涂相文,曾 辛,陳俊坤,駱福裕

1.江西省贛州市婦幼保健院優(yōu)生遺傳實驗科,江西贛州 341000;2.江西省婦幼保健院檢驗科,江西南昌 330000

原發(fā)性肉堿缺乏癥(PCD)是一種由于SLC22A5基因突變引起肉堿轉(zhuǎn)運體(OCTN2)蛋白功能缺陷的常染色體隱性遺傳病。PCD臨床表現(xiàn)差異很大,且有猝死的風(fēng)險,因此,對于PCD患者無論其表現(xiàn)嚴(yán)重程度如何,均建議終生補充肉堿,及時治療長期預(yù)后良好[1]。因此,PCD的早期診斷十分重要。新生兒遺傳代謝病篩查是一種有效的疾病預(yù)防措施,可用于PCD的早期診斷[2]。PCD新生兒篩查采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)檢測干血斑中游離肉堿(FC)及多種酰基肉堿水平,并通過SLC22A5基因的遺傳分析明確診斷[3-4],編碼OCTN2的SLC22A5基因位于5q31.1,含10個外顯子[5]。由于基因診斷PCD一些致病變體可能逃避檢測[6],仍需結(jié)合生化指標(biāo)FC水平。目前,贛南地區(qū)PCD發(fā)病率及遺傳特征尚少有相關(guān)報道,PCD的基因與生化表現(xiàn)相關(guān)性尚不明確。本研究采用MS/MS技術(shù)檢測新生兒肉堿水平對PCD進行篩查,MS/MS技術(shù)篩查陽性新生兒采用第2代測序及Sanger一代測序等技術(shù)對SLC22A5基因突變類型進行分析,收集確診病例研究贛州市新生兒PCD的發(fā)病率,為PCD的臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年12月江西省贛州市出生并送檢贛州市新生兒疾病篩查中心的新生兒足底干血斑進行MS/MS技術(shù)篩查,以MS/MS技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)的所有PCD確診病例作為研究對象,接受篩查的235 644例新生兒中,男122 126例(51.83%),女113 518例(48.17%);其中足月兒(≥37周)223 997例(95.06%),早產(chǎn)兒(<37周)11 647例(4.94%)。所有研究對象家長或監(jiān)護人均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)贛州市婦幼保健院倫理委員會審核通過。

1.2MS/MS技術(shù)篩查 采集出生72 h后充分哺乳的新生兒足跟血滴于專用濾紙片,至少3個血斑,每個血斑直徑大于8 mm,血滴自然滲透,濾紙正反面血斑一致,血斑無污染、無滲血環(huán)。濾紙血片采血后平放在陰涼清潔處自然晾干,避免陽光及紫外線照射,干燥后4～8 ℃冰箱保存待檢,在采集后5個工作日內(nèi)遞送,3 d內(nèi)送至篩查中心進行檢測。在試劑盒中提供的V型底的微孔板中,用直徑為3.2 mm的打孔儀進行干血斑打孔,每個孔中只放1個血斑,使用移液器向每孔中加入100 μL含氨基酸和肉堿的內(nèi)標(biāo)工作液,用黏性封膜封套覆蓋微孔板;將微孔板放入振蕩孵育器內(nèi),(45±5)℃孵育振蕩(45±10)min,轉(zhuǎn)速750 r/min;孵育完成后取下微孔板,室溫靜置,采用移液器吸取75 μL上清液,轉(zhuǎn)移至V型底耐熱板中;采用鋁箔膜封蓋整個微孔板,壓劃鋁箔膜使其緊密包被,減少液體揮發(fā),再進行上樣檢測;將微孔板平穩(wěn)放置于2777C自動進樣器的載樣槽進行檢測。

1.3診斷流程及標(biāo)準(zhǔn) 釆用MS/MS技術(shù)對新生兒進行疾病篩查檢測干血斑FC及?；鈮A水平,初次篩查新生兒FC小于10 μmol/L或多種肉堿降低則為陽性,陽性同時召回新生兒及其母親復(fù)查,召回復(fù)查FC小于10 μmol/L或多種肉堿降低通過基因檢測明確診斷[7]。具體診斷流程見圖1。

圖1 診斷流程

2 結(jié) 果

2.1篩查確診情況 2018年1月至2021年12月共235 644例新生兒接受MS/MS技術(shù)篩查,初篩PCD陽性1 567例,復(fù)查陽性135例,最終確診35例(確診組),攜帶單基因突變18例(攜帶組),確診病例均檢測到2個等位基因突變。確診組FC水平為(5.26±1.99)μmol/L,攜帶組FC水平為(5.71±2.20)μmol/L,兩組FC水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2確診病例 35例PCD患者均經(jīng)過基因檢測,其中男17例,女18例;純合突變6例,雜合突變29例。共檢測到15種SLC22A5變異體,最常見的變異體為c.51C>G(32.86%),其次為c.1400C>G(22.86%)和c.428C>T(11.43%);檢測到的變異體大多聚集在外顯子1,占45.71%,聚集在外顯子2占14.29%,聚集在外顯子8占24.29%。確診病例FC檢測結(jié)果見表1,基因分布見表2。

表1 確診PCD病例基因突變結(jié)果及FC水平(μmol/L)

表2 PCD患者SLC22A5不同基因突變分布(n=70)

2.3不同性別、不同F(xiàn)C水平SLC22A5基因突變類型分布 不同性別SLC22A5基因突變類型分布情況比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.436,P=0.267),見表3。不同F(xiàn)C水平SLC22A5基因突變類型分布情況比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.050,P=0.042),見表4。

表3 不同性別SLC22A5基因突變類型分布比較(n)

2.4不同突變類型PCD患者FC水平比較 將PCD患者分為無義突變/錯義突變組(N/M組,n=3)和錯義突變/錯義突變組(M/M組,n=32),M/M組FC水平為5.13(3.51,6.87)μmol/L,N/M組FC水平為4.93(4.71,5.21)μmol/L,N/M組和M/M組FC水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);將PCD患者分為純合突變組(n=6)和雜合突變組(n=29),純合突變組FC水平為2.86(2.17,3.37)μmol/L,雜合突變組FC水平為5.18(4.55,7.15)μmol/L,純合突變組和雜合突變組FC水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

PCD發(fā)病機制是由于SLC22A5基因突變引起OCTN2蛋白功能缺陷[8],尿液中肉堿排出增加,血液、組織、細(xì)胞內(nèi)肉堿缺乏,從而導(dǎo)致脂肪酸β氧化障礙[9]。脂肪酸β氧化障礙引起機體多器官能量代謝失常[10],導(dǎo)致PCD患者從無臨床癥狀到生命早期急性代謝失調(diào)、生命后期進行性肥厚性心肌病,甚至因心律失常而死亡[11],因此,PCD是一種潛在的致死性疾病。PCD主要通過MS/MS技術(shù)檢測干血斑中FC水平來診斷[12],并通過SLC22A5基因的遺傳分析或檢測成纖維細(xì)胞中肉堿轉(zhuǎn)運活性明確診斷[13]。雖然肉堿轉(zhuǎn)運活性的測定是一種可靠的診斷方法,但它需要皮膚活檢應(yīng)用,因而存在局限性。因此,MS/MS技術(shù)篩查結(jié)合基因檢測是PCD診斷的主要手段。本研究通過新生兒MS/MS技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)了35例PCD患者,推斷贛南地區(qū)PCD發(fā)病率為0.01%。相關(guān)文獻顯示,PCD發(fā)病率具有明顯地域差異,澳大利亞為1∶120 000、美國通過新生兒篩查PCD的發(fā)病率約為1∶85 000[14]、泰國為1∶29 351[15],該病在法羅群島發(fā)病率最高,為1∶297[16]。PCD在我國已報道的各地發(fā)病率有所不同,泉州發(fā)病率約為1∶11 189[17]、上海約為1∶31 200[18]、浙江省約為1∶30 182[19]、柳州市新生兒PCD發(fā)病率為1∶9 332[20]。迄今為止,已報道的SLC22A5致病變異超過150種,其中大部分為錯義突變,與本研究結(jié)果一致。少數(shù)種族特異性變異已經(jīng)在多個種群中被描述,例如海南彝族c.51C>G和c.760C>T基因突變較為常見[21],C.95G>A是法羅群島的始祖變體[22],c.136C>T在美國常見[13],c.51C>G和c.760C>T 為泰國常見變異體[15]。本研究最常見的變異體為c.51C>G(〗32.86%),其次為c.1400C>G(22.86%)和c.428C>T(11.43%),然而c.1400C>G在廣州市和浙江省的研究中為最常見的變異體[19],福建泉州最常見的變異為c.760C>T[17],廣西c.51C>G為最常見的變異類型[20],山東東營c.1400C>G為最常見[23]。由此可見,c.1400C>G及c.51C>G在中國地區(qū)出現(xiàn)頻率較高,比較國際、國內(nèi)不同地區(qū)人群中的最常見突變位點有所不同。目前,新生兒患者基因型與表現(xiàn)型的相關(guān)性不明確,本研究對不同性別、FC水平的基因突變類型進行分析,認(rèn)為SLC22A5基因突變類型與性別無關(guān),不同F(xiàn)C水平的基因突變類型分布存在差異。本研究分別研究了PCD患者N/M、M/M及純合、雜合突變2個分組間的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅純合突變組與雜合突變組存在差異,純合突變組FC水平明顯低于雜合突變組,可能是因為PCD純合突變患者體內(nèi)的OCTN2轉(zhuǎn)運肉堿能力嚴(yán)重?fù)p壞甚至完全喪失,而雜合突變則保留轉(zhuǎn)運蛋白約50%的殘余功能[24]。提示在遇到純合突變PCD患者時需更加注意,因為其血漿FC水平極低,易出現(xiàn)明顯臨床表現(xiàn)。

本研究主要對新生兒PCD患者FC水平及基因突變類型進行分析,在研究中發(fā)現(xiàn)的母源性PCD未納入研究。本研究缺少對PCD臨床癥狀及治療資料的統(tǒng)計,樣本量存在局限性。因此,作者將繼續(xù)積累資料,對PCD患者進行隨訪來完善數(shù)據(jù)。

綜上所述,MS/MS技術(shù)是PCD診斷的有效手段,贛南地區(qū)PCD發(fā)病率較高,最常見的突變位點是c.51C>G。PCD患者FC水平與基因突變類型可能相關(guān),純合突變患兒FC水平較雜合突變患兒低。