■ 袁麗紅 柳成東 肖明霞 PHOUTHAPANE Vanhnaseng 安清聰 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司，福建漳州 363000；3.老撾農(nóng)林部畜牧與水產(chǎn)局，老撾萬(wàn)象 6644）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是全球及我國(guó)畜牧業(yè)應(yīng)用最廣的飼用益生菌[1-3]，其改善畜禽生產(chǎn)性能的機(jī)制主要與菌株的抑菌性能及其調(diào)控腸道菌群的作用有關(guān)[4-7]。然而，本課題組匯總國(guó)內(nèi)外大量枯草芽孢桿菌抑菌試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，飼用枯草芽孢桿菌的菌株繁多，菌株抑菌性能的評(píng)估客觀存在“評(píng)估方法繁雜、抑菌標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、研究系統(tǒng)性不足”等問(wèn)題，致使動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)表現(xiàn)的生產(chǎn)性能產(chǎn)生差異化結(jié)果。鑒于此，文章提出了枯草芽孢桿菌體外抑菌性能評(píng)估研究的方向，以保障飼用枯草芽孢桿菌應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)的作用效果及其穩(wěn)定性。

1 枯草芽孢桿菌抑菌性能的評(píng)估方法及標(biāo)準(zhǔn)

與大多數(shù)飼用益生菌相似，枯草芽孢桿菌抑菌性能的研究主要包括體外抑菌試驗(yàn)評(píng)估（in vitrobacteriostatic evaluation）和體內(nèi)抑菌試驗(yàn)評(píng)估（in vivobacteriostatic evaluation）兩方面[8]。

1.1 體外抑菌試驗(yàn)

已用于枯草芽孢桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)的評(píng)估方法主要包括：瓊脂擴(kuò)散法（包括牛津杯法、打孔法、濾紙片法等）、最小抑菌濃度法、平板劃線法和混培法等[9-11]。其中，牛津杯法具備可定量、操作方便的優(yōu)勢(shì)[9]，因此采用該法的研究文獻(xiàn)最多。

匯總以往牛津杯法評(píng)估枯草芽孢桿菌抑菌性能的試驗(yàn)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)以下問(wèn)題：其一，體外抑菌研究的系統(tǒng)性不足。大量已報(bào)道的研究集中在枯草芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物腸道有害菌及飼料源有害菌的抑制作用，對(duì)腸道有益菌可能的抑制作用及對(duì)其他商業(yè)飼用益生菌的可能拮抗效應(yīng)基本沒(méi)有報(bào)道，這顯然不利于評(píng)估單一或復(fù)合枯草芽孢桿菌制劑在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用效果；其二：體外抑菌作用的判定標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。牛津杯法以抑菌圈直徑值(diameter of inhibition zone, DIZ)來(lái)判斷抑制作用的強(qiáng)弱，但迄今為止DIZ 判定標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。韓旭凱［12］采用的抑菌判定標(biāo)準(zhǔn)包括3個(gè)DIZ區(qū)間值：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“敏感”（8 mm＜DIZ≤20 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。Liang 等[13]采用的抑菌判定標(biāo)準(zhǔn)包括5 個(gè)DIZ 區(qū)間值：“極敏感”（DIZ＞20 mm）、“高敏感”（15 mm＜DIZ≤20 mm）、“中敏感”（10 mm＜DIZ≤15 mm）、“低敏感”（7.80 mm＜DIZ≤10 mm）和“不敏感”（DIZ=7.80 mm）。顯然，就表1 匯總的牛津杯抑菌數(shù)據(jù)，Liang等[13]抑菌判定標(biāo)準(zhǔn)更加細(xì)致。因此，文章綜述后續(xù)描述采納Liang等[13]的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 枯草芽孢桿菌體外抑菌作用[牛津杯法，抑菌圈直徑DIZ(mm)]

1.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

體內(nèi)抑菌試驗(yàn)一般通過(guò)檢測(cè)飼喂枯草芽孢桿菌制劑的畜禽腸道食糜或糞便中特定細(xì)菌的數(shù)量（包括腸道有害菌、腸道有益菌），來(lái)評(píng)估飼用枯草芽孢桿菌對(duì)腸菌群的調(diào)控效果。腸道特定細(xì)菌數(shù)量(或相對(duì)數(shù)量)的檢測(cè)方法，主要包括宏基因組測(cè)序法[1]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[3]、平板計(jì)數(shù)法等[14-15]。

1.2.1 宏基因組測(cè)序法

宏基因組測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是能從細(xì)菌分類(lèi)學(xué)角度，詳細(xì)地分析飼喂枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群“門(mén)綱目科屬種”的影響，且當(dāng)前檢測(cè)儀先進(jìn)，因此分析工作效率極高。然而，該方法的最大缺點(diǎn)是只能給出菌群豐度值，無(wú)法定量某一特定腸道菌的數(shù)量級(jí)。例如：在產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒動(dòng)物模型條件下，宏基因組測(cè)序法只能分析腸道中梭菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度，無(wú)法定量攻毒產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量級(jí)及變化[1]。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

相對(duì)宏基因組測(cè)序法難以定量腸道特定菌的數(shù)量級(jí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的優(yōu)點(diǎn)是可高效檢測(cè)腸道特定菌的數(shù)量級(jí)[3]。然而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法的明顯缺點(diǎn)是無(wú)法進(jìn)一步分析腸道總厭氧菌、總需氧菌的數(shù)量級(jí)及其之間的比例，而腸道總厭氧菌及總需氧菌數(shù)量是表征腸道菌群平衡的重要指標(biāo)之一。

1.2.3 平板計(jì)數(shù)法

平板計(jì)數(shù)法最大的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀，且能滿足對(duì)表征畜禽腸道菌群平衡狀態(tài)的總菌數(shù)、總厭氧菌、總需氧菌以及某些特定腸道細(xì)菌(大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道有害菌；乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道有益菌)的數(shù)量級(jí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)定量[14-15]。誠(chéng)然，定量計(jì)數(shù)均需特定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，因此平板計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)是分析工作效率低。

綜上分析，基于可定量的報(bào)道數(shù)據(jù)，表1 匯總了體外抑菌試驗(yàn)評(píng)估枯草芽孢桿菌的抑菌作用(牛津杯法)，表2匯總了體內(nèi)抑菌試驗(yàn)評(píng)估飼用枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群的調(diào)控作用(平板計(jì)數(shù)法)。文章重點(diǎn)闡述枯草芽孢桿菌體外抑菌作用評(píng)估，并與腸菌群調(diào)控結(jié)果相互印證。

表2 飼用枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道菌群的調(diào)控作用(菌數(shù)檢測(cè)為平板計(jì)數(shù)法)

2 枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有害菌的抑菌作用

大部分研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、梭菌等屬的致病菌的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：①生物奪氧學(xué)說(shuō)：枯草芽孢桿菌在繁殖過(guò)程中均可消耗腸道內(nèi)的氧氣，造成局部厭氧環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌的繁殖和生長(zhǎng)；②菌群屏障學(xué)說(shuō)：枯草芽孢桿菌在消化道生成致密的膜菌群，枯草芽孢桿菌能與致病菌爭(zhēng)奪生存空間、定居位點(diǎn)、繁殖空間以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)與繁殖；③抗菌物質(zhì)：枯草芽抱桿菌能夠產(chǎn)生枯草菌素和枯草桿菌素等兩種小分子細(xì)菌素；枯草芽孢桿菌分泌幾丁質(zhì)酶作用于真菌細(xì)胞壁，β-葡聚糖酶因其能水解β（1→3）糖苷鍵所以具抗真菌作用。它們可以通過(guò)完全降解病原菌細(xì)胞壁來(lái)抑制病原菌生長(zhǎng)；枯草芽孢桿菌還可以產(chǎn)生的抗菌多肽，從而對(duì)致病菌產(chǎn)生抑制作用[1，3，12]。

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

表1 匯總了18 篇枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌體外抑菌的DIZ 數(shù)據(jù)，并參考Liang 等[13]的抑菌判定標(biāo)準(zhǔn)，分析如下：①極敏感：18 篇文獻(xiàn)中的3 篇文獻(xiàn)[16-18]，包括謝曉佩等[16]發(fā)現(xiàn)三株枯草芽孢桿菌(KC5、KC6、KC7)、王琦等[17]報(bào)道的3 個(gè)菌株(Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7)、莊國(guó)宏等[18]顯示菌株GD，均對(duì)大腸桿菌的DIZ 達(dá)到20 mm 以上，有極強(qiáng)的抑制作用；②高敏感：6 篇文獻(xiàn)顯示[16-21]，枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌DIZ 范圍為15～20 mm，有良好的抑制作用；③中敏感：8篇文獻(xiàn)顯示[19，22-28]，枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌DIZ 范圍為10～15 mm，有一定的抑制作用；④低敏感：Liang 等[13]和辛娜等[28]報(bào)道2 株枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌DIZ范圍為7.8～10 mm，抑制作用偏弱；⑤不敏感：5 篇文獻(xiàn)顯示[28-32]，多株枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌DIZ 為7.8 mm，無(wú)抑制作用。以上結(jié)果提示，不同菌株的枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用有顯著差異。

表2 匯總了多篇飼用枯草芽孢桿菌對(duì)雞、豬腸道食糜或糞便大腸桿菌數(shù)量（平板計(jì)數(shù)法）影響的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。其一：肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)。齊博等[34]在雞飼糧中添加較低劑量枯草芽孢桿菌（105CFU/g）發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（基礎(chǔ)飼糧組，BD）相比，試驗(yàn)組（枯草芽孢桿菌組，PD）肉雞21 日齡和42 日齡的盲腸食糜大腸桿菌數(shù)量未顯著降低。袁文菊等[37]和Jeong 等[15]研究顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組添加中劑量（106CFU/g）、高劑量（107CFU/g）枯草芽孢桿菌顯著降低了盲腸大腸桿菌數(shù)量、未降低回腸大腸桿菌數(shù)量。此外，更多試驗(yàn)顯示[14，35-36]，飼用枯草芽孢桿菌同時(shí)顯著降低了盲腸和回腸的大腸桿菌數(shù)量。其二，豬飼養(yǎng)試驗(yàn)。楊陽(yáng)等[38]在飼糧中添加枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組豬盲腸和結(jié)腸食糜大腸桿菌數(shù)量顯著降低，但對(duì)回腸食糜大腸桿菌無(wú)顯著影響。Guo等[41]報(bào)道，飼用枯草芽孢桿菌顯著降低豬糞便大腸桿菌數(shù)量。然而，更多的豬飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，飼用枯草芽孢桿菌對(duì)腸道食糜及糞便大腸桿菌數(shù)量無(wú)顯著影響[42-44]。

以上分析提示，除試驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、枯草芽孢桿菌添加量、取樣部位等因素，菌株抑菌作用的巨大差異可能是影響腸道大腸桿菌調(diào)控效果的關(guān)鍵，這顯然會(huì)對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生重要影響。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌作用

表1匯總了8篇枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌體外抑菌的DIZ 數(shù)據(jù)，參考Liang 等[13]的抑菌判定標(biāo)準(zhǔn)，分析如下：①高敏感：8篇文獻(xiàn)中的4篇文獻(xiàn)[18-20，22]，包括李善仁等[20]報(bào)道的兩株枯草芽孢桿菌CS16 和CS21、盧冰霞等[22]發(fā)現(xiàn)的菌株Y1、陳亮等[19]研究的菌株B332、莊國(guó)宏等[18]報(bào)道的菌株GD，均對(duì)沙門(mén)氏菌屬致病菌有良好的抑制作用；②中敏感：3 篇文獻(xiàn)顯示[18，20，24]，枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌有一定的抑制作用；③不敏感：2 篇文獻(xiàn)顯示[29，32]，多株枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌無(wú)抑制作用。以上數(shù)據(jù)表明，不同菌株的枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用有顯著差異。

大量的肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示（表2），飼糧中添加106～107CFU/g 枯草芽孢桿菌顯著降低了肉雞腸道食糜中沙門(mén)氏菌的總菌數(shù)[14-15，35]。然而，邢帥兵等[40]在仔豬上的試驗(yàn)卻顯示，枯草芽孢桿菌對(duì)腸道食糜沙門(mén)氏菌數(shù)量無(wú)顯著影響。盡管仔豬試驗(yàn)很少測(cè)定腸道沙門(mén)氏菌，但這一結(jié)果似乎提示，飼用枯草芽孢桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用在家禽腸道比生豬腸道的效果更突出。誠(chéng)然，這一推測(cè)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用

包括產(chǎn)氣莢膜梭菌在內(nèi)的多種致病梭菌誘發(fā)動(dòng)物壞死性腸炎，其發(fā)病率較大腸桿菌、沙門(mén)氏菌低，且隱性病癥不易發(fā)覺(jué)，易被養(yǎng)殖管理者忽視[44-45]。表1匯總了3 篇枯草芽孢桿菌抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外牛津杯試驗(yàn)文獻(xiàn)。陽(yáng)艷林等[33]研究了7株枯草芽孢桿菌，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌PB6(克洛生)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制作用達(dá)極敏感，另外2 株為高敏感、1 株為中敏感、3 株為不敏感。辛娜等[28]評(píng)估了6 株枯草芽孢桿菌，結(jié)果顯示2株為中敏感、1株為低敏感、3株為不敏感。魏可健等[31]證明枯草芽孢桿菌C3 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)抑制作用。

上述研究表明，大部分枯草芽孢桿菌無(wú)法高效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌，這得到了體內(nèi)試驗(yàn)的印證(表2)。袁文菊等[37]在肉雞飼糧中添加3.0×106CFU/g 枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)可顯著降低盲腸食糜梭菌數(shù)量、但無(wú)法降低回腸食糜梭菌數(shù)量；而且，他們的另一試驗(yàn)組枯草芽孢桿菌添加量略微降至1.5×106CFU/g，則同時(shí)無(wú)法降低盲腸和回腸的梭菌數(shù)量。Jeong 等[15]在飼糧中添加更高劑量（3.0×107CFU/g）枯草芽孢桿菌，無(wú)法降低肉雞盲腸和回腸的梭菌數(shù)量。

3 枯草芽孢桿菌對(duì)飼料源有害菌的抑菌作用

金黃色葡萄球菌是飼料源主要致病細(xì)菌之一[44]，枯草芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌抑制研究較多，14篇報(bào)道的DIZ數(shù)據(jù)顯示（表1）：①極敏感：14篇文獻(xiàn)中的5 篇文獻(xiàn)[16-18，20，29]，包括謝曉佩等[16]發(fā)現(xiàn)3 株枯草芽孢桿菌（KC5、KC6、KC7）、王琦等[17]報(bào)道的3 個(gè)菌株（Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7）、莊國(guó)宏等[18]研究的4 個(gè)菌株（GD、WT、POC-4、SF-1）、齊鵬飛等[29]顯示的菌株LV-1 和LV-2、李善仁等[20]研究的3 個(gè)菌株（CS16、CS21、CS27），均對(duì)金黃色葡萄球菌有極強(qiáng)抑制作用；②高敏感：3 篇文獻(xiàn)顯示[16-17，21]，枯草芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用；③中敏感：8 篇 文 獻(xiàn) 顯 示[22-27，30，32]，枯 草 芽 孢 桿 菌 對(duì) 金 黃 色 葡萄球菌有一定的抑制作用；④低敏感：僅有1 篇文獻(xiàn)顯示[29]，枯草芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用偏弱。

以上數(shù)據(jù)提示，不同菌株的枯草芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用有顯著差異。由于廣譜抗生素能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌[44-45]，以往飼用抗生素的應(yīng)用掩蓋了飼料源金黃色葡萄球菌感染腸道的風(fēng)險(xiǎn)，但當(dāng)前“禁抗”形式下須重新審視及解決這一問(wèn)題。例如，通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)篩選強(qiáng)效抑制金黃色葡萄球菌的枯草芽孢桿菌菌株，并應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。

4 枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有益菌的抑制作用

眾所周知，廣譜飼用抗生素抑制乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道有益菌，破壞畜禽腸菌群平衡[44，47]。然而，包括枯草芽孢桿菌在內(nèi)的飼用益生菌對(duì)腸道有益菌的體外抑制作用卻鮮有報(bào)道[44-47]。李先磊等[11]采用體外混培試驗(yàn)顯示，枯草芽孢桿菌HnB-4對(duì)乳酸桿菌HnL-3無(wú)抑制作用。相反，李在建等[48]的體外混培試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌對(duì)乳酸桿菌(菌株編號(hào)CICC6075)有顯著的抑制作用。以上不同的結(jié)果提示，枯草芽孢桿菌對(duì)腸道有益菌可能的抑制作用需重新認(rèn)識(shí)。

表2 肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，飼用枯草芽孢桿菌顯著增加肉雞腸道食糜乳酸桿菌數(shù)量，但對(duì)雙歧桿菌無(wú)明顯影響。豬飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，飼用枯草芽孢桿菌顯著增加盲腸和結(jié)腸食糜乳酸桿菌數(shù)量[38，40]；相反，也有文獻(xiàn)報(bào)道飼用枯草芽孢桿菌未顯著增加腸道及糞便的乳酸桿菌數(shù)量[42，44]；此外，枯草芽孢桿菌對(duì)豬腸道食糜及糞便的雙歧桿菌無(wú)明顯影響[42]。結(jié)合上述體外抑菌試驗(yàn)報(bào)道，腸道菌群差異化的表現(xiàn)提示，飼用枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道有益菌的影響需進(jìn)一步明晰。

5 枯草芽孢桿菌對(duì)商業(yè)飼用益生菌的抑菌作用

當(dāng)前，我國(guó)《飼料添加劑品種目錄(2013)》中應(yīng)用較為廣泛的飼用益生菌包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、丁酸梭菌、糞腸球菌、屎腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌等7 種[46]。飼料禁抗形勢(shì)下，由于畜禽養(yǎng)殖問(wèn)題和需求的多樣性，基于不同益生菌差異化的益生性能，催生了復(fù)合飼用益生菌制劑的普遍使用。然而，課題組前期綜述及多個(gè)體外抑菌試驗(yàn)均表明，益生菌之間存在拮抗效應(yīng)[43，46，49]。

枯草芽孢桿菌對(duì)其他商業(yè)益生菌抑制作用的研究極少（表1），僅有的一篇報(bào)道顯示4 株枯草芽孢桿菌（菌株編號(hào)：SF-1、WT、POC-4、GD）對(duì)酵母菌均有極強(qiáng)的抑制作用，且抑制效果有明顯差異[18]。這一體外試驗(yàn)結(jié)果得到了李玲茜等[6]動(dòng)物試驗(yàn)的印證。李玲茜等[6]通過(guò)雞飼養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單一枯草芽孢桿菌組相比，組合應(yīng)用枯草芽孢桿菌和酵母菌組肉雞的增重、采食量及料重比均無(wú)明顯改善。此外，課題組前期體外抑菌試驗(yàn)[43，46，49]、動(dòng)物試驗(yàn)[4-5]均表明，枯草芽孢桿菌與凝結(jié)芽孢桿菌、丁酸梭菌之間均存在拮抗效應(yīng)。

6 小結(jié)

基于抑菌性能是飼用枯草芽孢桿菌改善畜禽生產(chǎn)性能的重要機(jī)制之一，建議完善枯草芽孢桿菌體外抑菌試驗(yàn)的評(píng)估方法及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，尤其要重視枯草芽孢桿菌對(duì)腸道有益菌和其他商業(yè)益生菌可能的抑制作用及拮抗效應(yīng)的評(píng)估，這有助于篩選安全的菌株及高效地研制單一和復(fù)合飼用枯草芽孢桿菌制劑，為保障畜禽生產(chǎn)性能奠定科學(xué)基礎(chǔ)。