鄧 娟，左右清，王 念，胡熙苒，曾 禮

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南 湘潭 411104；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013

創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損性癥狀給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)極大的影響，也是骨關(guān)節(jié)外科目前的難題［1-2］。軟骨組織主要成分是水、膠原與蛋白多糖等，其營(yíng)養(yǎng)主要由周?chē)P(guān)節(jié)液或下面的骨基質(zhì)擴(kuò)散而來(lái)，其中無(wú)血管無(wú)神經(jīng)無(wú)淋巴組織，則限制了軟骨再生［3-4］。種子細(xì)胞骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）取材方便，來(lái)源廣泛，且增殖能力強(qiáng)，具有多項(xiàng)分化潛能［5-6］。已有研究顯示，外源性誘導(dǎo)因子、物理刺激、仿生支架等技術(shù)已成功地將BMSCs誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞，表達(dá)軟骨表型或特異性軟骨標(biāo)志［7-8］。本實(shí)驗(yàn)旨在利用TGF-β3和抗整合素β1單克隆抗體，分別促進(jìn)和抑制整合素的表達(dá)，研究和探討整合素β1在大鼠BMSCs誘導(dǎo)軟骨分化的過(guò)程中的作用及其機(jī)制，以期為臨床軟骨組織的修復(fù)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康4 周齡SD 大鼠（180～200 g/只）由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)均在湘雅基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。L-DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)），胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone，美國(guó)），Dexamethasone 和VitaminC （Sigma，美國(guó)），TGF-β3（PEPROTECH，美國(guó)），F(xiàn)ITC anti-rat CD29 及同型陰性對(duì)照和FITC anti-rat CD45 及同型陰性對(duì)照（Biolegend，美國(guó)），F(xiàn)ITC anti-rat CD34 及同型陰性對(duì)照（北京博奧森），CD29 單克隆抗體（Biolegend，美國(guó)），Col-II 抗體（北京博奧森），IHC 試劑盒（武漢博士德），DAB 顯色試劑盒（Pierce，美國(guó)），甲苯胺藍(lán)染液（Sigma，美國(guó)），預(yù)染maker （#SM0671）（Fermentas，美國(guó)），變性凝膠電泳（SDS-PAGE）和半干轉(zhuǎn)印所用試劑（Sigma，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，傳至第三代首先進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD29、CD34、CD45 的表達(dá)情況，得出CD29 的陽(yáng)性率達(dá)99.0%。實(shí)驗(yàn)分三組，（1）對(duì)照組：以基礎(chǔ)培養(yǎng)液（L-DMEM+10%FBS+1%雙抗+3%谷氨酰胺）常規(guī)培養(yǎng)（5% CO2，37℃）7 d 和14 d。（2）誘導(dǎo)組：在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入TGF-β3（40 ng/mL）、地塞米松（0.1 μmol/L）、胰島素（6.25 μg/mL）、維生素C（50 μg/mL）。培養(yǎng)條件及時(shí)間同上。（3）抑制組：在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入anti-CD29 單克隆抗體（0.1 μg/mL）、地塞米松（0.1 μmol/L）、胰島素（6.25 μg/mL）、維生素C（50 μg/mL），培養(yǎng)條件及時(shí)間同上。

1.3 col-Ⅱ免疫細(xì)胞化學(xué)染色

分別取誘導(dǎo)7 d 和誘導(dǎo)14 d 的細(xì)胞，每組隨機(jī)抽取2盒。PBS 清洗，甲醛固定，H2O2+純甲醇浸泡以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗1～2次，BSA封閉液。滴加一抗（col-Ⅱ），37℃孵育1 h，PBS 清洗。滴加生物素化山羊抗鼠lgG，20～37℃孵育20 min，PBS清洗。滴加試劑SABC，20～37℃孵育20 min，PBS 清洗。DAB 顯色，蘇木素輕度復(fù)染，依次75%，95%，95%，100%，100%酒精各5 min脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4 蛋白多糖甲苯胺藍(lán)染色

取誘導(dǎo)14 d 的細(xì)胞，每組隨機(jī)抽取2 盒。PBS 清洗，10%中性甲醛固定，PBS 清洗，加甲苯胺藍(lán)染液（注意加前要把染液過(guò)濾，以去除雜質(zhì)），50 ℃下20～30 min，或者常溫下2～4 h。蒸餾水洗2次，把爬片固定在載玻片上。95%酒精分色10 s。PBS 洗2 次，封片，然后顯微鏡下觀察。

1.5 Western Blot檢測(cè)col-Ⅱ和integrin的表達(dá)

取誘導(dǎo)14 d 的細(xì)胞，每組隨機(jī)抽取2 盒。步驟分四步，（1）提取細(xì)胞蛋白（冰上操作）：用預(yù)冷的PBS 洗滌，加入細(xì)胞裂解液裂解20 min，刮取轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep 管，靜置、渦旋，使充分混勻，高速低溫離心機(jī)離心，4 ℃下14 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min。取上清液并定量取5 μL 按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行蛋白濃度定量。煮樣，-20℃保存。（2）SDS-PAGE 電泳：分別配置好分離膠與濃縮膠，蛋白樣品按每孔60 μg 上樣，電泳槽置于冰盆中（4℃環(huán)境），電壓30 伏，待蛋白跑出孔，約30 min，調(diào)電壓60 伏，待蛋白跑進(jìn)分離膠，約1～2 h。調(diào)電壓120 伏，電泳1.5～2 h。（3）半干式轉(zhuǎn)印：在轉(zhuǎn)膜槽底部陽(yáng)極的平板上從下往上依次放置濾紙（三張）-PVDF膜-凝膠-濾紙（三張），以橫流轉(zhuǎn)印25～30 min。（4）免疫顯色：轉(zhuǎn)印完畢后室溫下封閉2 h。將PVDF膜與一抗（兔抗鼠col-Ⅱ，兔抗鼠integinβ1）在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，進(jìn)行ECL 顯色，在暗室中操作，再采用Bio-1D 凝膠成像系統(tǒng)掃描顯影的膠片，并用BioCapt 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析（以平均光密度值Density 表示）。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)col-II的表達(dá)

在TGF-β3的作用下，誘導(dǎo)組II 型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示有部分細(xì)胞呈陽(yáng)性；誘導(dǎo)7 d，可見(jiàn)有軟骨細(xì)胞分化趨勢(shì)；誘導(dǎo)14 d，可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的長(zhǎng)形向?qū)挻蟊馄蕉嘟切巫兓?；?duì)照組與抑制組型膠原表達(dá)則為陰性，細(xì)胞仍為長(zhǎng)形或長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)col-II的表達(dá)

2.2 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的表達(dá)

取誘導(dǎo)14 d 的細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖，可見(jiàn)誘導(dǎo)組的大部分細(xì)胞甲苯胺藍(lán)異染性著色明顯，蛋白多糖表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖2，左圖為×100，右圖為×200。

圖2 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的表達(dá)

2.3 Western Blot檢測(cè)col-II蛋白和integrin的表達(dá)

誘導(dǎo)組細(xì)胞integrin 的表達(dá)量均較抑制組、對(duì)照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明細(xì)胞膜上的整合素受體被明顯下調(diào)，TGF-β3提高了整合素受體的表達(dá)量，見(jiàn)圖3。誘導(dǎo)組col-II 的表達(dá)量顯著高于抑制組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)照組和抑制組col-II 的表達(dá)量則無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 Western Blot 檢測(cè)integrin的表達(dá)

圖4 Western Blot 檢測(cè)col-II的表達(dá)

3 討論

多種原因?qū)е碌能浌菗p傷是臨床常見(jiàn)疾病，但軟骨組織缺乏神經(jīng)支配，痛感遲鈍，致延誤病情，缺乏血管、淋巴，致軟骨再生能力差，故易導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)行性加重［9］，隨著組織工程技術(shù)和干細(xì)胞研究的不斷深入，誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞視為目前軟骨再生修復(fù)的主要方法［10］，誘導(dǎo)因子在BMSCs定向軟骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

整合素是一個(gè)受體大家族，由α和β兩個(gè)亞單位組成，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有18 個(gè)α 亞基和8 個(gè)β 亞基，相互之間以非共價(jià)鍵結(jié)合，可以形成24 種有功能的異二聚體跨膜糖蛋白［11］，分胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分。細(xì)胞外區(qū)能結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，而胞漿區(qū)與細(xì)胞骨架相互作用介導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在BMSCs表面表達(dá)的主要整合素受體有β1、α1β1、αvβ3、α2、αL、β2、α5β1［12］，整合素介導(dǎo)的黏附作用調(diào)節(jié)著多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞分化與凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附與遷移，淋巴細(xì)胞歸巢等［13］。整合素的調(diào)節(jié)受多種因子的影響，研究最多的是TGF-β、PDGF（血小板衍化生長(zhǎng)因子）［14］，可以上調(diào)整合素的表達(dá)，而某些白細(xì)胞分泌的蛋白酶抑制物和細(xì)胞中抗腫瘤細(xì)胞增殖因子TNF（腫瘤壞死因子）、IL（白細(xì)胞介素）等以及抗整合素單克隆抗體［15］則可抑制其表達(dá)。有研究則表明：在體外用整合素抗體抑制肢芽間充質(zhì)細(xì)胞表面整合素的表達(dá)可以抑制肢芽間充質(zhì)細(xì)胞軟骨分化［16］。

TGF-β 與生長(zhǎng)分化因子（GDF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）均屬于TGF 家族，其中TGF-β、BMP 參與軟骨與骨的生成調(diào)節(jié)，而TGF-β 是體外軟骨分化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑［17］。在人體內(nèi)存在3種形式的TGF-β，分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β3誘導(dǎo)成軟骨的作用最強(qiáng)，TGF-β2次之，TGF-β1相對(duì)最弱，其誘導(dǎo)生成的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)均比TGF-β1誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的量多且時(shí)間早。TGF-β3促進(jìn)MSCs向軟骨方向分化，在5～40 ng/mL 范圍內(nèi)具有時(shí)間濃度依賴(lài)性，隨著濃度增高和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Ⅱ型膠原的產(chǎn)生逐漸增多；大于40 ng/mL 時(shí)，無(wú)明顯增多甚至減少。本實(shí)驗(yàn)采用40 ng/mL 濃度的TGF-β3來(lái)進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的軟骨方向誘導(dǎo)。

本研究用10%FBS（胎牛血清）的L-DMEM 培養(yǎng)液（40 ng/mL TGF-β3、地塞米松1×10 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL），抑制軟骨分化培養(yǎng)液（anti-CD29 單克隆抗體100 ng/mL、地塞米松1×10～7 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL），在單層培養(yǎng)條件下對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)1 周時(shí)可見(jiàn)Ⅱ型膠原表達(dá)，2 周后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的表達(dá)，提示有大量蛋白多糖的合成，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)增多，且細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的長(zhǎng)形或長(zhǎng)梭形向扁平寬大多角方向變化，呈現(xiàn)軟骨細(xì)胞表型，抑制組和對(duì)照組檢查結(jié)果一致。通過(guò)Western Blot 實(shí)驗(yàn)得到抑制組integrin 表達(dá)明顯少于誘導(dǎo)組，且?guī)缀醪槐磉_(dá)II 型膠原蛋白，與對(duì)照組結(jié)果相近，而誘導(dǎo)組能高表達(dá)integrin，同時(shí)II型膠原蛋白表達(dá)量亦明顯增多。結(jié)果表明anti-CD29 單克隆抗體能有效抑制integrin 表達(dá)水平，從而抑制軟骨形成，而TGF-β3能上調(diào)integrin的表達(dá)，促進(jìn)軟骨分化。

綜合以上結(jié)果與分析，研究成功用TGF-β3誘導(dǎo)大鼠BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化，表達(dá)軟骨細(xì)胞表型，也利用anti-CD29單克隆抗體抑制integrin表達(dá)，抑制了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻礙軟骨分化。研究明確了整合素通路可能是影響軟骨分化的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為修復(fù)軟骨缺損奠定了一定的理論基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的科學(xué)研究。