梁紅妍 申笙 孫劍

一、乙型肝炎感染現(xiàn)狀

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的重要公共問題。據(jù)WHO報(bào)道,全球約有2.96億慢性HBV感染者[1],而我國(guó)約有8 600萬(wàn)例,其中有慢性乙型肝炎(CHB)患者約2 800萬(wàn)例,每年因肝硬化、肝衰竭、肝癌等乙型肝炎相關(guān)疾病死亡的人數(shù)約為30萬(wàn)[2]。CHB患者接受現(xiàn)有的一線抗病毒藥物治療,如核苷(酸)類似物(NAs)或干擾素(IFN),可有效抑制HBV復(fù)制,延緩肝臟疾病進(jìn)展,減少肝硬化和HCC的發(fā)生,從而改善患者預(yù)后[3]。然而,現(xiàn)有的抗病毒治療方案并不能清除HBV感染而達(dá)到完全治愈,其根本原因是肝細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)存在的HBV基因組共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。

二、乙型肝炎治愈的關(guān)鍵

cccDNA可通過細(xì)胞外循環(huán)及細(xì)胞內(nèi)循環(huán)進(jìn)行補(bǔ)充,并以微染色體形式長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于肝細(xì)胞核內(nèi),它是HBV病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板,不易被清除。因此,能否清除cccDNA是慢性乙型肝炎患者能否實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈的關(guān)鍵[4]。目前,關(guān)于乙型肝炎治愈,其一是指乙型肝炎的臨床治愈,又稱功能性治愈,是指停止治療后HBsAg持續(xù)陰性,伴或不伴抗-HBs出現(xiàn),HBV DNA低于最低檢測(cè)下限,肝臟生物化學(xué)指標(biāo)正常,肝細(xì)胞核內(nèi)可能仍存在cccDNA。其二,指乙型肝炎的完全治愈,又稱病毒學(xué)治愈,是指停止治療后HBsAg持續(xù)陰性,伴或不伴抗-HBs出現(xiàn),HBV DNA低于最低檢測(cè)下限,肝臟生物化學(xué)指標(biāo)正常,同時(shí)肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA被清除[3]。臨床治愈和完全治愈最為重要的區(qū)別是cccDNA是否被清除。

三、cccDNA的生命周期

HBV屬于嗜肝DNA病毒,其內(nèi)含約3.2 kb大小的松弛環(huán)狀雙鏈DNA(rcDNA)。HBV病毒顆粒通過結(jié)合肝細(xì)胞膜上的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽受體(NTCP)侵入肝細(xì)胞[5],隨后其基因組rcDNA被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核,并通過一系列環(huán)節(jié)被修復(fù)成cccDNA,具體包括:(1)在宿主因子作用下去除rcDNA負(fù)鏈5′端共價(jià)結(jié)合的病毒聚合酶Pol以及5’-flap;(2)去除rcDNA正鏈5′端的RNA引物;(3)在宿主聚合酶及修復(fù)因子的作用下,完成rcDNA正鏈的修復(fù);(4)連接正負(fù)鏈,并進(jìn)一步折疊、扭曲形成超螺旋結(jié)構(gòu)的cccDNA;(5)cccDNA與組蛋白、非組蛋白等結(jié)合,形成微染色體樣結(jié)構(gòu)[6]。cccDNA可由病毒顆粒經(jīng)上述所謂的從頭合成途徑,也可經(jīng)rcDNA胞內(nèi)復(fù)制的回補(bǔ)途徑形成,并在感染肝細(xì)胞核內(nèi)蓄積為cccDNA池,導(dǎo)致HBV感染慢性化。

Wei等利用酵母細(xì)胞系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的五種修復(fù)因子:增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、復(fù)制因子C(RFC)復(fù)合物、DNA聚合酶δ(POLδ)、瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1(FEN-1)和DNA連接酶1(LIG1),可在體外將HBV rcDNA修復(fù)為cccDNA[7],并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)rcDNA正、負(fù)鏈的修復(fù)是相互獨(dú)立的,其中正鏈的修復(fù)需要這五種修復(fù)因子的參與,而負(fù)鏈的修復(fù)只需要FEN-1和LIG1[8]。

四、清除cccDNA的策略

為實(shí)現(xiàn)乙型肝炎的臨床治愈甚至完全治愈,cccDNA的清除是科學(xué)家們致力攻克的難題?？偨Y(jié)近年來(lái)關(guān)于HBV cccDNA的研究進(jìn)展,我們認(rèn)為cccDNA的清除有可能通過以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。

(一)直接靶向cccDNA 持續(xù)和穩(wěn)定存在的cccDNA是造成HBV感染慢性化的關(guān)鍵因素。因此,直接靶向cccDNA顯然是一個(gè)非常具有吸引力的治療策略,但該研究策略有賴于對(duì)cccDNA形成機(jī)制的充分認(rèn)識(shí)和了解。目前已發(fā)表的研究表明,多種小分子抑制劑通過靶向參與cccDNA形成過程的宿主修復(fù)因子能有效減少cccDNA,包括DNA聚合酶α和δ抑制劑(aphidicolin)、FEN-1核酸內(nèi)切酶抑制劑PTPD、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、DNA連接酶抑制劑以及DNA檢查點(diǎn)激酶ATR和CHK1抑制劑[9]。然而,上述通過靶向宿主DNA修復(fù)途徑治療慢性HBV感染的方法是否安全和具有可行性,仍需要進(jìn)一步研究。此外,基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù),可以準(zhǔn)確有效地靶向HBV基因組,抑制病毒基因表達(dá),顯著抑制HBV復(fù)制,從而減少cccDNA的形成[10]。然而,基因編輯技術(shù)可能存在的脫靶效應(yīng)、缺乏合適的體內(nèi)遞送載體,以及是否會(huì)影響宿主基因組或線粒體DNA等,仍是需要解決的未知挑戰(zhàn)。

Wang等[11]通過在HBV感染的人原代肝細(xì)胞和HepDES19細(xì)胞中進(jìn)行高通量篩選,發(fā)現(xiàn)了一種可降低cccDNA水平的小分子化合物ccc_R08,并在環(huán)狀HBV(HBV circle)小鼠模型及人肝嵌合小鼠模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。 該研究結(jié)果顯示,ccc_R08可降低小鼠血清中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、pgRNA及肝細(xì)胞中的cccDNA水平,這是首次發(fā)現(xiàn)有小分子可作用于已建立的cccDNA庫(kù),為徹底治愈CHB患者提供了一種新的途徑。

(二)通過表觀調(diào)控機(jī)制抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄 cccDNA作為病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的模板,通過與組蛋白和非組蛋白等結(jié)合形成微染色體結(jié)構(gòu)。既往研究表明,cccDNA的組蛋白修飾是調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的重要方式,而其中組蛋白甲基化和乙?；悄壳把芯枯^為明確的能調(diào)控cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的修飾方式。參與表觀遺傳修飾的宿主因子,如蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1、PRMT1、PRMT5等,可通過調(diào)控cccDNA組蛋白甲基化水平影響cccDNA轉(zhuǎn)錄功能;而組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶如p300、CBP、HAT1等,以及組蛋白去乙酰化酶如HDAC1、HDAC11等,則通過調(diào)控cccDNA組蛋白乙酰化水平影響cccDNA轉(zhuǎn)錄活性[6, 12-13]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),代謝物如中草藥提取物姜黃素可通過下調(diào)cccDNA組蛋白乙?；竭M(jìn)而抑制HBV復(fù)制[14]。

同時(shí),cccDNA轉(zhuǎn)錄也受到其他宿主因子和病毒蛋白的調(diào)控。例如近期研究發(fā)現(xiàn),HBx可以通過與宿主因子DDB1相互作用,從而劫持宿主泛素連接酶CUL4A/B,通過泛素化降解SMC5/6復(fù)合物,解除SMC5/6對(duì)cccDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制[15]。因此,HBx蛋白是抗病毒藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。Cheng等基于HiBiT-tagged HBx蛋白檢測(cè)系統(tǒng),成功篩選出靶向HBx的小分子化合物雙香豆素。該研究在HBV感染的細(xì)胞模型和人源化肝臟小鼠模型中證明,雙香豆素可顯著促進(jìn)HBx蛋白降解,進(jìn)而顯著抑制HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),雙香豆素是細(xì)胞NQO1的抑制劑,能解除NQO1對(duì)HBx蛋白的保護(hù)作用,從而促進(jìn)HBx蛋白經(jīng)泛素非依賴的20S蛋白酶體途徑降解。該研究極大地鼓舞了靶向HBx蛋白的新型抗HBV藥物的開發(fā)[16]。

(三)耗竭cccDNA池 目前的一線抗病毒藥物NAs,其作用機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)性抑制HBV DNA聚合酶的活性,從而顯著抑制rcDNA的合成,以阻斷cccDNA的合成,理論上有耗竭cccDNA池的可能[3]。

cDNA主要在核衣殼中逆轉(zhuǎn)錄合成,而包裹rcDNA的核衣殼是cccDNA胞內(nèi)外循環(huán)補(bǔ)充的唯一來(lái)源。因此,抑制病毒核衣殼組裝,可以抑制rcDNA的形成,從而減少cccDNA的補(bǔ)充,是目前抗HBV藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。HBV核衣殼抑制劑與HBV的核心蛋白結(jié)合,可導(dǎo)致所形成的病毒衣殼的構(gòu)象發(fā)生改變,具體可分為兩類:一類是促進(jìn)核衣殼的降解,從而形成非衣殼的核心蛋白聚合物,主要包括GLS4、RO7049389等;另一類是促進(jìn)形成形態(tài)正常而缺乏病毒核酸的空心核衣殼,主要包括ABI-H0731、JNJ6379等[17]。

我們團(tuán)隊(duì)最近的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,通過測(cè)定抗病毒治療過程中患者血清HBV RNA耐藥突變LAMR(rtM204V),可動(dòng)態(tài)反映肝內(nèi)cccDNA池的更新速度,并顛覆性地發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)cccDNA更新周期約5.6～11.1周[18],遠(yuǎn)快于之前估計(jì)的數(shù)十年[19]。這一結(jié)論提示有可能通過聯(lián)合治療的手段,徹底阻斷cccDNA的補(bǔ)充,從而耗竭肝內(nèi)cccDNA池以實(shí)現(xiàn)cccDNA清除。

(四)免疫調(diào)節(jié)清除cccDNA HBV持續(xù)感染與CHB患者體內(nèi)天然免疫和適應(yīng)性免疫的功能缺陷密切相關(guān)。一線抗病毒藥物IFNα可誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié),激活先天免疫和特異性免疫,以發(fā)揮抗病毒作用。而近年來(lái),聚焦于CHB的免疫治療研究日益增多,其中,天然免疫的Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑、適應(yīng)性免疫的細(xì)胞治療,以及重建免疫的治療性疫苗等的主要目的均是提高免疫系統(tǒng)的抗病毒作用[20]。然而,上述的免疫治療策略,是否能清除cccDNA,仍有待進(jìn)一步研究。

目前,HBV cccDNA的研究仍面臨許多困難和挑戰(zhàn),包括:(1)cccDNA在體內(nèi)的合成機(jī)制仍未完全闡明;(2)cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明;(3)現(xiàn)有的乙型肝炎血清標(biāo)志物不能完全準(zhǔn)確反映肝內(nèi)cccDNA的活性狀態(tài);(4)目前仍缺乏理想的研究cccDNA的細(xì)胞和動(dòng)物模型等。相信隨著研究的深入,上述困難和挑戰(zhàn)將被克服,乙型肝炎終將被治愈。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。