二甲雙胍通過AMPK/PPAR-γ 通路誘導(dǎo)自噬抑制高糖對血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用

張紫微 ，鄭甲林 ，許曉宇 ，王 紅

（1）云南省阜外心血管病醫(yī)院冠心病中心，云南 昆明 650032;2）昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，云南 昆明 650500）

糖尿病顯著增加了心血管疾病的發(fā)病率和病死率，深入研究糖尿病合并冠心病的分子機(jī)制并在此基礎(chǔ)上尋找新的治療靶點(diǎn)，對防治糖尿病合并血管病變具有重要的意義。糖尿病高糖環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）的異常增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)換等[1-2]，可促進(jìn)高血壓、腦卒中、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。高血糖是最常見的糖尿病合并慢性血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素之一，其能通過多種機(jī)制影響動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。

自噬即細(xì)胞對自身的吞噬作用，指細(xì)胞通過形成自噬溶酶體消化自身大分子蛋白及細(xì)胞器的降解過程，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。有證據(jù)顯示自噬可參與多種因素引起的VSMCs 增殖[4]、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[5]、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)[6]，炎性反應(yīng)、脂質(zhì)沉積[7]等活動(dòng)，從而參與動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展。目前有關(guān)高糖環(huán)境下對血管平滑肌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)以及自噬如何參與調(diào)節(jié)VSMCs 生物功能學(xué)的報(bào)道甚少。

二甲雙胍（Metformin）是臨床上常用降糖藥，除了降糖作用以外，其還具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎等多重廣泛機(jī)制抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[8-9]，其中，二甲雙胍通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用也越來越受到重視，如其可通過促進(jìn)Krueppel樣因子2（krueppel-like factor 2，KLF2）介導(dǎo)的自噬抑制泡沫細(xì)胞的形成[10]，還可通過調(diào)節(jié) Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的自噬降解抑制血管鈣化起到抗動(dòng)脈硬化作用[11]。本文以小鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對象，觀察自噬是否參與高糖促進(jìn)VSMCs 的增殖，二甲雙胍能否通過干預(yù)自噬影響高糖促進(jìn)VSMCs 增殖作用，進(jìn)一步探討自噬在高糖對VSMCs 的作用及可能治療方向，為臨床糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供新的手段及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（北納生物，批號(hào)：BNCC338213），高糖型DMEM 培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol/L）、低糖型DMEM 培養(yǎng)基（葡萄糖濃度5.6 mmol/L）（HyClone，USA），15%胎牛血清（Gibco，USA），0.25% EDTA 胰蛋白酶（Sigma，USA），PVDF 膜（廣銳生物，中國），細(xì)胞裂解液（碧云天生物，中國），EDU 檢測試劑盒（碧云天生物，C0078S），單克隆抗體：LC3B 單抗（Abcam，ab51520），Becline-1（Proteintech，USA），p-AMPK/AMPK（Proteintech，USA），PPAR-γ（Proteintech，USA），β-actin（Proteintech，USA），二甲雙胍（Medchemexpress，USA），雷帕霉素（Sigma，USA），Compound C（Abcam，USA），GW9662（Abcam，USA），二抗IgG-HRP（碧云天生物，中國），BCA法蛋白定量檢測試劑盒（碧云天生物，中國），ECL 顯色試劑盒（碧云天生物，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VSMCs 培養(yǎng)及分組將小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞重懸于15%胎牛血清、1% 雙抗的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中。輕柔操作重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d 更換1 次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至80%～90%用0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1∶2～1∶4 比例傳代，共傳 3～5 代，選處于對數(shù)生長期的的細(xì)胞分為不同處理組進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)EDU 染色法檢測小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖，接種細(xì)胞于24 孔板培養(yǎng)24 h并同步化細(xì)胞，按不同處理分為8 組：對照組、高糖組、二甲雙胍組、高糖+二甲雙胍組、高糖+雷帕霉素組、高糖+二甲雙胍組+Compound C 組、高糖+二甲雙胍組+GW9662 組、高糖+二甲雙胍組+雷帕霉素組。二甲雙胍濃度為10 mmol/L，作用24 h，雷帕霉素濃度為100 nmol/L，Compound C 濃度為10 μmol/L，GW9662 濃度為10 μmol/L，作用24 h。按1 000∶1 的比例稀釋EDU 溶液，細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后加入200 μL 濃度10 μmol/L 的EDU培養(yǎng)液孵育2 h 時(shí)，余按 EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書繼續(xù)操作，熒光顯微鏡下每組隨機(jī)選5個(gè)視野拍照觀察。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-I、Becline-1、p-AMPK/AMPK、PPAR-γ 蛋白表達(dá)，將各組細(xì)胞分別處理，每個(gè)處理組3 個(gè)樣本，加入100 μL RIPA 裂解液，30 min；4℃，12，000 r/min 離心5 min；取上清，BCA 法定量檢測蛋白，取等量蛋白于10% SDSPAGE 進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉室溫下?lián)u床封閉，加入一抗以1∶1 000 稀釋，4℃孵育過夜；加入二抗1∶5 000 稀釋，室溫孵育2 h，漂洗，配制ECL 顯影劑于凝膠顯影儀上曝光顯影，用Bio-Rad Quantity One 軟件定量分析。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察不同處理組細(xì)胞自噬體收集對照組、高糖組、高糖+二甲雙胍組血管平滑肌細(xì)胞，使用2.5%戊二醛在4 ℃過夜，然后用ddH2O 漂洗，鋨酸固定1 h，乙醇及丙酮梯度脫水；再經(jīng)滲透、樹脂包埋、聚合后，制備70 nm 厚度的切片；使用醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，MORADA G2 電鏡下觀察3 組平滑肌細(xì)胞自噬小體的數(shù)量并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采取Tukey 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍、雷帕霉素逆轉(zhuǎn)高糖抑制VSMCs自噬的作用

將小鼠VSMCs 分為對照組（5.6 mmol/L 葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L 葡萄糖）、高糖+二甲雙胍（10 mmol/L）、高糖+雷帕霉素（100 nmol/L）四組，觀察不同組VSMCs 自噬蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)下VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-I、Becline-1 蛋白較對照組表達(dá)水平降低（P<0.001），提示高糖培養(yǎng)抑制VSMCs 自噬水平，而二甲雙胍及自噬促進(jìn)劑雷帕霉素可促進(jìn)高糖培養(yǎng)下的VSMCsLC3-Ⅱ/LC3-I、Becline-1 表達(dá)水平升高（P<0.001），提示二甲雙胍、雷帕霉素可作為自噬誘導(dǎo)劑，促進(jìn)VSMCs 發(fā)生自噬，并逆轉(zhuǎn)高糖抑制VSMCs 自噬的作用。電鏡顯示高糖培養(yǎng)下VSMCs 自噬小體計(jì)數(shù)較對照組降低，而二甲雙胍可顯著增加高糖培養(yǎng)下VSMCs 自噬小體的數(shù)量，證實(shí)二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)的VSMCs 受抑制的自噬，見圖1。

圖1 二甲雙胍對高糖培養(yǎng)下的VSMCs 自噬水平的影響Fig.1 Effect of metforin on autophagy in HG-cultured VSMCs

2.2 AMPK、PPAR-γ 抑制劑增加高糖抑 制VSMCs 自噬的作用

將小鼠VSMCs 分為對照組、高糖組、AMPK抑制劑Compound C（10 μmol/L）+高糖組，PPARγ 抑制劑GW9662（10 μmol/L）+高糖組共4 個(gè)處理組，用Western blot 檢測自噬蛋白LC3 及Becline-1 表達(dá)水平，Western Blot 結(jié)果顯高糖抑制VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Becline-1 表達(dá)（P<0.001），而AMPK 抑制劑、PPAR-γ 抑制劑可進(jìn)一步抑制高糖培養(yǎng)下VSMCs 相關(guān)自噬蛋白的表達(dá)（P<0.05），見圖2。

圖2 AMPK、PPAR-γ 抑制劑對VSMCs 自噬的影響Fig.2 Effect of AMPK or PPAR-γ inhibitor on autophagy in VSMCs

2.3 二甲雙胍逆轉(zhuǎn)高糖對AMPK/PPAR-γ 通路的負(fù)調(diào)控

將小鼠VSMCs 分為對照組、高糖組、MET+高糖組，Compound C+高糖組4 個(gè)處理組，檢測不同組p-AMPK/AMPK 表達(dá)情況，結(jié)果顯高糖抑制VSMCs p-AMPK/AMPK 表達(dá)（P<0.001），二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)高糖抑制AMPK 通路激活（P<0.001），而使用AMPK 抑制劑后進(jìn)一步增強(qiáng)高糖抑制AMPK 通路激活的作用（P<0.01）。用高糖、MET+高糖，GW9662+高糖預(yù)處理，檢測不同組PPAR-γ 表達(dá)情況，結(jié)果顯高糖抑制VSMCs PPAR-γ 表達(dá)（P<0.001），二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)其作用（P<0.01），而使用PPAR-γ 抑制劑后進(jìn)一步增強(qiáng)高糖抑制 PPAR-γ 表達(dá)的作用（P<0.05），見圖3。

圖3 二甲雙胍對高糖培養(yǎng)下VSMCs p-AMPK/AMPK、PPAR-γ 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of metformin and high glucose on p-AMPK/AMPK、PPAR-γexpression of VSMCs

2.4 二甲雙胍抑制高糖促進(jìn)的VSMCs 增殖

將小鼠VSMCs 分為對照組、高糖組、二甲雙胍組、高糖+二甲雙胍組、高糖+雷帕霉素組、高糖+二甲雙胍組+Compound C 組、高糖+二甲雙胍組+GW9662 組、高糖+二甲雙胍組+雷帕霉素組8個(gè)處理組，EDU 染色細(xì)胞檢測不同組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示高糖促進(jìn)VSMCs 增殖（P<0.05），MET 及RAP 抑制高糖促進(jìn)的VSMCs 增殖作用，且MET 可進(jìn)一步增強(qiáng)RAP 抑制高糖促進(jìn)的VSMCs 增殖作用（P<0.001）。而使用AMPK 抑制劑Compound C 及PPAR-γ 抑制劑GW9662 后可逆轉(zhuǎn)MET 抑制HG 促進(jìn)VSMCs 增殖的作用（P<0.05），見圖4。

圖4 二甲雙胍抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs 增殖Fig.4 Effect of metformin on high glucose-induced proliferation of VSMCs

3 討論

高血糖是最常見的糖尿病合并慢性血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素之一，能通過多種機(jī)制影響動(dòng)脈硬化的進(jìn)展，如可能促進(jìn)糖基化終末產(chǎn)物的形成，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)誘發(fā)VSMCs 增殖[12-13]，脂質(zhì)代謝紊亂[14]，影響各種生長因子的分泌及表達(dá)，氧化應(yīng)激等[15]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高糖還可通過調(diào)節(jié)自噬參與多種心血管疾病病理生理。如Liu 等[16]報(bào)道高糖可通過AMPK 通路介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬促進(jìn)其凋亡，而Xu 等[17]報(bào)道高糖抑制心肌細(xì)胞自噬并促進(jìn)其凋亡，可能導(dǎo)致糖尿病心肌疾病的發(fā)生。研究證實(shí)VSMCs 的自噬可通過多種形式參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程發(fā)展，本課題組前期工作也發(fā)現(xiàn)自噬參與血管緊張素II 誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[5]，但高糖是否通過自噬參與VSMCs 增殖及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。

二甲雙胍作為目前臨床最常用的降糖用藥之一，既往研究顯示其還有改善內(nèi)皮功能[18]、改善胰島素抵抗[19]，減少平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)換[20]，抗氧化應(yīng)激等[21]抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。近年來有研究顯示二甲雙胍通過調(diào)節(jié)自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化，如其可通過調(diào)節(jié)長鏈非編碼RNA ?；撬嵘险{(diào)基因1 誘導(dǎo)自噬，抑制血管壁細(xì)胞增殖從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[22]，還可通過上調(diào)Kruppel 樣因子2 介導(dǎo)的自噬抑制APOE 基因敲除的小鼠動(dòng)脈硬化進(jìn)程及斑塊易損性[10]。本研究通過檢測LC3、Becline-1 等自噬相關(guān)蛋白及電鏡檢測自噬小體等方法發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)顯著抑制VSMCs自噬水平，使用二甲雙胍、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素促進(jìn)自噬水平并抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs 增殖，筆者推測高糖培養(yǎng)可通過抑制自噬調(diào)控促進(jìn)VSMCs增殖。與自噬激動(dòng)劑雷帕霉素一樣，二甲雙胍亦可通過促進(jìn)自噬并抑制高糖培養(yǎng)的VSMCs 增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)雷帕霉素促進(jìn)自噬并抑制高糖促進(jìn)VSMCs 增殖的作用，二甲雙胍聯(lián)合雷帕霉素可進(jìn)一步增強(qiáng)其抑制VSMCs 增殖的作用，見圖4，提示不同機(jī)制自噬激活劑的聯(lián)合可進(jìn)一步增強(qiáng)抑制高糖促VSMCs 增殖的作用。

AMPK/PPAR-γ 通路廣泛參與細(xì)胞代謝和糖代謝過程，也參與調(diào)節(jié)自噬[23-24]，本研究證實(shí)高糖環(huán)境下可抑制VSMCs AMPK/PPAR-γ 通路的激活，二甲雙胍則可激活A(yù)PMK/PPAR-γ 通路，并逆轉(zhuǎn)高糖抑制AMPK/PPAR-γ 通路的作用。是否AMPK/PPAR-γ 通路參與高糖抑制的VSMCs自噬，為進(jìn)一步證實(shí)自噬參與二甲雙胍抑制的VSMCs 增殖并探究其機(jī)制，筆者使用PPAR-γ抑制劑GW9662 及AMPK 抑制劑Compound C 后發(fā)現(xiàn)其可進(jìn)一步增強(qiáng)高糖抑制VSMCs 自噬的作用，見圖2，并削弱二甲雙胍抑制細(xì)胞增殖的作用，提示自噬可能參與高糖誘導(dǎo)的VSMCs 增殖，高糖可能通過抑制AMPK/PPAR-γ 通路抑制VSMCs自噬，從而進(jìn)一步促進(jìn)VSMCs 增殖，這可能是自噬參與的機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下促進(jìn)VSMCs增殖可能是自噬依賴性的，高糖可通過抑制VSMCs 自噬促進(jìn)其增殖，而使用而二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK/PPAR-γ 通路上調(diào)VSMCs 自噬水平，抑制高糖促進(jìn)的VSMCs 異常增殖，這為糖尿病合并血管病變提供了一個(gè)新的治療方向。