傅纖雯, 金銘浩, 花 磊, 李海洋, 許光治,倪勤學(xué), 高前欣, 張有做,3, 王 艷

(浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院1,杭州 311300) (中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所2,大連 116023) (浙江驕梔科技有限公司3,杭州 311300)

食用油作為餐桌上不可或缺的重要一環(huán),其質(zhì)量安全直接關(guān)系每個(gè)人的身體健康,然而以次充好、摻假摻偽是國際國內(nèi)食用油市場普遍存在的現(xiàn)象[1-4]。特級初榨橄欖油(EVOO)以其獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值風(fēng)靡全球,價(jià)格高昂,是易被摻假的油品;其中,以低價(jià)植物油如玉米油、菜籽油、花生油按一定比例摻入最為常見[5-7]。EVOO摻假不僅損害了消費(fèi)者權(quán)益,而且可能因?yàn)檫^敏等原因?qū)θ梭w健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[8]。食用油的摻假檢測,尤其是EVOO的摻假鑒別是食品安全研究領(lǐng)域的重要課題之一[9-11]。

食用油中的揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)通常來源于油脂萃取過程,受生產(chǎn)操作條件、油料種子類別、成熟度及地理來源等的影響,VOCs種類(如烴類、醛類、醇類、酯類、酮類、吡嗪類、吡啶類、呋喃類和噻吩類等)和含量千差萬別,這為食用油的種類區(qū)分和摻假鑒別提供了豐富信息[12-15]。Mansur等[16]比較了采用甘油三酯、脂肪酸、VOCs作為標(biāo)志物來鑒別純品芝麻油和被玉米或者大豆油摻假后的芝麻油。結(jié)果表明VOCs比甘油三酯和脂肪酸更有優(yōu)勢,可以成功鑒別出摻假量在5%的芝麻油樣品。因此,對食用油VOCs的高靈敏定性定量分析是進(jìn)行種類區(qū)分和摻假鑒別的有效手段。以頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用(HS-SPME-GCMS)等為主的色譜檢測雖然定性和定量分析能力強(qiáng),但需繁瑣的樣本處理、耗時(shí)費(fèi)力,無法滿足市場中海量樣品高通量檢測的需求[17]。因此,急需發(fā)展其他高靈敏快速檢測方法以滿足大宗樣品的快速篩查。

基于食用油VOCs進(jìn)行摻假識別的方法主要有傳感器原理的電子鼻(E-nose)[18,19],氣相離子遷移譜(IMS)[20,21]以及直接質(zhì)譜技術(shù)等(如質(zhì)子轉(zhuǎn)移電離質(zhì)譜PTR-MS[22,23]、選擇離子流動管質(zhì)譜SIFT-MS[24,25])。每種方法各有優(yōu)勢和不足,其中直接質(zhì)譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性定量分析、是1種非常有潛力的快檢技術(shù)。Ozcan[25]利用 SIFT-MS獲得了EVOO、玉米油、葵花籽油和其他種類橄欖油的VOCs指紋圖譜,然后結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué),成功實(shí)現(xiàn)了對摻有其他油品的EVOO的鑒別;雖然該方法的譜圖采集耗時(shí)較短(1～2 min),但頂空氣體的獲得往往需要30 min的平衡時(shí)間。因此,仍需發(fā)展更多基于不同原理的直接質(zhì)譜技術(shù)及相應(yīng)的分析方法用于油脂摻假的快速定性定量鑒別。

高氣壓光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPPI-TOFMS)是1種基于真空紫外光(VUV)的閾值光電離質(zhì)譜技術(shù),具有分子離子產(chǎn)率高、譜圖易解析,分析速度快等優(yōu)點(diǎn),主要用于痕量VOCs的高靈敏、在線實(shí)時(shí)分析[26-28]。本研究利用HPPI-TOFMS,結(jié)合動態(tài)頂空采樣,建立了食用油中VOCs的快速檢測方法;分析了4個(gè)不同種類食用油(特級初榨橄欖油,EVOO;精煉菜籽油,r-RO;花生油,PO;芳香菜籽油,f-RO)的VOCs指紋圖譜。隨后,以EVOO的摻假鑒別為例,利用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的S-plot 曲線,獲得每種油品的特征VOCs。基于特征VOCs,實(shí)現(xiàn)盲樣的定性鑒別,然后對EVOO中分別摻入r-RO, PO,和f-RO的二元摻假混合物進(jìn)行HPPI-TOFMS分析,構(gòu)建摻假濃度和特征VOCs信號強(qiáng)度之間的線性方程,繼而利用這些方程,實(shí)現(xiàn)盲樣摻假濃度的定量預(yù)測。研究為EVOO的定性定量摻假鑒別提供了可靠方法,也為其他種類植物油的摻假判別提供了方法學(xué)參考和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 儀器與方法

HPPI-TOFMS儀器由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所快速分離與檢測課題組自行研制[26]。圖1為HPPI-TOFMS與動態(tài)頂空采樣系統(tǒng)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1 動態(tài)頂空采樣系統(tǒng)與 HPPI-TOFMS 集成的結(jié)構(gòu)示意圖

HPPI-TOFMS系統(tǒng)由HPPI電離源,離子傳輸系統(tǒng)及反射式飛行時(shí)間質(zhì)譜儀3個(gè)部分組成。動態(tài)頂空采樣系統(tǒng)由載氣、加熱腔體、20 mL的棕色玻璃采樣瓶及其配套的PEEK針尖采樣器組成。PEEK采樣器通過采樣瓶蓋上的硅膠軟墊刺入采樣瓶中。針尖采樣器上設(shè)有2個(gè)氣體通道,一路用于載氣的引入,另一路用于將食用油頂空氣體導(dǎo)入HPPI-TOFMS的不銹鋼金屬毛細(xì)管中,實(shí)現(xiàn)采樣。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中加熱腔體保持120 ℃,且玻璃采樣瓶完全浸沒其中。具體操作流程如下:首先取0.7 mL的食用油樣品于采樣瓶中,然后蓋緊瓶蓋,將其置于加熱腔體中,密閉孵育0.5 min后,刺入PEEK采樣器,與此同時(shí),60 mL/min的載氣(高純N2,99.999%)被引入食用油樣品的頂空,載帶食用油的VOCs組分經(jīng)采樣器上的另一通路流出采樣瓶,于頂空采樣瓶出口處設(shè)置有1個(gè)三通連接器,一端通過長度為30 cm/內(nèi)徑為250 μm的金屬毛細(xì)管直接通入HPPI-TOFMS電離源內(nèi)部,另一端注入尾氣吸收處理系統(tǒng)。不銹鋼金屬毛細(xì)管及三通連接器由加熱帶及溫度控制系統(tǒng)加熱至120 ℃并保溫,避免因溫度下降造成的食用油VOCs冷凝。與PEEK采樣器刺入采樣瓶同時(shí)進(jìn)行的2個(gè)操作是:1)60 mL/min的高純N2引入采樣瓶;2)質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)采集軟件開始工作。數(shù)據(jù)采集完畢后,獲得采樣時(shí)間為1 min的HPPI-TOFMS 質(zhì)譜圖,即獲得不同種類食用油的VOCs指紋圖譜。因此,采用高氣壓光電離質(zhì)譜儀結(jié)合動態(tài)頂空采樣,無需任何前處理,從取樣到完成檢測耗時(shí)1.5 min,有利于實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測。

1.2 材料與試劑

特級初榨橄欖油EVOO(12種);精煉菜籽油r-RO(7種);花生油PO(17種);芳香菜籽油f-RO(6種)。所有42種純品油均為市售。2-甲基吡嗪,2, 5-二甲基吡嗪以及二甲基二硫均為98%分析純。

1.3 二元摻假樣品的配制

EVOO摻假實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分是建立定量回歸方程:首先隨機(jī)選擇r-RO、PO、f-RO和EVOO各2個(gè)品牌的食用油,分別制備r-RO—EVOO(A-D)、PO—EVOO(E-H)和f-RO—EVOO(I-L)的二元摻假混合物,共生產(chǎn)12個(gè)系列的摻假樣品(A-L)。每個(gè)系列摻假樣品由12種不同摻假比例的二元混合物組成,其中 r-RO、PO 或 f-RO 的體積分?jǐn)?shù)從1%增加到50%(1%、3%、6%、9%、15%、22%、25%、32%、35%、37%、40%、50%)。利用這些摻假樣品構(gòu)建線性回歸方程,橫坐標(biāo)為摻假濃度,縱坐標(biāo)為r-RO、PO 或 f-RO的特征VOCs在HPPI-MS譜圖中的信號強(qiáng)度。第二部分是利用第一部分建立的線性回歸方程對3個(gè)盲樣的摻假濃度進(jìn)行定量計(jì)算,計(jì)算出的摻假濃度也稱為預(yù)測摻假濃度,其與實(shí)際摻假濃度之間的絕對差值稱為預(yù)測偏差。盲樣是通過隨機(jī)選擇不同品牌的r-RO、PO、f-RO和EVOO各1種(排除第一部分摻假實(shí)驗(yàn)中選擇的樣品),分別配制成盲樣1:r-RO—EVOO,盲樣2:PO-EVOO和盲樣3:f-RO-EVOO,其中r-RO、PO 或 f-RO的體積分?jǐn)?shù)依次為5%、7%、12%、17%、19%、27%、30%、42%、45%。

1.4 OPLS-DA和S-plot曲線

OPLS-DA作為一種新型、有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,通常用于建立樣品類別之間的關(guān)系模型;S-plot曲線是OPLS-DA方法提供的用于挖掘造成兩類樣品之間差異的關(guān)鍵物質(zhì)。OPLS-DA于2002年提出,在化學(xué)計(jì)量學(xué)相關(guān)的應(yīng)用中日益廣泛,如農(nóng)產(chǎn)品、食品質(zhì)量安全控制相關(guān)的產(chǎn)地溯源、快速分類判別和預(yù)測等[29-31]。研究采用SIMCA 14.1軟件(Umetrics, Sweden)構(gòu)建OPLS-DA模型和S-plot曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 動態(tài)頂空采樣方法優(yōu)化

對可能影響HPPI-TOFMS檢測靈敏度的動態(tài)頂空采樣相關(guān)的4個(gè)實(shí)驗(yàn)條件:采樣溫度、載氣流速、孵育時(shí)間和食用油用量進(jìn)行了優(yōu)化。不同因素對HPPI-TOFMS譜圖的影響見圖2。由圖2a所示,隨加熱溫度從60 ℃升到120 ℃,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了更多的信號峰,且信號強(qiáng)度增加較多,這是由于高溫促進(jìn)了液體內(nèi)部VOCs的釋放。然而,當(dāng)溫度從120 ℃升到140 ℃時(shí),譜圖基本沒變化,猜測120 ℃可以產(chǎn)生足夠的揮發(fā)性化合物,保證檢測時(shí)足夠的靈敏度。由圖2b所示,隨載氣流速從60 mL/min升到250 mL/min,質(zhì)譜峰的個(gè)數(shù)幾乎沒有發(fā)生變化,但60 mL/min時(shí),樣品的信號強(qiáng)度可以達(dá)到最高。猜測這是由于質(zhì)譜進(jìn)樣毛細(xì)管的流速是50 mL/min,更高的載氣流速會稀釋樣品頂空氣體,不可避免造成信號強(qiáng)度的下降。由圖2c所示,隨著孵育時(shí)間從0 min提高到2 min,整個(gè)譜圖信號強(qiáng)度差異不大,質(zhì)譜峰的個(gè)數(shù)也基本類似。猜測在120 ℃的溫度下,樣品頂空氣體會很快達(dá)到平衡,無需長時(shí)間的平衡。為了保持樣本分析前狀態(tài)的一致性,最終決定采用0.5 min的孵育時(shí)間。由圖2d所示,隨樣品用量從0.1 mL提高到0.4 mL時(shí),大部分質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)度增加迅速;從0.4提高到0.7 mL時(shí),大部分質(zhì)譜信號峰的強(qiáng)度輕微增加;從0.7 mL提高到1.5 mL時(shí),譜圖幾乎沒有變化,猜測可能是頂空氣體中的VOCs濃度達(dá)到了飽和。因此,采用0.7 mL樣品用量,檢測結(jié)果最優(yōu)。動態(tài)頂空采樣的最優(yōu)條件確定為:120 ℃的加熱溫度,60 mL/min的采樣流速,0.5 min的孵育時(shí)間,以及0.7 mL的食用油用量。

圖2 采樣溫度、載氣流速、孵育時(shí)間、樣品用量對HPPI-TOFMS譜圖的影響

2.2 不同種類植物油的特征VOCs定性判別

研究共獲得42種純品植物油(12種EVOO, 7種r-RO, 17種PO, 和6種f-RO)的HPPI-TOFMS譜圖,見圖3。結(jié)果顯示:同一種類植物油的VOCs指紋圖譜類似。通過比較這42種植物油的HPPI-TOFMS譜圖,發(fā)現(xiàn)用于區(qū)分不同種類植物油的質(zhì)量峰幾乎一致,并不依賴于食用油品牌的差異。不同種類植物油的HPPI-TOFMS譜圖(EVOO、r-RO、PO、f-RO)如圖3所示,譜圖中對可能成為區(qū)分不同種類植物油的關(guān)鍵質(zhì)量峰都進(jìn)行了標(biāo)注。從質(zhì)量峰和信號強(qiáng)度的角度,可以看出這4種植物油存在顯著區(qū)別,這也表明HPPI-TOFMS可以快速高靈敏地捕捉到不同種類食用油的VOCs指紋圖譜。

圖3 不同種類植物油的HPPI-TOFMS譜圖

隨后,為了找到EVOO與r-RO、PO及f-RO相區(qū)別的關(guān)鍵VOCs,采用OPLS-DA對HPPI-TOFMS獲得的譜圖進(jìn)行建模,并用S-plot曲線找尋差異性質(zhì)量峰,見圖4。

圖4 EVOO分別與r-RO、PO、f-RO的OPLS-DA圖及S-plot曲線

從圖4可知,r-RO與EVOO相區(qū)別的特征質(zhì)量峰有2個(gè),m/z=66和m/z=108;PO與EVOO相區(qū)別的特征質(zhì)量峰4個(gè),分別是m/z=109,m/z=81,m/z=95,m/z=67;f-RO與EVOO相區(qū)別的特征質(zhì)量峰有2個(gè),m/z=94和m/z=81。這些特征質(zhì)量峰在圖3,每種植物油的HPPI-TOFMS譜圖中均有標(biāo)注。因此,當(dāng)待檢測的EVOO盲樣譜圖中出現(xiàn)m/z=66和m/z=108的特征峰時(shí),可定性判斷該盲樣含有r-RO;同理,可定性判斷盲樣中是否含有PO或者f-RO。隨后,通過對這些質(zhì)量峰進(jìn)行HPPI-TOFMS精確質(zhì)量校正,購買標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證,采用頂空固相微萃取(HS-SPME)GC-MS驗(yàn)證,與文獻(xiàn)比對等方法,綜合確認(rèn)出這些特征質(zhì)量峰的物質(zhì)歸屬[32-36]。在r-RO中,m/z=66和m/z=108分別是1,4-雙(亞甲基)環(huán)己烷的2個(gè)離子峰,分別對應(yīng)[M-CH3]+的碎片峰以及[M]+的分子離子峰。在PO中,m/z=109和m/z=81是2,5-二甲基吡嗪的2個(gè)特征峰,分別對應(yīng)[M+H]+和[M+H-2N]+;同理,m/z=95和m/z=67是2-甲基吡嗪的2個(gè)特征峰,分別對應(yīng)[M+H]+和[M+H-2N]+。在f-RO中,m/z=94是二甲基二硫的[M]+分子離子峰;m/z=81是甲基烯丙基氰化物的[M]+分子離子峰,通過與圖3d中f-RO的HPPI-TOFMS譜圖比對,顯然m/z=81的信號強(qiáng)度遠(yuǎn)低于m/z=94,因此對于f-RO,可以只選用高信號強(qiáng)度的二甲基二硫作為特征VOC標(biāo)志物。

HPPI-TOFMS質(zhì)譜圖結(jié)合OPLS-DA,篩選得到:r-RO的特征性VOC為1,4-雙(亞甲基)環(huán)己烷,對應(yīng)質(zhì)量峰m/z=66和108;PO的特征性VOC為2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪,對應(yīng)質(zhì)量峰m/z=109,81,95和67;f-RO的特征性VOC為二甲基二硫,對應(yīng)質(zhì)量峰m/z=94。這些特征VOCs可用于未知EVOO盲樣的定性鑒別。

2.3 基于特征VOCs—定量判別EVOO二元混合物的摻假比例

基于2.2節(jié)篩選出的每種植物油的特征VOCs,構(gòu)建其不同質(zhì)量峰的信號強(qiáng)度之和與摻假濃度的線性關(guān)系,實(shí)現(xiàn)未知盲樣摻假濃度的定量判別。對r-RO—EVOO二元摻假混合物(A-D,4個(gè)摻假系列),利用r-RO的特征質(zhì)量峰m/z=66+108的信號強(qiáng)度之和與摻假濃度(1%～50%)構(gòu)建了4條線性曲線,分別是曲線A:Y=223.18+31.43X(r2=0.993 4),曲線B:Y=231.10+17.72X(r2=0.995 4),曲線C:Y=162.69+30.22X(r2=0.997 9)和曲線D:Y=262.89+11.35X(r2=0.993 0)。同理對PO—EVOO二元摻假混合物(E-H,4個(gè)摻假系列),橫坐標(biāo)為摻假濃度,縱坐標(biāo)為PO中4個(gè)特征質(zhì)量峰(m/z=109+81+95+67)的信號強(qiáng)度之和,E-H的4條線性方程分別為:Y=1 289.18+354.11X(r2=0.992 8),Y=870.94+247.40X(r2=0.996 1),Y=1 166.01+319.31X(r2=0.994 2),Y=836.85+295.26X(r2=0.996 1)。對f-RO—EVOO二元摻假混合物(I-L,4個(gè)摻假系列)對應(yīng)的I-L的4條線性方程分別為:Y=559.16+601.42X(r2=0.997 7),Y=305.51+522.76X(r2=0.994 2),Y=562.01+543.13X(r2=0.994 9)以及Y=514.15+301.91X(r2=0.990 5)。

分別采用線性方程對盲樣的摻假濃度進(jìn)行預(yù)測。對r-RO—EVOO二元摻假混合物,分別采用A-D的4條線性曲線對其摻假濃度進(jìn)行計(jì)算,所得結(jié)果命名為“預(yù)測的摻假濃度”,那么“預(yù)測的摻假濃度”與“真實(shí)的摻假濃度”之間的差值為“預(yù)測偏差”,用絕對值表示。每個(gè)摻假濃度有3個(gè)平行樣品,因此結(jié)果用“平均預(yù)測偏差絕對值”表示。r-RO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表見表1,考慮到不同摻假濃度的偏差,最終結(jié)果采用“總-平均預(yù)測偏差絕對值的平均值”來表示,對r-RO—EVOO盲樣,該值為2.87%。

表1 r-RO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表

同理,對PO—EVOO二元摻假混合物,分別采用E-H的4條線性曲線對其摻假濃度進(jìn)行計(jì)算,PO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表見表2,總-平均預(yù)測偏差絕對值的平均值為1.26%。對f-RO—EVOO二元摻假混合物,分別采用I-L的4條線性曲線對其摻假濃度進(jìn)行計(jì)算,f-RO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表見表3,總-平均預(yù)測偏差絕對值的平均值為1.58%。

表2 PO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表

表3 f-RO—EVOO盲樣的摻假濃度預(yù)測情況表

3種盲樣的“總-平均預(yù)測偏差絕對值的平均值”分別為2.87%,1.26%和1.58%,均位于3%以內(nèi),較小的預(yù)測偏差體現(xiàn)了該定量策略的可行性,也進(jìn)一步體現(xiàn)出HPPI-TOFMS檢測的可靠性和穩(wěn)健性。

3 結(jié)論

研究采用HPPI-TOFMS,結(jié)合動態(tài)頂空采樣,建立了食用油中VOCs的高靈敏快速檢測方法,操作簡單,環(huán)境友好,無需任何前處理,僅1.5 min即可獲得不通過種類食用油的指紋圖譜。每種油品在HPPI-TOFMS譜圖中有代表自己的獨(dú)特VOCs,如1, 4-雙(亞甲基)環(huán)己烷和二甲基二硫分別是r-RO和f-RO的標(biāo)志性VOC; 2, 5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪是PO的標(biāo)志性VOC。根據(jù)這些標(biāo)志VOCs,可實(shí)現(xiàn)盲樣中r-RO、f-RO以及PO的定性判別。預(yù)測摻假濃度和實(shí)際摻假濃度之間良好的一致性,體現(xiàn)了該分析方法的可靠性和準(zhǔn)確性。研究有望實(shí)現(xiàn)海量市場樣品的高通量快速篩查,為其他種類植物油的摻假判別提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)路線,該方法可應(yīng)用于其他基于VOCs分析(如油脂氧化變質(zhì)的快速判別)進(jìn)行的食品安全、感官品質(zhì)等方面的研究課題和領(lǐng)域。