導入Cytoscape3.8.2 軟件,運用Network Analyzer 插件進行網(wǎng)絡拓撲屬性分析,度值(Degree)越高,與其他節(jié)點的連線越多,說明該節(jié)點起到的作用越關鍵。

1.4.5 基因本體論與京都基因組百科全書的富集分析

富集分析采用基因本體(gene ontology, GO)富集分析和京都基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG),繼而通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david. ncifcrf.gov/home.jsp)繪制和可視化效應器靶標,為進一步的功能研究提供依據(jù)。

2 結果

通過檢索數(shù)據(jù)庫,共納入36 篇動物試驗及臨床試驗文獻,篩選出22 個相關的活性物質,其中褪黑素、SS、5-HT、SP、PGE2、神經(jīng)降壓素出現(xiàn)頻次最高,可能對胃潰瘍有效[12-16]。

2.1 針刺治療胃潰瘍的靶點篩查

應用STITCH和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫,得出與針刺后活性成分所作用的基因 60 個;從GeneCard 數(shù)據(jù)庫中收集胃潰瘍相關基因4 980 個。將兩份原始文件中的人類基因名稱標準化后匹配,繪制60 個針灸活性成分的相關靶點和4 980 個胃潰瘍相關的靶點的韋恩圖,得出了交集靶點(圖1),即37 個潛在的胃潰瘍治療靶點?！搬樉?活性成分-靶點-疾病”互作網(wǎng)絡見圖2,橘色菱形代表活性成分,粉色圓形代表60 個潛在靶點,紅色八邊形代表針刺治療,黃色六邊形代表胃潰瘍,產生連接越多的節(jié)點相應的圖形面積越大,在治療中發(fā)揮的作用越明顯,其中褪黑素、5-HT和PGE2在治療過程中可能起到關鍵作用。

圖1 交集靶點

圖2 活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡的建立與分析

基于STRING 數(shù)據(jù)庫構建PPI 網(wǎng)絡,經(jīng)過拓撲分析后,通過 Cytoscape 可視化,顯示 88 個節(jié)點?！癉egree”為網(wǎng)絡中節(jié)點的連接數(shù),可以反映節(jié)點之間的交互程度,Degree 值越大表示節(jié)點的重要性越大。POMC 最大(15),其次是SST(14)、TAC1(12)、SLC6A4(12)、HTR3A(11)和SLC6A3(10)。詳見圖3。Top20 核心靶點按程度排序如表1 所示,確定為針刺治療胃潰瘍的關鍵靶點。

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 分析可以從3 個方面反映靶標功能,分別為細胞成分(cellular component, CC) 、 分子功能(molecular function, MF)和生物過程(biological process, BP)。GO 分析結果顯示得到476 條生物學過程,其中396 條BP、25 條CC、55 條MF,分別取前20列表。

其中在BP 層面(圖4),預測靶點主要參與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)的 G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路(G protein-coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)、腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)、平滑肌收縮(smooth muscle contraction)等生物過程具有顯著意義;在CC層面,神經(jīng)元胞體(neuronal cell body)、突觸后膜整體成分(integral component of postsynaptic membrane)其所占比例較大;在MF 層面,與前列腺素受體活性(prostaglandin receptor activity)、二十醛類受體活性(icosanoid receptor activity)、神經(jīng)肽受體活性(neuropeptide receptor activity)等關系密切。

圖3 針刺治療胃潰瘍潛在靶點相互作用網(wǎng)絡圖

表1 與針刺治療胃潰瘍相關的靶點(按“Degree”排序)

圖4 GO-BP 生物學功能分析

共富集得到KEGG 生物學過程7 條。圖5 列出了潛在靶點的KEGG 富集結果。KEGG 信號通路涉及神經(jīng)活性配體- 受體相互作用(neuroactive ligandreceptor interaction) 、 cAMP 信號通路(cAMP signaling pathway)、鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)、生長激素合成分泌作用通路(growth hormone synthesis, secretion and action)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)和PPAR 信號通路(PPAR signaling pathway)。KEGG 通路分析結果顯示,針刺能通過多種信號通路及代謝通路發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。圖6 總結了潛在靶點在cAMP 通路中的作用。

圖5 KEGG 通路富集分析

圖6 潛在靶點在cAMP 通路中的作用

3 討論

本文基于生物信息學篩選潛在活性成分及對應靶點,預測針灸治療胃潰瘍、預防復發(fā)的關鍵作用靶點及信號通路。

“針刺-胃潰瘍”共同靶點PPI 蛋白互作網(wǎng)絡結果表明,針刺干預胃潰瘍與37 個靶點相關,其中POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A、SLC6A3、HTR1A 等蛋白交互作用相對較強。POMC 基因編碼一種前蛋白,這種前蛋白經(jīng)過加工可產生多種生物活性肽,如促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropin hormone, ACTH)、β-內啡肽(鎮(zhèn)痛物質)和促黑激素等,這些活性肽在許多重要的信號通路中參與。同時POMC 的異常表達還與抑郁癥、雙相情感障礙等精神心理疾病密切相關[17]。動物實驗表明,胃黏膜應激性損傷會伴隨ACTH、β-內啡肽的升高,而藥物干預可減輕粘膜損傷程度,同時使ACTH、β-內啡肽水平降低[18-19]。促黑激素則被證明可通過促進SS 表達對乙醇誘導的大鼠胃潰瘍產生保護作用[20]。以上實驗均體現(xiàn)了POMC 下游產物對胃潰瘍的影響,但目前仍缺乏對POMC 于胃潰瘍聯(lián)系的直接探究。SST 的表達產生SS,在結合高親和力G 蛋白偶聯(lián)的SS 受體后,可抑制多種次級激素的釋放;與胃腸道大多數(shù)的激素存在相互作用,從而抑制胃消化間期肌電復合波和胃排空、抑制回腸和膽囊收縮、抑制腸道內容物轉運[21]。若SST 表達受到抑制,SS 分泌減少會使胃酸分泌增加、胃十二指腸黏膜的防御功能降低,從而增加了消化性潰瘍的發(fā)生幾率[22]。研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過提高SS 水平來達到促進胃潰瘍恢復的目的[14]。TAC1編碼速激肽激素家族的4 種產物,SP、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)肽K 和神經(jīng)肽γ。這些神經(jīng)遞質可與神經(jīng)受體和平滑肌細胞作用,起到血管擴張劑和促分泌劑的作用。研究發(fā)現(xiàn)SP 可以通過調節(jié)Akt/eNOS/NO 信號通路,避免炎癥損傷血管內皮細胞[23]。大量研究結果表明,SP 可以顯著促進傷口愈合,對慢性傷口也有較好的效果[24]。而在結構上,SP 與天然抗菌肽結構相似[25],可能對幽門螺旋桿菌感染起到一定的防御作用,但目前尚無實驗研究其對幽門螺旋桿菌抗菌活性的強弱。與此同時,腦下行的和脊髓固有的SP 神經(jīng)元釋放阿片肽后,可以起到鎮(zhèn)痛作用[26]。由此可見,TAC1 的表達可從病因、病理機制和癥狀3 個方面對胃潰瘍起到治療作用。SLC6A4、SLC6A3、HTR3A、HTR1A 均是5-HT 相關的基因。研究發(fā)現(xiàn)5-HT 信號系統(tǒng)在胃腸道功能性疾病中扮演了重要角色,該信號通路的異?？梢l(fā)胃腸道動力及分泌功能異常和內臟高敏感性[27]。此外,這些基因的異常表達還常見于精神、心理疾病?？偟膩碚f,這些基因聯(lián)系緊密,在針刺促進胃潰瘍修復的進程中相互影響,但目前的研究多著眼于單個基因某個下游產物對胃潰瘍的作用機制,未針對全部下游產物逐個挖掘,且缺乏胃潰瘍修復過程中多基因協(xié)作機制的研究。

GO 分析結果表明,針刺治療胃潰瘍的作用機制是多靶點、多層次的,由多種生物學過程共同參與而成,KEGG 通路分析結果將靶點富集的生物過程展示出來。首先,BP 層面涉及G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、平滑肌收縮,這與Ca2﹢信號通路密切相關。興奮-收縮偶聯(lián)時,膜去極化誘導電壓門控Ca2﹢通道打開,胞內Ca2﹢濃度增加,激活RyR 開放,觸發(fā)內質網(wǎng)局部釋放Ca2﹢,導致肌肉收縮[28]。SERCA 是存在于肌漿網(wǎng)和內質網(wǎng)的膜轉運蛋白,主要功能是將胞漿內的Ca2﹢轉運到肌漿網(wǎng)和內質網(wǎng)中,維持細胞內的Ca2﹢穩(wěn)態(tài)[29]。針刺可以通過促進GPCR 的表達,增加PLN 磷酸化,減少PLN 對SERCA 的抑制,促進內質網(wǎng)攝取Ca2﹢,胞質中Ca2﹢濃度下降,促進肌肉舒張;內質網(wǎng)Ca2﹢儲存量增加,可進一步激活RyR 開放,促進肌肉收縮。PKA 是抗抑郁藥物的靶點之一,抗抑郁藥物可以通過增強大腦特定部位PKA 的活力來達到治療目的[30]。如圖6,GPCR 載體在GPCR-cAMP-PKA 信號通路中也起到了作用,ATCH 和SST均可以作用于GPCR,從而起到上調PKA 表達的作用,現(xiàn)代研究結果提示電針可以通過該通路起到抗抑郁的作用[31]。在GO-CC 層面涉及神經(jīng)元胞體、突觸后膜整體成分,其中KEGG 結果提示,5-HT 能突觸起到重要作用。針刺產生的活性物質5-HT 可以通過激活膠質細胞上的5-HT2A和SERT 促進內質網(wǎng)釋放Ca2﹢、促進胞外Ca2﹢內流,提高胞內Ca2﹢水平,從而促進平滑肌收縮。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),5-HT 收縮胃底平滑肌與PKC 有關,這與KEGG 富集結果也是一致的[32]。此外5-HT 還可以激活5-HT4,6,7通路,通過AC5 上調cAMP 通路,起到調整抑郁狀態(tài)的作用。

綜上,本研究預測針灸可能通過POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A 等關鍵靶點來調節(jié)cAMP 信號通路、鈣離子信號通路、5-HT 能突觸等,從而促進平滑肌收縮、保護血管內皮、防御幽門螺旋桿菌、鎮(zhèn)痛、調節(jié)抑郁狀態(tài),從緩解癥狀、促進愈合、去除誘發(fā)因素等不同層面達到治療胃潰瘍的目的。大量現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),不良情緒與消化道疾病關系密切[33]。通過本次研究可推測,針刺治療伴發(fā)情緒障礙的胃潰瘍可取得較好的療效,而改善患者情緒也可以起到預防胃潰瘍等消化道疾病復發(fā)的作用。

本研究只納入了針刺治療后人體產生的6 種具有代表性的活性物質,其他活性物質仍需進一步數(shù)據(jù)挖掘和實驗驗證,未對針灸處方、治療時長和頻率等針灸治療的重要參數(shù)進行分析,并缺乏對研究結果的驗證。

中醫(yī)學認為,人體自身是一個有機整體。針刺可以通過穴位刺激,多靶點、多層次地調控人體網(wǎng)絡,從而起到治療作用。筆者基于文獻研究,借助生物信息學和網(wǎng)絡拓撲學方法,研究針刺治療胃潰瘍的生物學機制,為針刺治療胃潰瘍的基礎實驗研究提供了理論依據(jù)。