響應面法優(yōu)化‘赤霞珠’葡萄皮可溶性膳食纖維的提取工藝

范雪梅，萬龍楠，段雪榮，侍朋寶*

（1. 貴州茅臺酒廠(集團)昌黎葡萄酒業(yè)有限公司，河北昌黎 066600；2. 河北科技師范學院食品科技學院，河北昌黎 066600）

中國營養(yǎng)學會將膳食纖維（Dietary fiber，DF）定義為植物中天然存在的、從植物中提取或直接合成的聚合度≥3、可食用的、不能被人體小腸消化吸收的、對人體有健康意義的碳水化合物的聚合物[1]。從其定義可以看出，膳食纖維是一大類物質(zhì)的總稱，主要來源有三大類：（1）天然存在于植物如水果、堅果、蔬菜、全谷物等的基本組成部分；（2）由食物原料經(jīng)物理、化學或酶法等提取獲得的碳水化合物的聚合物；（3）合成的碳水化合物的聚合物[1]。隨著居民膳食結(jié)構(gòu)的改變，動物性食物消費量增加，谷類消費減少和加工精度不斷提高，影響了膳食纖維的攝入，僅有約20%的人群達到推薦的適宜攝入量，即每天25 g，有約50%的人群膳食纖維的攝入量占適宜攝入量的40%～79%[2]。因此，有必要從食物原料中提取膳食纖維，作為食品添加劑、營養(yǎng)強化劑或食品原料等，以補充人們?nèi)粘Ｉ攀忱w維的攝入。

自然界大約有千種以上的膳食纖維，包括纖維素、半纖維素、果膠、瓜爾膠、黃原膠、抗性低聚糖、抗性淀粉、木質(zhì)素類等[3]。根據(jù)溶解性，可將膳食纖維分為不溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）[4]。IDF主要作用于腸道產(chǎn)生機械蠕動效果，促進胃腸健康，對便秘和肥胖癥等有較好的治療效果；SDF除具有一般纖維的生理作用外，與IDF比較，在抑制血清膽固醇、高血脂、高血糖和高血壓方面具有更強的作用[5]。因此，適當增加DF中SDF的比例可更好的發(fā)揮其生理功能。有學者提出SDF與IDF的比例為1∶3時，DF組成合理，能夠最佳地發(fā)揮DF的生理功能[6]，但許多天然存在的DF資源中的SDF所占比例偏低，因此采用不同的方法如化學法[7]、物理法[8]、酶法[9-12]等提取，以提高SDF的含量，受到了人們的重視。

2021年，全球葡萄園面積730萬公頃，我國葡萄種植面積78.26萬公頃，僅次于西班牙和法國，居世界第3位；鮮食葡萄產(chǎn)量1120萬噸，占世界產(chǎn)量的16.1%，居世界第1位[13]。2022年，全國規(guī)上葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)完成釀酒總產(chǎn)量21.37萬千升[14]，葡萄皮渣等副產(chǎn)物可達4.5萬噸。葡萄皮渣中總膳食纖維含量較高，可達皮渣干質(zhì)量的75%[15]。不同葡萄品種皮渣SDF含量占葡萄皮渣干質(zhì)量的比例有較大的差異，不同提取方法所得結(jié)果也不同[10]。酶法提取具有工藝簡單、反應條件溫和、所得產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，因此采用酶法提取的研究較多，但不同研究SDF的提取率存在較大差異，為14.32%～34.04%不等[9,11,16-18]，可以看出酶法提取葡萄皮渣SDF所得結(jié)果并不穩(wěn)定，可能與試驗具體條件、所用葡萄品種不同等因素有關(guān)。

河北昌黎是我國主要釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)之一，栽培品種以‘赤霞珠’為主，每年均有可觀數(shù)量的葡萄皮渣產(chǎn)生，利用葡萄皮渣提取膳食纖維，對資源綜合利用，提高土地附加值，促進葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究通過單因素和響應面優(yōu)化酶法提取試驗方法，以SDF得率為指標，探討從‘赤霞珠’葡萄皮中提取SDF的最佳工藝參數(shù)，為葡萄廢棄物綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘赤霞珠’葡萄果皮：葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后，壓榨分離皮渣，并去除種子，由貴州茅臺酒廠（集團）昌黎葡萄酒業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑

無水乙醚：天津市匯杭化工科技有限公司；NaOH：天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙醇、磷酸氫二鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上均為分析純。

纖維素酶（1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，CAS號：9012-54-8），50 U·mg-1，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JA3003型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；PHS-3C型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；抽濾機：天津市騰達過濾器件廠；BGZ-76型鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司；TGL-16型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 可溶性膳食纖維的提取

將葡萄皮用鼓風干燥箱于80 ℃烘干后粉碎，過60目篩，取一定量粉末用無水乙醚反復浸泡脫脂，至沒有油脂析出，用80%（Vol，下同）的乙醇洗滌除去乙醚后烘干。按1∶10（g·mL-1）的料液比加入0.5%NaOH溶液，于50 ℃水浴中攪拌處理2 h。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)pH值，加入纖維素酶，酶解一定時間后，升溫至100 ℃，滅酶10 min；降溫后，于8000 r·min-1離心20 min；取上清液加熱蒸發(fā)至原體積的1/3，加入4倍體積的無水乙醇，靜置60 min，之后于8000 r·min-1離心20 min，沉淀于80 ℃烘干即為可溶性膳食纖維[9-12]。

1.4.2 單因素試驗

（1）酶用量對葡萄皮渣中SDF提取率的影響

①將1 g葡萄皮粉末與蒸餾水按1∶10料液比混合，加入0.5% NaOH溶液，于50 ℃水浴中攪拌處理2 h，用緩沖溶液調(diào)pH值為5，添加纖維素酶500 U·g-1，在50 ℃條件下酶解4 h。②酶解反應結(jié)束后，水浴溫度100 ℃，滅酶10 min。③降溫后離心，取上清液加熱蒸發(fā)并加入無水乙醇靜置，之后于8000 r·min-1離心20 min，沉淀于80 ℃烘干即為SDF。④依次將酶用量改為0、1000、1500、2000 U·g-1，重復①～③的操作。

（2）酶作用時間對葡萄皮渣中SDF提取率的影響

依次將酶解時間改為1、2、3、5 h，添加纖維素酶量為上述試驗所得最佳酶量，重復1.4.2(1)的試驗。

（3）pH對葡萄皮渣中SDF提取率的影響

依次將pH改為3.5、4、4.5、5.5，添加纖維素酶量為上述所得最佳酶量，作用時間為以上所確定的最佳時間，重復1.4.2(1)的試驗。

（4）酶作用溫度對皮渣中SDF提取率的影響

將溫度依次改為40、45、55、60 ℃，調(diào)pH值為上述實驗所確定的最佳pH值，添加纖維素酶量為上述最佳酶量，時間為以上所確定的最佳時間，重復1.4.2(1)的試驗。

1.4.3 優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以加酶量、酶作用時間、pH、酶作用溫度為響應因子，采用 Design-Expert 8軟件，設計Box-Behnken四因素三水平試驗自變量，以SDF得率為響應值，通過響應面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.4.4 可溶性膳食纖維提取率的計算

采用酶-重量法測量皮渣中SDF的重量[7,19]，即原料經(jīng)預處理后在一定溫度、時間、加酶量、pH值條件下經(jīng)纖維素酶作用后，測定料液中的SDF含量。結(jié)果以SDF的提取率為指標。

SDF提取率（%）=(提取的SDF質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶用量對SDF提取率的影響

不同纖維素酶添加量對SDF提取率的影響結(jié)果見圖1。加入一定量的纖維素酶可以增加SDF得率，但當纖維素酶的添加量＞500 U·g-1后，SDF得率開始降低。由此確定纖維素酶最佳加入量為500 U·g-1。

圖1 不同纖維素酶用量對SDF提取率的影響Figure 1 Effect of enzyme concentration on SDF extraction rate

2.1.2 酶作用時間對SDF提取率的影響

不同纖維素酶作用時間對SDF提取率的影響結(jié)果見圖2。在1～4 h范圍內(nèi)隨著作用時間的增加，料液中SDF提取率呈增加趨勢。4 h后SDF的提取率開始下降，因此，反應時間取4 h。

圖2 不同酶解時間對SDF率提取的影響Figure 2 Effect of time on SDF extraction rate

2.1.3 pH值對SDF提取率的影響

圖3顯示，當pH值由3.5增加至4.5時，對SDF提取率的影響很小。當pH值由4.5增至5.0時，SDF提取率明顯增加，當pH值繼續(xù)增大時，又呈下降趨勢。由此可知，本試驗條件下纖維素酶在pH值為5.0時酶促反應效率較高，因此確定5.0為最適pH值。

圖3 不同pH值對SDF提取率的影響Figure 3 Effect of pH value on SDF extraction rate

2.1.4 酶作用溫度對提取率的影響

不同纖維素酶作用溫度對SDF提取率的影響結(jié)果見圖4。40～45 ℃時SDF提取率升高至最高值，溫度繼續(xù)升高，SDF提取率逐漸下降，因此，確定最佳反應溫度為45 ℃。

圖4 不同溫度對SDF提取率的影響Figure 4 Effect of temperature value on SDF extraction rate

2.2 響應面法優(yōu)化酶解可溶性膳食纖維的結(jié)果分析

2.2.1 響應面因素水平和設計方案

通過單因素試驗得出酶法提取SDF的最佳工藝參數(shù)：pH 5.0、加酶量500 U·g-1、酶解溫度45 ℃、酶解時間4 h。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合試驗設計進行響應面試驗，以影響SDF得率的主要參數(shù)pH（A）、加酶量（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）四因素為自變量，每個因素設三個水平，以SDF得率為響應值，試驗因素水平及編碼見表1。響應面試驗設計（由Design-Expert 8軟件根據(jù)四因素三水平試驗設計自動生成的29種組合）及結(jié)果見表2。

表1 響應面試驗因素和水平Table l Factors and levels of response surface test

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface test

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析

對表2的試驗結(jié)果采用Design Expert 8軟件進行分析，采用二階模型，描述各因素與SDF提取率Y之間關(guān)系的多元二次模型：

模型的方差分析結(jié)果見表3。該模型F 值為19.31，P＜0.0001，達極顯著水平；失擬項P=0.2045未達顯著水平，相關(guān)系數(shù)R2為0.9508，說明響應值的變化95.08%來源于自變量，即模型對試驗的擬合情況較好。pH、酶解時間及二次項A2、B2、C2對提取率的影響達極顯著水平（P＜0.01）；酶解溫度對提取率影響達極顯著水平（P＜0.01）；交互項AB、AC、AD對提取率的影響達顯著水平（P＜0.05）。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.3 響應面分析

試驗中兩因素的交互作用對提取率的影響可通過響應曲面來反映，響應曲面的曲率越大則交互作用越顯著。本試驗各因素交互作用對葡萄皮SDF提取率影響的響應面及等高線圖見圖5。當溫度和提取時間一定時，隨著pH的增加，提取率先增加后降低；隨加酶量的增加，提取率先增加后降低，兩因素之間的交互作用對提取率的影響顯著。當加酶量和提取時間一定時，隨著pH的增加，提取率先增加后降低；隨反應溫度的增加，提取率先增加后降低，兩因素之間的交互作用對提取率的影響顯著。當加酶量和溫度一定時，隨著pH的增加，提取率先增加后降低；隨反應時間的延長，提取率呈增加趨勢，兩因素之間的交互作用對提取率的影響顯著，以上結(jié)果均與表3中數(shù)據(jù)相吻合。

圖5 各兩因素交互作用的響應面及等高線圖Figure 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on extraction yield of SDF

圖5 各兩因素交互作用的響應面及等高線圖（續(xù)）Figure 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on extraction yield of SDF

2.2.4 提取工藝參數(shù)優(yōu)化及驗證

經(jīng)軟件優(yōu)化得出葡萄皮SDF最佳提取工藝參數(shù)為：pH（A）5.19、加酶量（B）506.52 U·g-1、溫度（C）44.32 ℃、時間（D）5.00 h，在此最佳工藝條件下SDF理論得率為31.6557%?？紤]到實際操作的便利，將纖維素酶提取葡萄皮SDF的最佳條件修正為：pH（A）5.20、酶添加量（B）507.00 U·g-1、活化溫度（C）44.50 ℃、活化時間（D）5.00 h。為了驗證模型方程的可行性，在此條件下進行3組平行實驗，實際測得的SDF平均提取率為31.20%，與理論預測值相差不大。表明數(shù)學模型對優(yōu)化葡萄皮SDF的提取工藝參數(shù)可行。

3 討論

本試驗采用酶法提取葡萄皮中可溶性膳食纖維，試驗所用纖維素酶能降解不溶性膳食纖維，使其分子間的氫鍵斷裂，破壞分子間的結(jié)構(gòu)而轉(zhuǎn)化為可溶性膳食纖維。影響酶作用效果的因素有很多，主要的有反應溫度、pH、酶濃度、底物濃度、抑制劑、激活劑等。本研究在前人研究結(jié)果[11,18]及前期試驗基礎(chǔ)上，考察了pH、加酶量、提取溫度及提取時間等因素對可溶性膳食纖維提取率的影響。

pH主要通過影響酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性、解離狀態(tài)及底物分子解離或帶電狀態(tài)等影響酶的活性，過酸或過堿可導致酶變性失活，酶的解離狀態(tài)或電荷狀態(tài)與酶催化能力密切相關(guān)；底物的帶電狀態(tài)決定了其是否有利于與酶結(jié)合和被酶催化[20]。因此酶的催化反應對酸堿度非常敏感，本研究也得出pH對提取率的影響達到極顯著水平，在試驗考察的幾個因素其影響最大，這與劉婭等[18]的研究結(jié)果一致。

酶用量對反應效果的影響與底物濃度有關(guān)，在酶促反應中，酶先要與底物形成中間復合物，當?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶濃度時，反應速率隨酶濃度的增加而增加[20]。本試驗中隨著加酶量的增大，提取率達到一定值后呈降低趨勢，這可能是由于適量的纖維素酶可以使一部分不溶性半纖維素變成可溶的半纖維素，以及一些不溶性膳食纖維轉(zhuǎn)變成可溶性的葡聚糖，提高SDF含量。當酶的加入量超過一定值時，不溶性的膳食纖維進一步降解，生成分子量更低的小分子多糖、低聚糖或者單糖，無法被乙醇沉淀，使得SDF得率反而降低。

溫度對酶作用的影響有兩個方面，一是在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的增加反應速度增加，另一方面是溫度超過酶的最適溫度后，隨著溫度的增加，酶的變性程度加大，其催化活力降低，同時溫度對酶的影響與反應時間也有關(guān)，因為溫度促使酶的變性是隨時間累加的[20]。本試驗中SDF提取率隨溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明試驗所選溫度包含該酶的適宜作用溫度。

本研究中，隨著反應時間的增加，SDF提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這可能是由于開始時纖維素酶將IDF分解為SDF，使SDF隨時間而增加，且隨著反應時間的延長，纖維素酶進一步將SDF轉(zhuǎn)變?yōu)楣烟呛蛦翁?，使得SDF得率下降，該變化趨勢與郭紅珍等[11]、劉婭等[18]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面法優(yōu)化‘赤霞珠’葡萄皮SDF提取工藝參數(shù)，響應面回歸模型決定系數(shù)達極顯著水平，與實際情況吻合較好，反映了各因素對SDF提取率的影響規(guī)律。優(yōu)化出酶法最佳提取工藝參數(shù)為pH5.20、酶添加量507.00 U·g-1、活化溫度44.50 ℃、活化時間5.00 h。在此條件下，‘赤霞珠’葡萄皮SDF提取率為31.20%。