■ 蔣 湘 林文蔚 許樂樂 梁金榮 葉海琴 陳道海 王鋰韞*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江 524048；2.廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術研究中心，廣東湛江 524048）

鹵蟲（Artemia salina）是魚、蝦、蟹苗種培育過程 中廣泛使用的一種高蛋白活性餌料，也是水生毒理學常用的實驗動物，鹵蟲卵與鹵蟲具有很高的經(jīng)濟價值與科研價值[1]。我國鹵蟲天然資源豐富，主要分布在渤海灣鹽田及西北部的青海、新疆、西藏等高原和鹽湖地區(qū)，但其應用開發(fā)起步晚，直到20世紀80年代中期開始鹵蟲的增、養(yǎng)殖試驗，國內(nèi)鹵蟲養(yǎng)殖采用室外灘涂、鹽田鹽湖等大面積粗放型養(yǎng)殖模式，受天氣等影響較大，產(chǎn)量低且不穩(wěn)定，鹵蟲資源不能滿足日益增長的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的需求[2-3]。因此鹵蟲的養(yǎng)殖需由捕撈向養(yǎng)殖、粗放養(yǎng)殖模式向工廠化養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變[4]。羅國芝等[5]利用循環(huán)水系統(tǒng)中過濾的固體廢棄物培養(yǎng)成生物絮凝液用于鹵蟲的養(yǎng)殖與營養(yǎng)強化研究。王振華等[6]、劉文御[7]研究表明在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中pH會因為養(yǎng)殖動物所排放的CO2以及附著池底濾料上硝化細菌的硝化反應而導致水質(zhì)酸化，pH 降低。低至一定程度的pH 會對水生動物生長發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。研究鹵蟲幼體對低pH 的耐受性對開展循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖有一定的指導價值。

pH 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中很關鍵的一個水質(zhì)參數(shù)，直接對水生動物的代謝機能產(chǎn)生影響。陶易凡等[8]研究表明pH 脅迫影響甲殼動物的肝胰腺正常分泌與代謝活動，引起肝胰腺功能紊亂；間接對水體中氨氮、亞硝酸鹽以及Zn2+、Cd2+等的毒性產(chǎn)生顯著影響[9-11]，國內(nèi)外學者開展關于pH 脅迫對凡納繽對蝦（Litopenaeusvannamei）死亡率與抗氧化酶基因表達[12-13]、pH 對巴西境內(nèi)兩種蝦的幼體生長和發(fā)育的亞致死效應[14]、凡納繽對蝦（Litopenaeusvannamei）的免疫因子[15]等研究。從水生動物毒理學方向，以pH 為主要環(huán)境因子對水生動物的急性毒性研究的報告主要集中在對蝦類。梁彩鳳等[16]通過靜水試驗法研究低pH 對日本囊對蝦（M.japonicas）的急性毒性，分析48、72、96 h半致死pH與pH 4.1、4.4、4.7 的半致死時間；楊富億等[17]研究日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense）幼蝦對堿度和pH的適應性，計算不同時間的半致死pH 與安全pH；么宗利等[18]采用靜態(tài)急性毒理學方法，研究碳酸鹽堿度和pH 對凡納濱對蝦（L.vannamei）仔蝦存活率的影響；王志飛等[19]、白秀娟等[20]等通過急性毒性方法研究pH對秀麗高原鰍（Triplophysa venusta）與文昌魚（Branchiostomabelcheri）幼魚急性毒性效應；而關于pH 對鹵蟲幼體的急性毒性研究鮮有報道，僅見潘正軍[21]、楊承忠等[22]關于pH 對鹵蟲卵孵化率的影響，Blust 等[23]研究的在不同pH 條件下鹵蟲對銅離子的生物利用率的研究；馬婷等[24-25]研究pH 對鹵蟲無節(jié)幼體生長，體脂肪酸，抗氧化指標的影響等。本研究以孵后72 h的鹵蟲無節(jié)幼體為研究對象，通過半靜水毒性試驗法開展不同pH 梯度的急性毒性與同一pH 下的毒性時間研究，估算安全pH 及95%置信區(qū)間和半致死毒性時間，為循環(huán)水養(yǎng)殖條件下水質(zhì)酸化對鹵蟲養(yǎng)殖及低pH 的耐受性研究和其他海水增養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)管理提供相關參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

實驗所用鹵蟲休眠卵為湛江海神生物科技發(fā)展有限公司提供，經(jīng)實驗觀察確定為孤雌生殖鹵蟲（Artemia parthenogeneticaof Tianjin），稱取鹵蟲休眠卵1 g 于5 000 mL燒杯中，加入經(jīng)處理后循環(huán)的海水2 000 mL，全程充氧于2 000 lx 光強度下孵化28 h，調(diào)節(jié)氧量至鹵蟲卵浮于水中即可，實驗開始前檢測循環(huán)水的理化因子：pH7.8、溶解氧7.99 mg/L、溫度26.7 ℃、鹽度26.9、亞硝酸鹽4.70 μg/L、氨氮5.94 mg/L。實驗所用無節(jié)幼體為孵化后72 h 的鹵蟲幼體。實驗容器為直徑11 cm、高3 cm 圓柱形食品級塑料容器，有效水體200 mL。實驗開始前配置0.1mol/L HCl 溶液 與0.1 mol/L NaOH 溶液 各1 000 mL，通 過pH 計(臺灣衡欣pH 測試筆AZ8693）檢測海水pH。pH 調(diào)節(jié)方法：取1 000 mL 新鮮海水，計算出大約所需HCI溶液體積，通過往水中滴加HCl 溶液降低pH，邊加邊攪拌，當接近所需pH 附近時，逐漸減少滴加量，直到pH 變化值不超過0.1，調(diào)節(jié)完成。實驗過程中不充氣，可適當少量投喂餌料，包括蝦片、螺旋藻混合液，每隔一定時間檢測溶液pH，并換新鮮的實驗液保持pH 穩(wěn)定。

1.2 實驗設計

預實驗按水生動物毒理學試驗方法開展[26-27]，通過查閱文獻資料設置pH 分別為3、4、5、6、7、8，共6 個實驗組，每個梯度2個重復組，每組放鹵蟲幼體30只，進行48 h急性毒性實驗，找到鹵蟲的24 h全死亡最高pH 和48 h 全存活最低pH。死亡鹵蟲幼體判斷標準為：幼體沉于底部，碰觸附肢10 s不動。

正式實驗：根據(jù)預實驗結果設置pH 分別為4、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、8.0，共7 個實驗組，其中pH8.0 為對照組，每個實驗組設置3 個重復組，每個實驗組隨機挑選活力正常的鹵蟲幼體30 只進行實驗，于實驗開始后6、12、24、48 h觀察幼蟲的活動狀態(tài)，統(tǒng)計死亡幼體數(shù)量并用吸管吸出死亡幼體，統(tǒng)計所有實驗組的死亡數(shù)量平均值。在開展不同pH 對鹵蟲急性毒性實驗同時，對pH 為4.8、5.2、5.6、6.0 的實驗組開展半致死毒性時間的實驗，觀察鹵蟲在4 種不同低pH 溶液中的耐受性，實驗持續(xù)時間為192 h，每天記錄實驗組的存活情況，檢測溶液的pH，更換新鮮等pH 的海水，并滴加適當餌料混合液，吸出死亡個體做好記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，Probit 回歸法建立概率單位-pH 或?qū)嶒灂r間的回歸方程，對回歸參數(shù)檢驗采用Z-Test，通過Pearson's chi-squared test 檢驗回歸方程的擬合效果，繪制出pH 與概率單位的散點圖并添加回歸直線，以估算半致死pH、半致死毒性時間及95%置信區(qū)間，實驗中對照組出現(xiàn)死亡的數(shù)據(jù)校正方法根據(jù)公式校正[27]。

式中：p'——觀察死亡百分數(shù)；

c——對照死亡百分數(shù)；p——校正后的死亡百分數(shù)。

2 結果與分析

2.1 pH對鹵蟲毒性實驗結果

由圖1 所示，實驗范圍內(nèi)隨著pH 升高死亡數(shù)量減少。結果得到：pH4.0、4.4 實驗組在6 h 絕大部分個體死亡，pH4.8及以上的組大部分個體游動正常；24 h時pH4.8、5.2 大部分平行組個體活力較差，表現(xiàn)為游動速率變小，附肢擺動頻率減慢，部分個體沉在容器底部擺動附肢直至死亡，死亡個體體色較深；pH5.6、6.0 有少量死亡個體；48 h 時，pH5.6、6.0 死亡數(shù)量增加但并未過半，通過對24 h與48 h死亡個體數(shù)量進行配對樣本t檢驗發(fā)現(xiàn)2 個時間點的死亡數(shù)量有極顯著差異（P＜0.01），對照組pH8.0 有1 個死亡個體；pH4.8～6.0實驗組的半致死毒性時間研究結果如圖2所示，相同pH 下，隨著毒性時間延長死亡數(shù)量增加，死亡速率前期快后期慢，從死亡數(shù)據(jù)得出pH4.8、5.2全死亡時間分別為96、120 h；pH5.6、6.0 過半死亡時間分別為96、120 h，直到192 h時的死亡數(shù)量分別為：（28.00±1.00）、（22.67±3.51）個。GLM 分析結果得到pH 與實驗時間及其交互效應對死亡數(shù)量均有極顯著影響（P＜0.01）。

圖1 不同pH值對鹵蟲幼體的毒性實驗結果

圖2 急性毒性實驗時間對鹵蟲死亡數(shù)量影響

2.2 死亡率隨pH變化的擬合曲線

由圖3 所示，線1、2 為24 h 觀測與期望死亡率，線3、4 為48 h 觀測與期望死亡率曲線，擬合曲線隨濃度變化先呈逐漸遞減趨勢而后平穩(wěn)，近似反S 曲線，Probit 非線性回歸通過利用累積標準正態(tài)分布函數(shù)來擬合濃度對數(shù)-死亡率變化，24、48 h 的觀測值與期望值曲線相互交錯，一致延伸，說明擬合效果較好。24、48 h 期望值與觀測值的卡方檢驗結果分別為：x24h2=8.918，x48h2=1.632；P=0.112，P=0.897，期望值與觀測值無統(tǒng)計學上顯著差異。利用概率單位Probit 轉(zhuǎn)換，將期望概率（0，1）值轉(zhuǎn)換為在實數(shù)范圍概率單位值，由此得到概率單位值-濃度對數(shù)回歸曲線，估算pH 對鹵蟲無節(jié)幼體的24、48 h 的半致死濃度。

圖3 死亡率隨pH暴露濃度變化的擬合曲線

2.3 概率單位回歸分析結果

pH 對鹵蟲急性毒性及半致死毒性時間的概率單位法分析結果如表1、表2、表3 所示，從表1 中得到不同pH 與不同實驗時間的回歸直線及其參數(shù)估計值、參數(shù)估計標準誤、參數(shù)顯著性檢驗、95%置信區(qū)間等。所有參數(shù)檢驗均達到極顯著性水平（P＜0.01）。表2中顯示pH 與實驗時間的概率回歸擬合度卡方檢驗表，卡方值均大于0.05，表明回歸直線能較好的擬合實驗數(shù)據(jù)，觀測值與期望值差異控制在可接受的范圍內(nèi)，回歸方程可信度高。pH 的半致死量估計值與置信區(qū)間如表3 所示，24、48 h 的半致死pH 及95%置信區(qū)間分別為：5.031（4.791～5.261）、5.345（5.227～5.467），安全pH 為6.50；對應H+摩爾濃度分別為：9.311×10-6、4.519×10-6、3.192×10-7mol/L。在pH 不低于6.50 的水體中養(yǎng)殖鹵蟲是最低的水質(zhì)標準。不同pH 條件下的半致死時間分析結果得到：pH4.8 的半致死時間為22.275（14.286～28.928） h、pH5.2 的 半 致 死 時 間 為44.986（33.079～55.288） h、pH5.6 的 半 致 死 時 間 為89.813（79.244～100.231） h、pH6.0 的半致死時間為131.971（119.987～145.860） h。

表1 不同pH與實驗時間的概率單位回歸參數(shù)及置信區(qū)間估計

表2 pH與實驗時間的概率回歸擬合度卡方檢驗

表3 半致死量估計值與置信區(qū)間

3 討論

3.1 低pH對鹵蟲幼體生長與發(fā)育的影響

pH 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一個關鍵的水質(zhì)參數(shù)，通常認為水產(chǎn)養(yǎng)殖的適宜水體為弱堿性水質(zhì)，過低的pH會直接影響到養(yǎng)殖動物生長發(fā)育與繁殖，甚至引起大量死亡[28]。Blust等[23]在研究不同pH 條件下鹵蟲對銅離子的生物利用率，設置2 個的pH 范圍分別為5.37～6.62、6.78～8.34，結果得到5.37～6.62 的實驗組鹵蟲對銅離子利用率顯著低于6.78～8.34 的實驗組；生長方面的實驗表明，低pH 會影響到鹵蟲對銅離子的生物利用率。潘正軍等[21]研究pH6.0～10.0 范圍內(nèi)對西藏大紅卵孵化率的影響，結果得到pH6.0 的實驗組孵化率顯著低于pH8.0孵化率的影響，pH7.0與pH8.0的孵化率無顯著差異；Sui等[29]研究4個pH 水平（5、6、7、8）對渤海灣鹵蟲、舊金山鹵蟲與越南人工培育鹵蟲三個產(chǎn)地鹵蟲的孵化率、存活率與繁殖性能的影響，結果得到當pH 為5 時，孵化率顯著低于pH8 組，無節(jié)幼體48 h 存活率為0，并且3 個品系的鹵蟲均無法正常繁殖；相同的實驗時間pH7、pH8的存活率顯著高于pH6組；楊承忠等[22]以巴里坤湖鹵蟲為研究對象，結果表明pH5 組不能孵化，pH6 組無節(jié)幼體存活率顯著低pH7、pH8 組。本研究結果得到24、48 h 半致死pH 分別為5.031、5.345，安全pH 為6.50，與Blust 等[23]研究所確定適宜與非適宜pH 范圍基本上相符，在高于pH6.5（pH6.78～8.34）的海水中，更有利于鹵蟲對銅離子的生物利用；Bsua 等[30]研究證實在pH6.3 以下的海水中鹵蟲卵的呼吸受抑制進入無氧休眠狀態(tài)，潘正軍等[21]、楊承忠等[22]與Sui 等[29]研究得到低于pH6 實驗組的孵化率顯著降低或不能孵化。楊承忠等[22]、Sui 等[29]研究都得到pH7、8 組的存活率顯著高于pH6組，林小濤等[31]研究證明：當水體pH 低于或高于某一范圍時，甲殼動物的呼吸運動受抑制，耗氧率降低。所以在低于pH6.5 的海水中，鹵蟲幼體會受到pH 的毒性作用導致呼吸受抑制，存活率偏低，這與本研究的結論基本一致。

3.2 鹵蟲幼體對低pH的耐受性及半致死時間

Han 等[32]研究表明，低pH 會破壞水生動物體內(nèi)血液酸堿平衡，從而導致有效載氧量減少，引起缺氧，尤其明顯減緩甲殼類動物的礦化作用。從水生動物毒理學方向開展pH 對鹵蟲毒性研究報告較少，但對其它種類的甲殼動物如對蝦的研究較多。梁彩鳳等[16]研究pH 對日本囊對蝦（M.japonicus）急性毒性，得到安全pH 為5.435；陶易凡等[8]研究得到克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）的安全pH 為4.675；楊富億等[17]通過急性毒性法得到日本沼蝦幼蝦的安全pH 范圍為5.26～8.67；Furtado 等[33]得到凡納繽對蝦（L.vannamei）對蝦幼體的安全pH 為5.04；于天基等[34]研究脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）的安全pH為5.78。而本研究得到鹵蟲幼體的安全pH 為6.50，高于以上所有研究得到的安全pH，鹵蟲對低pH 的耐受性明顯低于對蝦類，猜測這是鹵蟲與對蝦的生理結構復雜程度及逆境調(diào)控機制差異導致。我國海水漁業(yè)水質(zhì)標準GB 11607—1989 所規(guī)定的pH 指標7.0～8.5，因此鹵蟲幼體對低pH 敏感性對循環(huán)水條件下鹵蟲養(yǎng)殖及水質(zhì)管理提供一定的參考價值。

半致死時間是研究水生動物在極端環(huán)境因子中耐受程度的一個關鍵指標[35]。梁彩鳳等[16]研究得到日本囊對蝦在pH4.1、4.4、4.7 條件下的半致死時間分別為58.281、93.771、139.549 h；李春濤等[36]研究pH 對離體新棘衣棘頭蟲（Neosentiscelatus）的毒性，在pH4、5、6、7、8 條件下的半致死時間分別為4.2、18.5、3.8、2.8、2.1 h；高煥等[37]研究逆境環(huán)境條件對三疣梭子蟹幼蟹(Portunustrituberculatus)致死效應，設置pH6.0、6.5、9.0、9.5，結果表明幼蟹的半致死時間為0.09～15 h，堿性條件下存活時間要長于酸性條件下，以上研究可以反映水生動物對不同pH 的耐受性，尚未見到關于pH 對鹵蟲的半致死時間的研究報道，本研究得到pH4.8、5.2、5.6、6.0 下的半致死時間分別為22.275、44.986、89.813、131.971 h，從半致死時間可以推出鹵蟲對低pH 耐受性要低于日本囊對蝦，高于新棘衣棘頭蟲、三疣梭子蟹幼蟹，隨著pH 的升高，半致死時間逐漸變長，pH 對鹵蟲幼體的毒性在減弱。本研究為開展鹵蟲耐低pH 品系選擇及亞甲殼動物的抗逆性研究提供參考數(shù)據(jù)與方法。另外統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)不同pH下的24、48 h 的死亡數(shù)量有顯著差異，但是GLM 分析得到在實驗后期144、168、192 h三個時間點的死亡數(shù)量無顯著差異，實驗過程中更換試劑液以保持pH 穩(wěn)定，猜測pH的毒性效應集中前48 h內(nèi)，而在實驗后期鹵蟲對pH 產(chǎn)生了一定的適應性，因而死亡速率變慢，其應對的調(diào)節(jié)機制尚不清楚有待進一步研究。