miR-138-5p通過調(diào)控自噬影響乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥性的體外研究

姚浩明, 李 英

乳腺癌是影響婦女生命健康的最常見癌癥之一,在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率日益升高[1]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,乳腺癌治療已取得較大進(jìn)步,臨床對乳腺癌通常采用手術(shù)切除、放療、化療及藥物輔助治療等方法[2-3]。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)是臨床治療乳腺癌的常用化療藥物,但多數(shù)患者在化療幾周后即出現(xiàn)耐藥,成為乳腺癌治療的主要障礙。因此,了解乳腺癌細(xì)胞對TAM耐藥的機(jī)制,探索降低機(jī)體耐藥性的方法是目前治療乳腺癌亟需解決的問題之一。微小RNA(micro ribonucleic acids,miRNAs)是動植物中廣泛存在的一類非編碼RNA,通過靶向mRNA降解或翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)[4]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、自噬等具有抑制作用[5]。然而,目前關(guān)于miR-138-5p對乳腺癌細(xì)胞TAM耐藥性影響的研究較少。本研究旨在探討miR-138-5p對乳腺癌細(xì)胞TAM耐藥性的影響及其機(jī)制,為改善乳腺癌患者治療預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自上海信裕生物科技有限公司。TAM耐藥MCF-7細(xì)胞株MCF-7/TAM由美國弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科岳微教授惠贈,已用1×10-7mol/L TAM維持耐藥1年。Trizol購自美國Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司;細(xì)胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)購自上海源葉生物科技有限公司。miR-138-5p mimics慢病毒、miR-138-5p NC慢病毒空載體由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)并合成。聚凝胺(polybrene)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司);128C酶標(biāo)儀(奧地利CliniBio公司);PowerPac Universal通用型電泳儀(美國Bio-Rad公司);Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司);DM4B熒光顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MCF-7/TAM細(xì)胞分別接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶(含非必需氨基酸、10 μg/ml胰島素、10%胎牛血清、1%青/鏈霉素)中,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2,每3 d換液,并觀察細(xì)胞形態(tài),待細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí),收集細(xì)胞備用。

1.3.2 分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期MCF-7、MCF-7/TAM細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml,以200 μl/孔接種于24孔板。設(shè)置正常對照組(MCF-7細(xì)胞)、耐藥對照組(MCF-7/TAM細(xì)胞)、LV-NC組(MCF-7/TAM細(xì)胞+miR-138-5p NC慢病毒空載體)和LV-miR-138-5p mimics組(MCF-7/TAM細(xì)胞+miR-138-5p mimics慢病毒)。慢病毒感染復(fù)數(shù)=30,培養(yǎng)12 h后更換完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h后向細(xì)胞中加入終濃度為2 μg/ml的嘌呤霉素篩選48 h。收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取方法1.3.2中獲取的細(xì)胞,每組均給予100 μl/孔終濃度為1×10-7mol/L的TAM進(jìn)行處理,在孵育24 h、48 h、72 h后分別加入MTT溶液20 μl,孵育4 h后依次加入DMSO 150 μl,10 min后使用酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔的OD值,計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測miR-138-5p相對表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒及PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系:10 μl SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)、0.8 μl正向引物、0.8 μl反向引物、2 μl cDNA(200 ng/μl)和6.4 μl ddH2O。所用引物序列見表1。反應(yīng)條件:95 ℃,30 s(預(yù)變性);95 ℃,5 s(變性),55 ℃,10 s(退火),72 ℃,15 s(延伸),共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計(jì)算miR-138-5p的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.5 MDC染色法檢測各組細(xì)胞自噬小體數(shù)量 取各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min,然后接種至6孔板(1×106cells/ml)中。24 h后,棄去培養(yǎng)液,用1×Wash Buffer洗滌細(xì)胞2次,加入MDC染色液(100 μl/孔)室溫避光染色40 min,棄去染色液,用1×Wash Buffer洗滌細(xì)胞3次,加入封片劑以防熒光淬滅,最后在熒光顯微鏡下觀察并記錄自噬小體數(shù)量。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞用HEPES緩沖鹽溶液(pH=7.5)洗滌2次,然后用70%冰冷乙醇在4 ℃下固定細(xì)胞30 min。將細(xì)胞重新懸浮在結(jié)合緩沖液中,向細(xì)胞中加入5 μl Annexin V-FITC染色15 min,然后在室溫下避光,用5 μl PI(50 μg/ml)染色10 min,每管加入400 μl結(jié)合緩沖液。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 Western blot法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞采用RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度后,取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h后,用相應(yīng)的一抗Beclin-1(1∶500)、LC3Ⅱ(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日,洗去一抗,用HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)再孵育1 h,然后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1四組細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)水平比較 耐藥對照組、LV-NC組miR-138-5p表達(dá)水平低于正常對照組,LV-miR-138-5p mimics組miR-138-5p表達(dá)水平高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注:F=37.753,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖1 四組細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)水平比較圖

2.2四組細(xì)胞增殖抑制率比較 耐藥對照組和LV-NC組增殖抑制率較正常對照組降低,LV-miR-138-5p mimics組抑制率較耐藥對照組、LV-NC組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組抑制率與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注:各時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率比較:24 h:F=81.647,P<0.001;48 h:F=50.181,P<0.001;72 h:F=45.523,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖2 四組細(xì)胞增殖抑制率比較圖

2.3四組細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組細(xì)胞凋亡率降低,LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞凋亡率高于耐藥對照組、LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞凋亡率與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注:F=124.702,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖3 四組細(xì)胞凋亡率比較圖

2.4四組細(xì)胞自噬小體數(shù)目比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組、LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞中自噬小體數(shù)目顯著增多(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組自噬小體數(shù)目少于耐藥對照組、LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:F=245.336,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖4 四組細(xì)胞自噬小體數(shù)目比較圖

2.5四組細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組、LV-miR-138-5p mimics組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LV-miR-138-5p mimics組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平低于耐藥對照組和LV-NC組,Bcl-2表達(dá)水平高于耐藥對照組和LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注:四組LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量比較,F=129.214,P<0.001;四組Beclin-1蛋白相對表達(dá)量比較,F=140.340,P<0.001;四組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較,F=23.346,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖5 四組細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較圖

3 討論

3.1乳腺癌細(xì)胞耐藥性是影響治療效果的主要因素,也是乳腺癌治療過程中有待解決的難題[6]。TAM是臨床常用化療藥,在治療乳腺癌中具有較好的療效,且副作用相對較少。然而,乳腺癌細(xì)胞對TAM易產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重影響療效。因此,研究乳腺癌細(xì)胞對TAM耐藥機(jī)制對提高療效具有重要意義。

3.2miRNAs可通過與互補(bǔ)的靶基因mRNAs結(jié)合,導(dǎo)致mRNAs翻譯抑制或降解,在細(xì)胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用[7]。有不少研究表明,miRNAs功能失調(diào)與肺癌[8]、結(jié)腸癌[9]等疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-138-5p可通過抑制肺癌中Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear interacting protein 1,SNIP1)的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖與遷移[10]。在結(jié)直腸癌中,miR-138-5p呈低表達(dá),過表達(dá)miR-138-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,提示其具有應(yīng)用于結(jié)直腸癌診斷的前景[11-12]。此外,miR-138-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,上調(diào)miR-138-5p表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力[5]。本研究結(jié)果顯示,耐藥對照組細(xì)胞miR-138-5p相對表達(dá)水平顯著降低。Yu等[13]研究表明,miR-138-5p可抑制胰腺癌惡性進(jìn)展,并增加其化療敏感性。Tang等[14]研究表明,miR-138在吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低,上調(diào)miR-138表達(dá)可增加肺癌細(xì)胞對吉非替尼敏感性,顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-138-5p能提高耐藥細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率,提示過表達(dá)miR-138-5p可增加MCF-7/TAM細(xì)胞對TAM敏感性。

3.3自噬是指在饑餓、缺氧及能量應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞通過膜結(jié)構(gòu)降解胞質(zhì)細(xì)胞器和生物大分子的動態(tài)過程,可清除已受損或功能異常的細(xì)胞器,對機(jī)體穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)控,在營養(yǎng)和能量缺乏、細(xì)胞衰老、蛋白質(zhì)變性等多種病理、生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。自噬對腫瘤細(xì)胞的作用具有兩面性:在腫瘤發(fā)生早期,自噬可通過清除線粒體中活性氧產(chǎn)生非正常折疊蛋白,發(fā)揮抗腫瘤作用[16];對于成熟腫瘤細(xì)胞,自噬可對受損蛋白降解重新利用,為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長,同時(shí),抗腫瘤藥會引起細(xì)胞損傷,而自噬可清除損傷的細(xì)胞器,從而降低腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性,增強(qiáng)腫瘤耐藥[17]。自噬泡膜的延伸由LC3-Ⅰ介導(dǎo),正常狀態(tài)下,LC3-Ⅰ存在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),當(dāng)發(fā)生自噬時(shí),LC3-Ⅰ經(jīng)過泛素樣蛋白系統(tǒng)加工修飾,與磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3-Ⅱ,參與自噬體形成,LC3-Ⅱ蛋白為自噬體形成的標(biāo)志性蛋白[18]。Beclin-1在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中低表達(dá),其不僅是一種抑癌基因,而且還是自噬相關(guān)基因。Beclin-1通過與不同的分子結(jié)合,介導(dǎo)自噬與凋亡途徑發(fā)生[19]。Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用,是一種抑制凋亡蛋白,可與Beclin-1結(jié)合,抑制Beclin-1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬功能[20]。研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p過表達(dá)可通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)抑制胰腺癌細(xì)胞自噬作用[21]。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-138-5p能夠明顯減少自噬小體數(shù)目,降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平,提高Bcl-2蛋白表達(dá)水平,抑制MCF-7/TAM細(xì)胞中自噬作用。

綜上所述,過表達(dá)miR-138-5p可抑制MCF-7/TAM細(xì)胞自噬作用,提高細(xì)胞對TAM敏感性,降低耐藥性,可能為臨床改善乳腺癌TAM耐藥性提供新思路。但本研究未能對miR-138-5p抑制自噬的具體機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。后期將對miR-138-5p的靶基因進(jìn)行篩選、驗(yàn)證,以明確其調(diào)控MCF-7/TAM細(xì)胞自噬作用的具體機(jī)制。