劉國(guó)華 何玉榆 陳彤 譚磊 吳雯娟 鐘名琴

摘? 要：本研究建立了一種超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的方法。該方法在硝基咪唑類藥物的殘留量介于0.300～30.0 ng/mL的范圍內(nèi)時(shí)具有良好線性關(guān)系，5種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，方法檢出限在4.60×10-2～3.38×10-1 μg/kg范圍內(nèi)，低、中、高不同濃度點(diǎn)加標(biāo)平均回收率范圍分別為74.6％～105.0％、77.4％～106.0％、81.7％～107.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9％～11.7％。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，適用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：硝基咪唑；動(dòng)物源性食品；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào)：S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-0769（2023）04-0096-06

硝基咪唑類藥物是一類硝基雜環(huán)類抗菌藥物，其衍生物易與生物體內(nèi)的許多大分子物質(zhì)發(fā)生超分子結(jié)合[1]，在抗厭氧菌[2]、抗寄生蟲[3]等方面有廣泛的用途。近年來(lái)，由于硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗菌作用，經(jīng)常作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，以促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率。然而，在農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)期間，以及在飼料和農(nóng)產(chǎn)品加工、貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中，均易造成硝基咪唑類藥物污染。由于硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的致癌、致畸和致突變作用，且代謝物在動(dòng)物體內(nèi)能夠比原藥維持更長(zhǎng)的時(shí)間[4]，如果在動(dòng)物源性食品中殘留、累積，則會(huì)造成較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，硝基咪唑類藥物在許多國(guó)家被列為違禁藥物，我國(guó)也對(duì)硝基咪唑類藥物進(jìn)行了嚴(yán)格的限制。GB 31650－2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[5]明確規(guī)定，二甲硝咪唑和甲硝唑可用于動(dòng)物疾病的治療，但不得在動(dòng)物源性食品中檢出。GB 31650.1－2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》[6]明確規(guī)定，左旋咪唑在禽蛋中的最大限量值為5 μg/kg。其他硝基咪唑類藥物在所有食品動(dòng)物中被禁止使用，且不得檢出。

為確保動(dòng)物源性食品的衛(wèi)生安全，有必要為殘留的硝基咪唑類藥物建立一種簡(jiǎn)單快捷且具有高靈敏度的檢測(cè)方法。目前，硝基咪唑類藥物的測(cè)定方法有流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、高效液相色譜 法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-12]，雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道可用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物，但大部分檢測(cè)方法存在適用對(duì)象單一、操作復(fù)雜、提取效果差等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，如GB/T 21318－2007 《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》[13]，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物，但是采用凝膠色譜凈化，該過(guò)程繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，消耗試劑及材料較多，無(wú)法滿足當(dāng)前檢測(cè)的需要，對(duì)操作人員身體健康也可能造成較大危害；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告－22－2008[14]只適用于豬的肌肉和肝臟組織，且前處理步驟繁瑣，花費(fèi)時(shí)間多，操作不當(dāng)易造成損失。

本研究對(duì)樣本前處理方法及儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立一種簡(jiǎn)單快捷且靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測(cè)定，為保障動(dòng)物源性食品的衛(wèi)生安全和消費(fèi)者“舌尖上的安全”提供技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

試驗(yàn)需要N-EVAP-24型氮吹儀（美國(guó)Organomation associates公司）、多管旋渦混合儀（杭州米歐儀器有限公司）、賽多利斯BSA3202S型天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、SIGMA 3-18K高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）、超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、Aglient 1290超高效液相色譜儀（美國(guó)Aglient公司）、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple QuadTM

5500 質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）等。

1.1.2 試劑與耗材

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、6cc 200 mg PRIME HLB固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）等。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑：純度高于95.0％（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 樣本制備

取代表性樣本約500 g，使用勻漿機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中作為試樣，將試樣密封置于－18 ℃冷凍避光保存。在樣本制備時(shí)應(yīng)防止樣本交叉污染。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃冷凍避光保存?zhèn)溆?。分別移取適量上述五種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣本前處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取樣本（2.50±0.02）g于50 mL離心管中，加10 mL乙腈水溶液（含80％乙腈水和0.2％甲酸）后，立即渦旋2 min混勻，用超聲波清洗儀超聲提取5 min，6 000 r/min高速冷凍離心5 min。

1.4.2 凈化

移取上述上清液4.0 mL，直接過(guò)PRIME HLB固相萃取柱（6cc 200 mg），保持1 s/滴的速度，收集全部流出液，準(zhǔn)確移取2.5 mL流出液至帶刻度離心管內(nèi)。流出液于40 ℃水浴下氮?dú)獯抵辽儆?.3 mL，殘留液用甲醇+水+甲酸（體積比為10 ∶ 90∶ 0.09）溶液定容至1.00 mL，渦旋1 min混勻后過(guò)

0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18

（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液；流動(dòng)相B為甲醇（色譜純）；柱溫40.0 ℃；進(jìn)樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧（ESI）；電噴霧電壓：4 500 V；掃描方式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度550 ℃；柱溫40 ℃；氣簾氣壓力35.0 psi；碰撞氣壓力9.0 psi；霧化器壓力55.0 psi；輔助加熱器壓力55.0 psi。

保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量見表2。

空白基質(zhì)添加25.0 μg/kg含苯硝咪唑、異丙硝唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑和2-甲硝咪唑的混合物色譜圖見圖1。

2? 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取5個(gè)豬肉空白基質(zhì)樣本，按照1.4所述方法進(jìn)行前處理，獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的濃度依次為：0.300 ng/mL、0.600 ng/mL、? ?1.50 ng/mL、3.00 ng/mL、15.0 ng/mL；2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的濃度依次為0.600 ng/mL、1.20 ng/mL、3.00 ng/mL、? 6.00 ng/mL、30.0 ng/mL。按1.5所述方法設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 2，、0.999 9、0.999 7、0.999 9和0.999 7，可發(fā)現(xiàn)基質(zhì)試驗(yàn)峰面積與相應(yīng)濃度的線性關(guān)系較好，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，做7個(gè)平行添加試驗(yàn)，羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的陽(yáng)性添加濃度均為1.00 μg/kg，2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的陽(yáng)性添加濃度均為0.50 μg/kg。樣本前處理后，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。根據(jù)各樣本檢測(cè)值計(jì)算出平均值（? ）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），計(jì)算公式為：

檢出限（method detection limit，

MDL）=（k×SD×C）/

式中：k為置信因子，一般取3；C為理論加標(biāo)水平，單位為μg/kg；測(cè)得羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、2-甲硝咪唑方法檢出限分別為4.60×10-2 μg/kg、3.38×10-1 μg/kg、2.24×10-1 μg/kg、1.04×10-1 μg/kg、1.28×10-1 μg/kg（表3）。

2.3 方法回收率和精密度驗(yàn)證

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，進(jìn)行3個(gè)不同濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平均取6個(gè)平行樣，2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑陽(yáng)性添加濃度分別為0.500 μg/kg、? ? ? ? ? ?1.00 μg/kg、5.00 μg/kg；羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑陽(yáng)性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00 μg/kg、10.0 μg/kg。按照1.4所述方法進(jìn)行前處理，處理好的樣本供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。豬肉樣本中羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑和2-甲硝咪唑的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果詳見表4。

由表4可知，本研究所述方法的回收率較好，2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的回收率范圍分別為77.3％～107.0％、74.6％～1067.0％、74.6％～106％、82.4％～99.6％和76.6％～98.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為3.4％～9.5％、2.9％～11.7％、6.0％～7.2％、3.9％～7.1％和4.2％～8.1％，說(shuō)明所建立的方法重復(fù)性好，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

3? 結(jié)論

本研究建立了一種動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜簡(jiǎn)便測(cè)定方法，與傳統(tǒng)方法相比，該方法采用酸化乙腈水溶液提取、直通型PRIME HLB固相萃取柱凈化的方式，提高了檢測(cè)效率，檢測(cè)時(shí)間縮減至2 h。該方法靈敏度低、準(zhǔn)確度高且分離度好，可適用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的定性、定量檢測(cè)，為硝基咪唑類藥物的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1] SACKTON K L，DIMOVA N，ZENG X，et al．Synergistic blockade of mitotic exit by two chemical inhibitors of the APC/C[J]．Nature，2014，514（7524）：646-649.

[2] 韓肖亞，陳冬梅，王玉蓮，等．幾種獸用合成抗菌藥基于抗體快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（6）：1869-1876.

[3] 劉得貴，張應(yīng)龍，杜國(guó)輝，等．動(dòng)物性產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[J]．山東畜牧獸醫(yī)，2020，41（3）：68-71.

[4] 謝文，陳笑梅，丁慧瑛，等．液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同位素稀釋法對(duì)蜂王漿中10種硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè) [J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（5）：497-501，506.

[5] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局．食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量：GB/T 31650－2019[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2019.

[6] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局．食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量：GB/T 31650.1－20-22[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2022.

[7] 譚利．基于分子印跡—流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)硝基咪唑類物質(zhì)[D]．重慶：重慶師范大學(xué)，2018.

[8] 王亞賓．檢測(cè)硝基咪唑類藥物、萊克多巴胺和安定殘留的酶聯(lián)免疫法的建立[D]．濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

[9] 于敏，張美娟，張河霞，等．高效液相色譜法測(cè)定牛奶中硝基咪唑類殘留量[J]．食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（2）：447-451.

[10] 張麗媛，周劍，王敏，等．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉和雞蛋中3種硝基咪唑類藥物[J]．食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（14）：4508-4514.

[11] 魏云計(jì)，朱臻怡，馮民，等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定飼料中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2017，36（3）：377-381.

[12] 鄭熠，張杉，關(guān)旭，等．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中硝基咪唑類藥物殘留[J]．北京農(nóng)業(yè)，2013（15）：147-150.

[13] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)．動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法：GB/T 21318-2007[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[14] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部．動(dòng)物源食品中4種硝基咪唑殘留量檢測(cè)：中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-22-2008[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.