固相萃取-高效液相色譜法測定大豆油中3 種抗氧化劑的不確定度評定

楊 眉，宋明雄，陳潤霖，業(yè)潤澤，周 偉

（玉溪市糧食質(zhì)量監(jiān)測中心，云南 玉溪 653100）

抗氧化劑是一種能夠有效防止油脂及其制品、罐頭、方便面、餅干等含油脂的食品酸敗及其他食品變質(zhì)的一類添加劑。當(dāng)今生活的不少食品和藥品中都存在著人工合成的抗氧化劑。其中，比較常見的3種是特丁基對苯二酚（tert-butyhydroquinone，TBHQ）、二丁基羥基乙酰丙嗪（butylated hydroxytoluene，BHT）和丁基羥基水茴草醚（butylated hydroxyanisole，BHA），它們都是我國目前依法允許應(yīng)用的3 種主要食品添加劑，既可單獨應(yīng)用又可綜合應(yīng)用。研究結(jié)果表明，以上3 種抗氧化劑一旦過量應(yīng)用就會對人體健康產(chǎn)生不利作用，最嚴重的時候還會引發(fā)前列腺癌等各種疾病，所以GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》 對這3種抗氧化劑的使用量都有明確要求，單獨使用不得高于0.2 g/kg。食品中抗氧化劑的分析檢測方法較多，隨著現(xiàn)代分析檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，目前常見的主要是氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜法等[1]。這些方法的處理較為復(fù)雜，耗費試劑較大，容易在處理過程中造成待測物的喪失和損傷，從而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問題。通過固相萃取法結(jié)合高效液相色譜檢測大豆油中的3 種抗氧化劑，對該方法的平均回收率、精密度等方法學(xué)參數(shù)進行了分析考察，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果顯示該方式簡單安全，操作簡便，消耗試劑較少。同時對該實驗方法進行不確定分析，建立數(shù)學(xué)模型，研究影響結(jié)果的各個不確定度分量，找出關(guān)鍵影響不確定度大小分量，為實驗室進行抗氧化劑不確定評定時提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Ultimate 3000 高效液相色譜儀（紫外線和熒光檢測器，處理軟件采用變色龍工作站），美國賽默飛世爾科技(中國)公司；Raykol Fotector 全自動固相萃取儀，?？萍瘓F股份有限公司；PlusRaykol EVA-60全自動氮吹平行濃縮儀，?？萍瘓F股份有限公司；5430R 高速冷凍離心機（最大轉(zhuǎn)速為6 000 r/min），德國艾本德公司；AL204/01 分析天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 主要試劑和材料

1.2.1 試劑

乙腈（色譜純），美國賽默飛公司；甲酸（色譜純），美國賽默飛公司；甲醇（色譜純），美國賽默飛公司；正己烷（分析純），上海泰坦科技股份有限公司；無水硫酸鈉（分析純），上海泰坦科技股份有限公司；BHA、BHT、TBHQ 標準品（1 000 mg/L，純度均≥98%），北京壇墨質(zhì)檢公司。

1.2.2 材料

C18固相萃取柱，2 000 mg/12 mL；壓榨一級大豆油：市場購買。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

采用GB 5009.32-2016 《食品安全國家標準 食品中9 種抗氧化劑的測定》第一法高效液相色譜法，對一級大豆油的試樣進行提取、凈化、洗脫、回收、富集和用50 ℃氮氣吹至干，最后用0.22 μm 有機相微孔濾膜過濾，再進行進一步分析測定。

1.3.2 樣品標準儲備液和標準混合工作液的配制

TBHQ、BHT、BHA 混合標準儲備液的配制：先準確稱取3 種抗氧化劑的固體標準品各25 mg（精確至0.01 g），再用乙腈稀釋后溶解并定容至25 mL的容量瓶中，混合配制成濃度為10 g/L 的單標儲備液，然后放入冰箱中冷藏備用。

TBHQ、BHT、BHA 混合標準工作液的配制：先移取適量的3 種抗氧化劑的混合標準儲備液，依次稀釋成濃度為0、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L、100.0 mg/L 的工作標準溶液。

1.3.3 儀器方法

色譜條件：C18色譜柱，柱長250 mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑為5 μm；流動相A：0.5%甲酸水溶液，流動相B：甲醇；洗脫梯度：0～2 min 時，流動相A為45%；2～8 min 時，流動相A 從45%降至5%；8～14 min 時，流動相A 為5%；14～14.1 min 時，流動相A 從5%增至45%；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；測定波長：280 nm。

2 結(jié)果和討論

2.1 線性方程及相關(guān)系數(shù)

將濃度為20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0mg/L、100.0 mg/L 混標溶液分別進樣，建立標準曲線。以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，分析所得的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1，由結(jié)果可得知，三組分的線性關(guān)系良好，且相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表1 3 種抗氧化劑的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法精密度及回收率

2.2.1 方法精密度

用濃度為6.0 mg/L 的3 種抗氧化劑混合溶液，在同一條件下進樣6 次，得到的RSD 值在0.58%～0.92%范圍內(nèi)，6 次平行實驗結(jié)果見表2。

表2 方法精密度

2.2.2 方法回收率

向空白試樣基質(zhì)中進行試樣的加標實驗，并測定回收率，共平行測定5 次，分析結(jié)果為空白試樣加標回收率在99.88%～102.86%范圍內(nèi)，結(jié)果見表3。

根據(jù)表2～表3 可知，方法精密度和回收率都能滿足樣品的測定要求。

3 大豆油中TBHQ、BHT、BHA 的不確定度分析

3.1 數(shù)學(xué)模型的建立

3.2 不確定度分量的分析與評定

3.2.1 大豆油稱量過程中，引入的不確定度Urel（M）

（1）電子天平自身引入標準不確定度U（M1）

根據(jù)本實驗使用的電子天平校準證書可知其最大允許偏差為±0.2 mg，按照矩形分布，，電子天平允差的標準不確定度為：

（2）稱樣重復(fù)性引入的標準不確定度U（M2）

稱樣過程都是經(jīng)過去皮和稱樣兩次質(zhì)量相減，從而得到大豆油質(zhì)量M，因此其稱量的標準不確定度為：

因此，稱量1 g 大豆油的相對標準不確定度為：

3.2.2 TBHQ、BHT、BHA 標準物質(zhì)和配制其混合標準溶液時[2]，所帶來的不確定度Urel（std）。

3.2.2.1 三種主要抗氧化劑標準品純度所引入的相對標準不確定度Urel（C）

查閱3 種抗氧化劑的出產(chǎn)標準證書，TBHQ 相對擴展不確定度為0.2%，k=2；BHT 相對擴展不確定度為0.1%，k=2；BHA 相對擴展不確定度為0.1%，k=2。由此，標準品純度所帶來的相對標準不確定度可以計算為：

3.2.2.2 三種抗氧化劑儲備液與標準溶液的配制所引入的相對標準不確定度Urel（V）

（1）3 種抗氧化劑儲備液配制使用所引入的不確定度Urel（V1），主要涵蓋了稱量25 g 標準品單標所使用的天平引入的相對標準不確定度Urel（V1-A），以及使用25 mL 容量瓶定容所引入的相對標準不確定度Urel（V1-B）。

根據(jù)3.2.1，稱量25 g 標準品天平引入的相對標準不確定度為：

使用25 mL 容量瓶來定容時所引入的相對標準不確定度Urel（V1-B）包含容量瓶自身引入的相對標準不確定度Urel（V1-B1）以及實驗室溫度引入的相對標準不確定度Urel（V1-B2）。

經(jīng)查詢，實驗室使用的A 類25 mL 容量瓶最大誤差為±0.03 mL，考慮均勻分布的情況，，因此該指標標準不確定度為：

在使用25 mL 容量瓶時，相對標準不確定度計算為：

在實驗室中，由于室溫變化難以保持在20 ℃，故若充分考慮定容時實驗室溫度在（20±2）℃條件下進行，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，若考慮溫度變化時遵循矩形分布規(guī)律，且包含因子，則由室溫變化時所產(chǎn)生的標準不確定度為；

室溫變化所帶來的相對標準不確定度為：

所以，用25 mL 容量瓶定容時所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V1-B）為：

（2）3 種抗氧化劑儲備液配制所引入的不確定度Urel（V2）

3 種抗氧化劑標準溶液稀釋系列見表4 所示。

表4 標準溶液系列稀釋過程所使用的器具

由于配制標準溶液過程中，必須使用50 mL 容量瓶和1 mL 移液器[3]，所以，這2 種器具的實際運用中可能會產(chǎn)生的相對標準不確定度為Urel（V250）和Urel（V21）。

50 mL 單標容量瓶定容過程所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V250）又涵蓋50 mL 容量瓶自身產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V250A）和實驗室溫度變化所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V250B），具體參見3.2.2.2 。

實驗室中50 mL 容量瓶均為國準A 級，最大允差為±0.05 mL，考慮到服從均勻分布規(guī)律，所以標準不確定度為：

50 mL 單標容量瓶的相對標準不確定度為：

溫度引入的標準不確定度為：

溫度的變化所帶來的相對標準不確定度為：

在標準溶液配制過程中，共使用了50 mL 容量瓶5 次，而每次使用50 mL 單標容量瓶所產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

5 次使用所帶來的相對標準不確定度為：

同理，由1 mL 移液器所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V21）又涵蓋了1 mL 移液器自身引入的相對標準不確定度Urel（V21A）以及實驗室溫度變化所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V21B）。

查詢校準證書，1 mL 移液器[4]的擴展不確定度U=1.0×10-2mL，k=2，所以，1 mL 移液器自身所引入的標準不確定度為：

根據(jù)3.2.2.2，溫度引入的標準不確定度為：

因此，1 mL 移液器引入的標準不確定度為：

在3 種抗氧化劑的混合標準系列溶液的配制使用過程中，1 mL 移液器共使用了5 次，移液量分別為0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 各一次，而這些使用過程所產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

所以，3 種抗氧化劑儲備液配制使用過程所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（V2）為：

3 種抗氧化劑儲備液和標準溶液的配制使用過程所產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

綜上所述，TBHQ、BHT、BHA 標準物質(zhì)和配制3種抗氧化劑混合標準溶液時，所帶來的不確定度Urel（std）分別為：

3.2.3 固相萃取過程引入的相對不確定度Urel（G）

固相萃取包括樣品的上柱、洗脫、濃縮和復(fù)溶等步驟，要確定每一步引入的不確定度較為困難和復(fù)雜，本實驗采用空白樣加標回收率來表示固相萃取過程引入的不確定度。在空白油樣中加入8.0 mg/L三種抗氧化劑的混標溶液進行回收實驗，5 次加標回收的測定結(jié)果為7.86、7.89、7.93、8.05、8.10，平均回收率為99.58%，相對標準偏差RSD 為1.31%，因此相對標準不確定度為：

3.2.4 液相色譜儀引入的相對標準不確定度Urel（Y）

液相色譜儀所產(chǎn)生的不確定度分量可以由進樣裝置的重復(fù)性[5]來表示，查閱液相色譜的技術(shù)參數(shù)，進樣體積為50 μL，進樣的重現(xiàn)性≤0.5%，考慮按照矩形分布規(guī)律，，所以液相色譜進樣所產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

3.2.5 標準校準曲線所引入的相對標準不確定度Urel（Cel）

本實驗中，共使用了6 種不同濃度的混合標準溶液[6]，分別為0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L，詳見表5。每個濃度測2 次后取平均值，樣品溶液測定4 次取平均值，然后擬合得到3 種抗氧化劑的線性方程見表5。通過標準曲線校正，所帶來的不確定度計算公式為：

表5 標準曲線擬合引入的不確定度

根據(jù)公式計算，b 為斜率，a 為截距，P 為標準試樣測定的次數(shù)，P=4，n 為標準溶液測定次數(shù)（6 個點，每點測定2 次，故n=12），S(yTBHQ)=0.00202、S(yBHA)=0.00104、S(yBHT)=0.00086，標準不確定度見表5。

因此，標準曲線擬合所帶來的相對不確定度計算為：

3.2.6 回收率所帶來的不確定度Urel（R）

該方法通過5 次平行測定，加標回收率分別達到為：99.85%、98.65%、98.36%、100.12%、100.05%、100.1%、100.0%，平均值為99.505%，標準偏差為：

標準不確定度為：

因此，樣品加標回收率的相對標準不確定度為：

3.2.7 合成相對標準不確定度Urel（X）及擴展不確定度U

3 種抗氧化劑的各相對不確定度分量見表6。

合成相對標準不確定度為：

根據(jù)JJF 1059.1—2012 《測量不確定度評定與表示》，本實驗中的方法采用了置信水平為95%，因此擴展因子k=2，擴展不確定度為：

本實驗TBHQ 的測定結(jié)果為（0.0128±0.00176）g/kg（k=2）；BHA 的測定結(jié)果為（0.0144±0.00198）g/kg（k=2）；BHT 的測定結(jié)果為（0.0140±0.00192）g/kg（k=2）。

4 結(jié)論

通過采用固相萃取—高效液相色譜法對大豆油中3 種抗氧化劑（TBHQ、BHT、BHA）的測定，對整個實驗過程可能引入的不確定度來源進行充分詳細的分析，通過對實驗方法回收率、精密度等測定，確定該方法測量結(jié)果的準確性和可靠性。通過對實驗結(jié)果不確定度評估分析，數(shù)據(jù)表明儲備液和標準溶液的配制、樣品回收、固相萃取過程、標準曲線擬合對結(jié)果的不確定度影響較大，樣品稱量和液相色譜進樣的影響可忽略不計。通過對抗氧化劑含量在大豆油中不確定度的分析，提示我們實驗人員在實驗操作過程中要精準配制儲備液和標準溶液，正確使用移液器和各種玻璃器，固相萃取過程要嚴格按實驗步驟進行，同時要精準稱量實驗樣品，選擇合適的標準曲線濃度范圍，以此來減少測量結(jié)果的不確定性，從而獲得更準確的測定結(jié)果。通過固相萃取—高效液相色譜法對大豆油中3 種抗氧化劑（TBHQ、BHT、BHA）含量不確定度評定，有助于提高實驗操作的精準化和科學(xué)性，同時也為糧食質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供可靠參考，更好地保障了糧食安全。