產(chǎn)多酚氧化酶菌株在改善雪茄煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用研究

潘 勇，吳巧茵，李林林，施友志，譚再鈺，張 娟，王 劍

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4.江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

多酚是一類(lèi)廣泛存在于各種植物中的次生代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗氧化、抑菌、抗癌、治療糖尿病等生物活性，多酚物質(zhì)不僅可以通過(guò)抗紫外、抗蟲(chóng)起到保護(hù)植物的作用，對(duì)于雪茄煙葉的香氣及勁頭也具有重要影響[1-3]。煙葉中多酚類(lèi)物質(zhì)主要由綠原酸、蕓香苷、莨菪葶及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成，多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物沉淀使得口腔收斂、增加苦澀和干燥感，從而影響煙葉的感官質(zhì)量[4]。多酚物質(zhì)還與煙氣濃度、勁頭相關(guān)，多酚含量過(guò)高時(shí)煙氣刺激性較大，苦澀感較強(qiáng)，含量過(guò)低使煙葉勁頭不足[5]。如何協(xié)調(diào)雪茄煙葉發(fā)酵中多酚物質(zhì)的含量，從而醇和煙葉香氣、減少刺激性是雪茄生產(chǎn)中需要解決的問(wèn)題。

目前，關(guān)于雪茄煙葉多酚物質(zhì)的研究較少，且主要為晾制和發(fā)酵過(guò)程中多酚含量和多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性的變化。盧紹浩等[6]比較晾制過(guò)程中不同部位雪茄煙葉多酚物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，各部位綠原酸含量均呈下降趨勢(shì)，PPO 活性呈先增后降的趨勢(shì)。郭文龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程多酚物質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且多酚類(lèi)物質(zhì)與煙葉透發(fā)性、香氣質(zhì)、雜氣、余味等顯著相關(guān)。馮穎杰等[8]將1 株能夠產(chǎn)生多酚氧化酶的鞘氨醇單胞菌應(yīng)用于烤煙發(fā)酵后，能夠增加煙葉香氣質(zhì)和香氣量，回甜增加，提升煙葉感官質(zhì)量。羅海濤等[9]將多酚氧化酶和木瓜蛋白酶復(fù)配后應(yīng)用于再造煙葉梗膏發(fā)酵可使產(chǎn)物的吡啶、麥司明、苯甲醇等致香成分含量明顯增加，能夠增加煙氣濃度、使煙氣更柔和細(xì)膩。以上關(guān)于煙葉多酚物質(zhì)的研究中尚缺乏對(duì)雪茄發(fā)酵中多酚物質(zhì)的調(diào)控，尤其是產(chǎn)多酚氧化酶微生物在雪茄發(fā)酵中的應(yīng)用研究。為此，通過(guò)特異性篩選獲得多酚氧化酶的生產(chǎn)菌株，將其應(yīng)用于雪茄發(fā)酵生產(chǎn)中，測(cè)定菌株對(duì)多酚物質(zhì)氧化降解的影響，并對(duì)菌株改善煙葉品質(zhì)進(jìn)行機(jī)制解析，以期為國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉原料品質(zhì)改善提供新的技術(shù)方法，并為雪茄發(fā)酵過(guò)程中多酚含量及相關(guān)氧化酶活性的控制和工業(yè)生產(chǎn)微生物菌劑的生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 煙葉原料 發(fā)酵煙葉試驗(yàn)和發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的煙葉原料為湖北來(lái)鳳CX81 中部二級(jí)茄芯煙葉，及供試菌株均由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 主要試劑 綠原酸、鄰苯二酚、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O 等，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫振蕩搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、紫外分光光度計(jì)［島津儀器（蘇州）有限公司］。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 CGA 篩選平板：綠原酸2 g/L、Na2HPO4·12H2O 6.15 g/L、KH2PO41.52 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液Ⅰ10 mL/L。微量元素溶液Ⅰ：EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素溶液Ⅱ100 mL/L。微量元素溶液Ⅱ：ZeSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、H3BO30.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl2·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，煙葉粉末20 g/L。LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂15 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 本研究中使用CGA 篩選平板作為篩選培養(yǎng)基，以綠原酸為唯一碳源，煙葉微生物以無(wú)菌生理鹽水為緩沖液，10 ℃、220 r/min 洗脫2 h，涂布菌懸液于CGA 篩選平板，于30 ℃/37 ℃靜置培養(yǎng)，將篩選平板中生長(zhǎng)的菌落即為能夠降解綠原酸的菌株。將篩選獲得的菌株在LB 培養(yǎng)基中重復(fù)劃線，分離得到單菌落。

1.2.2 PPO 酶活性測(cè)定 將菌株接種發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 條件下發(fā)酵72 h，發(fā)酵液于4 ℃、7 000 r/min 離心，上清液即為粗酶液[以不加菌株的發(fā)酵液為對(duì)照（CK）]。酶活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]的方法，反應(yīng)體系：0.1 mol/L pH 值6.0 的磷酸鹽緩沖液3 mL，1 mL 濃度為0.1 mol/L 鄰苯二酚溶液以及0.2 mL 粗酶液，混合均勻于37 ℃反應(yīng)30 min 后測(cè)定OD460。以0 min時(shí)的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。

式中：V為反應(yīng)體系內(nèi)粗酶液的體積（mL）；ΔOD460為吸光度值的變化值；ΔT為反應(yīng)時(shí)間（min）。PPO 活性定義：1 mL 酶液在1 min 內(nèi)使得吸光度值變化0.001定義為1個(gè)酶活性單位（U/mL）。

1.2.3 菌種鑒定 以16S rDNA 序列分析鑒定篩選的菌株。以該菌株的基因組為模板，引物分別為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR 反 應(yīng) 程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化和回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 煙葉發(fā)酵 以湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司的湖北省來(lái)鳳縣CX81 中部二級(jí)煙葉為樣品，取200 g 煙葉裝在自封袋中，菌株以2%接種量均勻噴灑到煙葉表面并使得煙葉最終含水量為28%，室溫回潮12 h后于37 ℃、濕度為70%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d。以添加相同體積無(wú)菌水的煙葉作為對(duì)照，標(biāo)記為CK。將發(fā)酵結(jié)束的煙葉卷制成煙支，使用真空回潮機(jī)平衡煙支水分并去除雜氣，待進(jìn)行感官質(zhì)量分析。

1.2.5 煙葉感官質(zhì)量分析 發(fā)酵煙葉的感官質(zhì)量分析由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司進(jìn)行，按照1～5分對(duì)樣品的香韻、定性指標(biāo)和定量指標(biāo)進(jìn)行打分，不存在記0 分。香韻分為：木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、焦甜香、清甜香、花粉香、奶香、干草香、烘焙香、樹(shù)脂香、果香、藥草香、堅(jiān)果味、皮革味、咖啡味、胡椒味。定性指標(biāo)分為苦、甜、咸、辣、澀，定量指標(biāo)分為煙氣濃度、煙氣強(qiáng)度、透發(fā)性、醇和度、雪茄風(fēng)格彰顯度、香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、余味、甜潤(rùn)感、燃燒性、灰色。

1.2.6 感官質(zhì)量得分計(jì)算 煙葉感官質(zhì)量按照公式進(jìn)行計(jì)算，主要由香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、余味、甜潤(rùn)感、燃燒性和灰分8 項(xiàng)指標(biāo)綜合計(jì)算得出，各項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重分別為18%、16%、10%、12%、16%、10%、10%和8%。質(zhì)量得分=（香氣質(zhì)×18%+香氣量×16%+雜氣×10%+刺激性×12%+余味×16%+甜潤(rùn)感×10%+燃燒性×10%+灰分×8%）/各項(xiàng)指標(biāo)最大分值之和×100，質(zhì)量得分結(jié)果保留2位小數(shù)。

1.2.7 煙葉揮發(fā)性化合物測(cè)定 使用DB-5MS色譜柱，萃取頭為SPME 纖維，氦氣流速恒定為1.0 mL/min。測(cè)定程序：進(jìn)樣開(kāi)始時(shí)，柱溫為40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的 速 率 升 溫 至250 ℃，保 持5 min。離子源溫度為210 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。系統(tǒng)運(yùn)行模式為EI 模式，EI 電壓為70 eV[11]。以全掃描模式在33～400 m/z 的質(zhì)量掃描范圍掃描，采集速率為每秒掃描10 次。以計(jì)算機(jī)譜庫(kù)WILEY 8.0和NIST14 庫(kù)比對(duì)分析，選擇相似度在800 以上且具有香韻特征的揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析，相對(duì)含量計(jì)算采用面積歸一法。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的特異性篩選

利用CGA 篩選平板通過(guò)特異性篩選獲得3 株能夠降解綠原酸的菌株，將3 株形態(tài)不同的菌株分別命名為C1、C2和C3。如圖1所示，其中C1菌株菌落表面有褶皺、白色，典型的芽孢桿菌形態(tài)；C2菌株菌落呈黃綠色，表面光滑；C3菌株菌落呈淺黃色，表面光滑。經(jīng)過(guò)平板劃線純化后進(jìn)行菌種鑒定，通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，C1 菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度為99.72%，C2 菌株 與 副 凝 聚 小 短 桿 菌（Brachybacteriumparaconglomeratum）相似度為99.74%，C3 菌株與鳥(niǎo)短桿菌（Brevibacterium avium）相似度為99.79%。

圖1 產(chǎn)多酚氧化酶菌株平板菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of PPO producing strains

將純化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵72 h 測(cè)定PPO 酶活性，結(jié)果如圖2 所示，篩選到的3株菌株都具有產(chǎn)PPO 的能力，其中菌株C3 發(fā)酵液PPO 酶活性最高，達(dá)到141.67 U/mL；菌株C2 發(fā)酵液中PPO酶活性最低，為41.67 U/mL。

圖2 菌株發(fā)酵產(chǎn)多酚氧化酶活性Fig.2 Activity of polyphenol oxidase produced by strain fermentation

2.2 產(chǎn)多酚氧化酶菌株發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量分析

將菌株發(fā)酵液接種于煙葉表面，發(fā)酵15 d 后進(jìn)行感官質(zhì)量分析，結(jié)果如圖3所示。煙葉原料CX81有刺激性，香氣質(zhì)中等、香氣量一般，3 株產(chǎn)多酚氧化酶菌株C1、C2、C3 發(fā)酵煙葉質(zhì)量得分分別為59.35、63.90、57.70 分，較CK 分別增加4.10、8.65、2.45 分。產(chǎn)多酚氧化酶菌株應(yīng)用于發(fā)酵，煙葉香氣透發(fā)性、甜潤(rùn)感、灰色、余味等感官指標(biāo)提升，煙葉香韻類(lèi)型增加、香氣質(zhì)和香氣量改善。菌株C1發(fā)酵后木香突出，樹(shù)脂香、豆香、清甜香、花粉香等6種香韻增加；菌株C3發(fā)酵后蜜甜香較突出，堅(jiān)果香、清甜香、花粉香、豆香4種香韻增強(qiáng)；菌株C2發(fā)酵后木香香韻突出，堅(jiān)果味、烘焙香、豆香、清甜香、干草香、蜜甜香等7 種香韻增強(qiáng)。與菌株C1、C3 相比，菌株C2發(fā)酵煙葉香氣質(zhì)、香氣量、透發(fā)性、余味等指標(biāo)改善最為明顯，香韻類(lèi)型最豐富，應(yīng)用于雪茄煙葉發(fā)酵中感官質(zhì)量整體表現(xiàn)較好，煙葉工業(yè)可用性提升。

圖3 產(chǎn)多酚氧化酶菌株發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量雷達(dá)圖Fig.3 Radar chart of smoking quanlity of PPO producing strains fermented cigar leaves

2.3 產(chǎn)多酚氧化酶菌株發(fā)酵煙葉揮發(fā)性化合物變化分析

經(jīng)煙葉揮發(fā)性化合物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3 株產(chǎn)多酚氧化酶發(fā)酵菌株應(yīng)用于雪茄煙葉能夠增加煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、脂肪酸降解產(chǎn)物和煙堿降解產(chǎn)物含量，結(jié)果如圖4所示。與CK相比，菌株C1發(fā)酵煙葉中苯乙酸乙酯、二氫大馬酮、新植二烯與壬酸乙酯、月桂醇等脂肪酸降解產(chǎn)物增加；菌株C2 發(fā)酵煙葉中2，6-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和乙酸乙酯含量明顯增加；菌株C3 發(fā)酵煙葉中苯甲醇、苯甲醛等芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和法尼醇、六氫假紫羅酮、甲基庚烯酮等類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加。

圖4 產(chǎn)多酚氧化酶菌株發(fā)酵煙葉揮發(fā)性化合物熱圖Fig.4 Heatmap of volatile compounds of PPO producing strains fermented cigar leaves

產(chǎn)多酚氧化酶菌株在煙葉中發(fā)酵產(chǎn)PPO 將綠原酸降解生成咖啡酸和奎尼酸等中間產(chǎn)物，咖啡酸氧化降解進(jìn)一步與氨基酸等發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成吡嗪、吡啶、2-甲基吡嗪等雜環(huán)化合物；奎尼酸經(jīng)過(guò)脫水、脫氫等酶促反應(yīng)生成莽草酸，莽草酸作為合成芳香族氨基酸、脂肪酸等多種香氣物質(zhì)的重要前體物質(zhì)，能夠合成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在脫氨酶等酶系催化下促使苯乙醇、苯乙醛等苯丙氨酸降解產(chǎn)物生成（圖5）。

圖5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和芳香族氨基酸降解產(chǎn)物預(yù)測(cè)代謝途徑Fig.5 Predicted metabolic pathways of MRs and AADV

3 結(jié)論與討論

調(diào)控多酚物質(zhì)的含量主要通過(guò)品種選育、栽培措施和調(diào)控PPO 活性等手段，對(duì)于自身質(zhì)量較差的煙葉主要利用控制溫度、pH值等環(huán)境因素和添加氮鉀肥料、醌類(lèi)偶聯(lián)劑抑制多酚物質(zhì)降解[12-14]，合理調(diào)控多酚含量從而提升雪茄煙葉品質(zhì)是目前重要的研究方向。郝賢偉等[15]的研究結(jié)果表明，綠原酸含量高于15 mg/g、莨菪亭含量低于0.2 mg/g 時(shí)，煙葉感官質(zhì)量指標(biāo)得分較高。盧紹浩等[16]的研究結(jié)果表明，多酚含量與煙葉品質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系，但多酚與蛋白質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)后，不僅影響煙葉口感還會(huì)使煙葉顏色過(guò)深。

本研究通過(guò)分析產(chǎn)多酚氧化酶菌株在雪茄發(fā)酵中對(duì)煙葉揮發(fā)性化合物和感官質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶生產(chǎn)菌株能夠增加雪茄煙葉香韻、減輕煙葉刺激性、提升煙葉品質(zhì)和工業(yè)可用性，與ZHAO等[5]通過(guò)增加煙葉PPO 活性使綠原酸含量降低85.32%，且雪茄生產(chǎn)煙葉質(zhì)量得到明顯提高的結(jié)果相似。分析揮發(fā)性化合物變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、脂肪酸降解產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加。多酚類(lèi)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化生產(chǎn)咖啡酸和奎尼酸，分別作為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和芳香族氨基酸、脂肪酸前體物質(zhì)，與陳園等[17]、楊博等[18]的研究結(jié)果一致。乙酸乙酯主要由微生物代謝生成，隨著多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化降解減少了對(duì)微生物的代謝使乙酸乙酯含量增加，與LIU 等[19]的研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，產(chǎn)多酚氧化酶菌株通過(guò)氧化降解調(diào)控了雪茄煙葉多酚物質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和脂肪酸降解產(chǎn)物的含量，可作為雪茄工業(yè)發(fā)酵微生物菌劑，應(yīng)用于低等級(jí)煙葉品質(zhì)提升。

通過(guò)特異性篩選獲得3 株可降解綠原酸菌株C1、C2、C3，與對(duì)照相比，菌株C1發(fā)酵煙葉中壬酸乙酯、月桂醇等脂肪酸降解產(chǎn)物增加，壬酸乙酯、苯乙酸乙酯具有甜香、花果香等香味，使煙葉清甜香和花粉香增強(qiáng)；菌株C2 發(fā)酵煙葉中2，6-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和乙酸乙酯含量增加，分別具有烘焙香、堅(jiān)果味和甜香，與煙葉烘焙香、清甜香提升結(jié)果一致；菌株C3 發(fā)酵煙葉中苯甲醇、苯甲醛、法尼醇、甲基庚烯酮等分別有清香、干草香、花香和清甜香等香味，其含量增加與煙葉清甜香、香韻提升結(jié)果一致[20-22]。菌株C3 發(fā)酵煙葉中類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加，推測(cè)可能是因?yàn)镻PO活性與綠原酸和質(zhì)體色素呈正相關(guān)的關(guān)系[6]。

本研究將產(chǎn)多酚氧化酶菌株接種于雪茄煙葉發(fā)酵，增加了煙葉揮發(fā)性化合物含量，降低了煙葉刺激性并明顯改善了煙葉品質(zhì)，有利于進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)多酚氧化酶酶制劑、微生物菌劑在雪茄發(fā)酵中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，促進(jìn)了多酚及相關(guān)氧化酶對(duì)雪茄品質(zhì)影響的機(jī)制研究。本研究篩選出的C1、C2、C3 菌株對(duì)煙葉揮發(fā)性化合物和香韻特征影響不同，后續(xù)的研究可將菌株C1、C2、C3 分別作為清甜香、烘焙香和堅(jiān)果味特征香韻的功能微生物，通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)一步提升雪茄香韻。