■ 李少璁 侯文玉 王一凡 李士玟 張慧玲 侯啟瑞 趙衛(wèi)國

（江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212100）

桑樹（Morus alba）的葉子具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，被稱為“天然的植物營養(yǎng)庫”，主要營養(yǎng)成分高于一般牧草，消化率達(dá)80%～95%，是一種理想的動物飼料資源。研究顯示，桑葉可以改善動物生長性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)，提高機(jī)體免疫功能和抗氧化能力。但桑葉添加量過高時(shí)則會影響飼糧養(yǎng)分的消化，從而降低動物的采食量和生長性能[1-2]。Hou 等[3]研究認(rèn)為，桑葉添加量不能過高可能與其含有較多的酚酸、黃酮和生物堿等生物活性物質(zhì)有關(guān)。1-脫氧野尻霉素（DNJ）是桑樹中高度富集的一種多羥基哌啶生物堿，在桑葉中含量最高可達(dá)0.791 1%[4]?，F(xiàn)代藥理研究證明，DNJ 對小腸中的α-葡糖苷酶活性具有強(qiáng)競爭性抑制，能夠降低人體空腹血糖和餐后血糖峰值，降低與脂代謝相關(guān)的酶活性，減少脂肪酸受體蛋白CD36 和脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的mRNA 表達(dá)量，因此具有降血糖、降血脂的功效[5]。另外，桑葉DNJ 還具有抗菌、抗氧化和抑制癌細(xì)胞生長等作用[6]。由于DNJ 在桑葉中含量較高，動物采食桑葉的同時(shí)也增加了DNJ 的攝入量，因此，近年已有學(xué)者開始關(guān)注其對動物營養(yǎng)代謝和畜產(chǎn)品品質(zhì)的影響[7-8]。

本課題組前期研究了日糧添加0.4 g/kg和2.0 g/kg DNJ 對新西蘭白兔生長性能、屠宰性能和肉品質(zhì)的影響[9]，以桑葉DNJ 平均含量0.26%計(jì)算[4]，相當(dāng)于兔日糧添加桑葉15%和75%，遠(yuǎn)高于桑葉的正常使用量（≤10%）[10]，不能反映桑葉正常飼喂量下DNJ 的作用。因此，本試驗(yàn)設(shè)定日糧中DNJ的添加量為0.14 g/kg 和0.28 g/kg，相當(dāng)于添加桑葉5.4%和10.8%，以研究正常桑葉飼喂量下DNJ對動物生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、肉品質(zhì)、肌肉脂肪酸組成和抗氧化性能的影響，為科學(xué)利用桑葉飼料資源提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉DNJ 購自上海中藥對照品實(shí)驗(yàn)耗材中心，HPLC 檢測DNJ 含量 ≥ 98%；新西蘭白兔來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)兔場。

1.2 試驗(yàn)方法

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取36只45日齡平均體重為（1.05±0.04） kg 的健康新西蘭白兔（公）隨機(jī)分為3 組，每組12 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，L-DNJ 組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.14 g/kg DNJ，H-DNJ 組飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.28 g/kg DNJ?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧混合均勻后制備成直徑6 mm、長1 cm的圓柱形顆粒。預(yù)試期14 d，正試期28 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

試驗(yàn)前，對兔舍和兔籠進(jìn)行清潔消毒，按照常規(guī)程序免疫，兔舍自然通風(fēng)和光照。試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，每天定時(shí)飼喂、補(bǔ)水各兩次（08：00、17：00），自由采食和飲水。

1.3 測定指標(biāo)與檢測方法

1.3.1 生長性能

正試期第1天和試驗(yàn)結(jié)束第2天早上對試驗(yàn)兔空腹稱重1 次，并計(jì)算每只兔的平均日增重（ADG）。每日飼喂前清理收集剩料并稱重，并計(jì)算每只兔的平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

ADG（g）=（末期體重-初始體重）/試驗(yàn)天數(shù)

ADFI（g）=總采食量/試驗(yàn)天數(shù)

F/G=ADFI/ADG

1.3.2 養(yǎng)分表觀消化率

于試驗(yàn)第14 天每組隨機(jī)挑選8 只體重相近的試驗(yàn)兔轉(zhuǎn)移至代謝籠中進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。消化代謝試驗(yàn)采用全收糞法，連續(xù)3 d 收集試驗(yàn)兔的全部糞樣，并參照張麗英[11]方法測定飼糧和糞樣中各養(yǎng)分含量。

某養(yǎng)分表觀消化率（%）=（飼糧中該養(yǎng)分含量-糞中該養(yǎng)分含量）/飼糧中該養(yǎng)分含量×100。

1.3.3 肉品質(zhì)

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天晚上禁食（不禁水），第2 天早上稱重后每組選體重相近的8 只試驗(yàn)兔屠宰。采集兔的背最長肌，用具有自動溫度補(bǔ)償功能的pH 計(jì)（Bante221，上海班特儀器有限公司）在背最長肌的前、中、后三個(gè)部位測量pH（pH45min），室溫放置24 h后 再 次 測 定（pH24h），計(jì) 算24 h 肌 肉pH 下 降 值（pH24h下降）。pH 為3 次讀數(shù)的平均值。肉色[亮度（L*），紅度（a*），黃度（b*）]使用TC-PⅡG 自動色差計(jì)（北京奧依克光電儀器有限公司）在肌肉表面進(jìn)行檢測，根據(jù)CIE 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢測光源為D65，8 mm 直徑測量面積，在每個(gè)檢測點(diǎn)測量3次取平均值。

稱取肉樣約20 g（記為M1）用細(xì)線吊起，外套塑料袋，袋口系緊，內(nèi)留足夠空間接納肉樣滲出的水滴，懸掛于4 ℃冰箱24 h。取出后用吸水紙吸取表面水分后稱重（記為M2）。每只兔子測3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。

滴水損失（%）=（M1-M2）/M1×100

另取肉樣修剪成1 cm×1 cm×2.5 cm 的肉條，用TMS-PRO 質(zhì)構(gòu)儀（美國FTC 公司）以垂直于肌纖維的方向測定剪切力，測量3次，結(jié)果取平均值。

肌肉中水分、粗蛋白和粗脂肪含量按照張麗英[11]方法進(jìn)行檢測。

1.3.4 肌肉脂肪酸組成

取10 g 肉樣粉碎，冷凍干燥后提取總脂肪，并使用三氟化硼、己烷和甲醇混合物[35：20：45（v/v/v）]將其轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，然后用配有60 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細(xì)管柱的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC/MS（型號7890-5975，安捷倫科技公司）測定脂肪酸組成和含量。氣相色譜條件設(shè)置為：進(jìn)樣器溫度220 ℃，檢測器溫度275 ℃；初始柱室溫度為140 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min 的速度提高到240 ℃，在240 ℃保持15 min。最后，用火焰電離檢測器測定脂肪酸。電離能為70 eV，離子源溫度為200 ℃，掃描范圍50～500 m/z。將色譜圖中各峰的保留時(shí)間與37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（B25881，上海源業(yè)生物技術(shù)有限公司）的保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定各峰的性質(zhì)。每個(gè)樣品測量三次，取平均值。

1.3.5 肌肉抗氧化性能

取肌肉組織約5 g，在0～4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干后稱重。按9：1 的比例將肌肉組織與0～4 ℃預(yù)冷的勻漿緩沖液在冰水浴中充分混合勻漿，制成10%質(zhì)量濃度的肌肉組織勻漿液。勻漿緩沖液含0.01 mol/L 蔗糖、0.14 mol/L NaCl、0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L Na2EDTA，pH 7.4。用試劑盒檢測組織懸液的總蛋白含量和丙二醛（MDA）含量，檢測方法為比色法。在測定總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性前將勻漿懸液3 000 r/min 離心15 min，取上清使用有關(guān)試劑盒測定酶活性。試劑盒均來自南京建成生物工程研究所有限公司，操作方法遵循試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Microsoft Excel 初步處理，然后用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉DNJ對兔生長性能的影響

從表2 可以看出，與對照組相比，其余兩組新西蘭白兔平均日采食量和料重比有降低的趨勢，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。H-DNJ 組兔平均日增重顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 桑葉DNJ對新西蘭白兔生長性能的影響

2.2 桑葉DNJ對兔養(yǎng)分表觀消化率的影響

如表3 所示，與對照組相比，H-DNJ 組兔對干物質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率顯著降低（P＜0.05），對粗蛋白的表觀消化率顯著提高（P＜0.05）；各處理組間兔對粗灰分、粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的表觀消化率無顯著影響（P＞0.05）。

表3 桑葉DNJ對新西蘭白兔養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

2.3 桑葉DNJ對兔肉品質(zhì)的影響

由表4 可知，與對照組相比，L-DNJ 組和H-DNJ組兔肉紅度(a*）顯著提高（P＜0.05），兔肉中粗脂肪含量顯著降低（P＜0.05）；H-DNJ 組兔肉亮度(L*）顯著降低（P＜0.05）；L-DNJ 組和H-DNJ 組兔肉pH45min、pH24h下降、滴水損失、剪切力、水分和粗蛋白含量無顯著變化（P＞0.05）。

表4 桑葉DNJ對兔肉品質(zhì)的影響

2.4 桑葉DNJ對兔肉脂肪酸組成的影響

由表5 可知，用GC/MS 檢測兔肉脂肪酸組成和含量，共檢測出26 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）13種，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）6 種，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）7 種。26 種脂肪酸中，C14：0、C16：0、C18：0、C16：1n7c、C18：1n9c、C18：1n9t、C18：2n6c、C20：4n6c 含量均高于1%，其中C16：0 和C18：2n6c 含量最高，含量在30%左右，C18：1n9c次之，含量在22%左右。SFA 中，L-DNJ組C12：0和12Methyl C13：0含量顯著高于對照組和HDNJ組（P＜0.05），H-DNJ組C16：0和C18：0含量顯著低于對照組和L-DNJ組（P＜0.05），C17：0含量顯著高于對照組和L-DNJ 組（P＜0.05），L-DNJ 和H-DNJ 組13Methyl C14：0含量顯著高于對照組（P＜0.05）；MUFA中，L-DNJ組C18：1n9c含量顯著低于對照組和H-DNJ組（P＜0.05），H-DNJ 組C18：1n9t 和C20：1n9t 含量顯著高于對照組和L-DNJ 組（P＜0.05）；PUFA 中，H-DNJ 組C16：3n4c、C18：2n6c 和C20：4n6c 含量顯著高于對照組和L-DNJ 組（P＜0.05），L-DNJ 組C20：2n6c含量顯著低于對照組（P＜0.05），H-DNJ組檢測到C22：5n6c 含量為0.13%，而對照組和L-DNJ 組未檢測到。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，與對照組相比，H-DNJ 組兔肉中SFA 含量顯著降低（P＜0.05），PUFA（P＜0.05）和總不飽和脂肪酸（UFA，P＜0.05）含量顯著提高。

表5 桑葉DNJ對兔肉脂肪酸組成的影響（%）

2.5 桑葉DNJ對兔肉抗氧化性能的影響

由表6可知，與對照組相比，其余兩組兔肉GSH-Px活性顯著提高（P＜0.05），H-DNJ 組兔肉T-AOC 顯著提高（P＜0.05），L-DNJ 組和H-DNJ 組兔肉SOD 活性和MDA含量無顯著差異（P＞0.05）。

表6 桑葉DNJ對兔肉抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 桑葉DNJ 對新西蘭白兔生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

由于桑葉DNJ具有降低血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，大量采食可能不利于動物育肥，影響生長性能。Hou 等[7]在皖西白鵝飼糧中添加桑葉DNJ，發(fā)現(xiàn)其通過降低鵝腸道淀粉酶和脂肪酸活性，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響動物對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低生長性能。鐘經(jīng)波等[9]和謝輝等[12]發(fā)現(xiàn)高濃度桑葉DNJ（0.4 g/kg 和2.0 g/kg）能夠降低新西蘭白兔十二指腸淀粉酶活性和對飼糧干物質(zhì)和粗脂肪的消化率，造成動物體重增長緩慢。本試驗(yàn)根據(jù)兔飼糧中桑葉的適宜飼喂量添加DNJ，發(fā)現(xiàn)H-DNJ組新西蘭白兔對干物質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率降低，動物體重增長減緩，與鐘經(jīng)波等[9]和謝輝等[12]的研究結(jié)果一致，說明正常桑葉飼喂量下DNJ 仍然具有改變動物對飼糧養(yǎng)分利用的作用，進(jìn)而影響動物生長性能。飼糧干物質(zhì)為可被動物利用的有機(jī)物，干物質(zhì)消化率越高則動物獲得的總養(yǎng)分越多，反之則越少；脂肪是飼糧中能量含量最高的物質(zhì)，粗脂肪表觀消化率降低預(yù)示動物獲得的能量減少，機(jī)體會通過消耗體內(nèi)貯存的能量物質(zhì)（如糖原、脂肪）滿足生命活動需要，長期能量供應(yīng)不足會造成機(jī)體瘦削，體重下降[13]。研究顯示，動物還可以通過提高機(jī)體蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)速率，加快蛋白質(zhì)代謝為機(jī)體提供能量[14]，這可能是DNJ 處理組粗蛋白表觀消化率提高的內(nèi)在原因。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，正常桑葉飼喂量下DNJ 不會引起動物采食量下降，與鐘經(jīng)波等[9]的結(jié)果不同，說明正常桑葉飼喂量下DNJ 不是桑葉中影響動物采食量的成分。然而，桑葉DNJ確實(shí)可以幫助人類減少食物攝入以預(yù)防和治療肥胖。一項(xiàng)針對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，DNJ 能夠通過提高下丘腦脂聯(lián)素水平抑制小鼠采食量，進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠體重[15]。

3.2 桑葉DNJ對新西蘭白兔肉品質(zhì)的影響

家兔宰殺放血后，機(jī)體內(nèi)環(huán)境的pH 平衡被打破，肌肉組織的pH 由生活狀態(tài)下的7.1～7.2 下降到6.2～6.4，24 h 左右pH 降為5.6～5.8，然后這種pH 水平會一直維持到細(xì)菌分解初期[16]。本研究所測兔肉的pH 與文獻(xiàn)報(bào)道的相近，與鐘經(jīng)波等[9]研究結(jié)果一致，與Khan 等[17]用桑葉飼喂家兔的效果相似。然而，F(xiàn)an等[18]用桑葉喂豬，發(fā)現(xiàn)桑葉可以延緩豬肉24 h 內(nèi)pH下降速度，并推測是桑葉中多酚類物質(zhì)抗氧化的結(jié)果。本研究中，DNJ 雖然也具有抗氧化活性，但并沒有減緩24 h 兔肉的pH 下降速度，可能是由于其抗氧化活性不如多酚類強(qiáng)。

本研究一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，隨著飼糧中DNJ濃度的增加，兔肉的亮度（L*）減弱，紅度（a*）增強(qiáng)，即兔肉的顏色偏深紅色，這非常符合消費(fèi)者對肉類的感官偏好。然而鐘經(jīng)波等[9]的研究結(jié)果顯示桑葉DNJ能夠提升兔肉亮度（L*），對兔肉紅度（a*）無影響。肉色是感官指標(biāo)，主要由肌肉中肌紅蛋白和血紅蛋白的含量和化學(xué)狀態(tài)，以及肌肉中脂肪和水分含量等因素決定。紫紅色的脫氧肌紅蛋白與氧結(jié)合生成鮮紅色的氧合肌紅蛋白，脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白均可以被氧化生成褐色的高鐵肌紅蛋白，使肉色變暗[19]?？赡鼙狙芯恐猩Ｈ~DNJ 的添加量較鐘經(jīng)波等[9]低，抗氧化活性較弱，未能阻止肌紅蛋白氧化變暗。肌肉脂肪和水分含量越高，肉質(zhì)顏色越淺[19]。本研究DNJ 處理組兔肉水分含量沒變，但脂肪含量顯著低于對照組，對肉色變暗也有一定的作用。另外，肌肉游離葡萄糖含量與肉色變深也有關(guān)聯(lián)[19]。研究顯示，DNJ可下調(diào)鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（SGLT1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT2）和Na/K-ATP 酶的mRNA 表達(dá)量，減少葡萄糖在腸道的吸收，降低糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的表達(dá)量[20]，從而降低肌肉游離葡萄糖水平。

DNJ 具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。Wang 等[21]研究表明，DNJ 通過ERK/PPARy 信號通路抑制豬肉脂肪細(xì)胞的生成。DNJ 還能增加PPARa和AMPK基因的mRNA 表達(dá)量，提升肝臟脂肪酸β氧化酶的活性與mRNA 表達(dá)量，激活β氧化系統(tǒng)，從而促進(jìn)脂肪分解，防止脂肪積累[22]。本研究桑葉DNJ 處理組兔肉脂肪含量顯著低于對照組，且與劑量呈負(fù)相關(guān)，這與DNJ減少脂肪生成、促進(jìn)脂肪分解的作用一致。

3.3 桑葉DNJ對兔肉脂肪酸組成的影響

兔肉除了其“四高”（高賴氨酸、高蛋白質(zhì)、高磷脂、高消化率）和“三低”（低膽固醇、低脂肪、低熱量）的特點(diǎn)以外，兔肉中脂肪酸組成作為其營養(yǎng)價(jià)值的重要方面被廣泛研究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，兔肉中UFA含量在55%以上，略高于SFA 含量；SFA 主要由棕櫚酸（16：0）和硬脂酸（18：0）組成，占SFA 含量的90%左右；MUFA 中油酸（18：1n9）含量最高，占MUFA 含量的85%以上；PUFA 主要由亞油酸（C18：2n6c）和花生四烯酸（C20：4n6c）組成，占PUFA 含量的95%以上。這5 種脂肪酸的總含量占總脂肪酸含量的90%左右，檢測結(jié)果與Lullere等[23]相近。

本研究發(fā)現(xiàn)，桑葉DNJ處理組兔肉中SFA 含量顯著降低，PUFA 含量顯著提高。目前關(guān)于桑葉DNJ 影響動物肉產(chǎn)品脂肪酸組成的研究較少。Martínez 等[24]用桑葉替代苜蓿飼喂肉兔，發(fā)現(xiàn)兔肉總SFA 和MUFA含量顯著降低，PUFA 含量顯著提高。李飛鳴等[25]在寧鄉(xiāng)土雜豬飼糧中添加13%和16%發(fā)酵桑葉，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵桑葉能降低豬肉總SFA 含量，提高PUFA 含量。這些研究與本文的結(jié)果相近，說明DNJ可能是桑葉中提高動物肉產(chǎn)品PUFA 含量的重要成分。研究顯示，亞油酸（C18：2n6c）具有降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進(jìn)微循環(huán)的作用，可預(yù)防或減少心血管病的發(fā)病率；花生四烯酸（C20：4n6c）是人的大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質(zhì)，對人的智力和視神經(jīng)的敏感性具有重要作用；二十二碳五烯酸（DPA，C22：5n6c）在抗炎、抑制細(xì)胞因子合成、減少血栓形成、降低血脂、抑制動脈粥樣硬化等許多方面對人體健康有益[26-27]。本研究飼糧添加0.28 g/kg 桑葉DNJ 可顯著提高兔肉中亞油酸（C18：2n6c）、花生四烯酸（C20：4n6c）和DPA（C22：5n6c）含量，預(yù)示桑葉DNJ 具有作為飼料添加劑生產(chǎn)更有利于人類健康的肉產(chǎn)品的潛力。

3.4 桑葉DNJ對兔肉抗氧化性能的影響

已有大量文獻(xiàn)揭示DNJ 具有抗氧化活性。Tang等[28]發(fā)現(xiàn)給羅非魚飼喂DNJ 可提升魚脾細(xì)胞SOD 和CAT活性，降低脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA 水平。Piao等[29]給胃潰瘍小鼠口服DNJ，也發(fā)現(xiàn)小鼠胃中SOD、CAT活性上升而MDA 水平下降。前人研究大多檢測的是動物血漿的抗氧化參數(shù)，而本研究檢測了兔肉的抗氧化指標(biāo)，更能直接反映桑葉DNJ 對動物肉產(chǎn)品的影響。本研究發(fā)現(xiàn)桑葉DNJ 處理組兔肌肉組織的抗氧化能力有一定程度的提升，有利于延長動物肉產(chǎn)品的貨架期。

4 結(jié)論

H-DNJ 組新西蘭白兔對飼糧干物質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率顯著降低，平均日增重和兔肉脂肪含量降低，兔肉紅度（a*）提高，改善感官效果吸引消費(fèi)者。

桑葉DNJ處理組兔肉中SFA含量降低，PUFA含量提高，其中亞油酸（C18：2n6c）、花生四烯酸（C20：4n6c）和DPA（C22：5n6c）含量的提高對人類健康有益。

飼糧補(bǔ)充桑葉DNJ 能夠一定程度上提高動物肉產(chǎn)品的抗氧化能力，延長貨架期。