人腺病毒疫苗研究進(jìn)展

王 艷 譚丙繡 侯 喆 賈雷立 李利忠 趙 瑾

1.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽合肥 230032；2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧沈陽 110122；3.解放軍疾病預(yù)防控制中心生物安全科，北京 100071；4.解放軍總醫(yī)院京北醫(yī)療區(qū)紅山口門診部，北京 100191

人腺病毒（human adenoviruses，HAdVs）于1953 年在人腺樣組織中分離出來，隨后發(fā)現(xiàn)HAdVs是導(dǎo)致美國人群呼吸道感染的主要病原體，至此HAdVs 引起學(xué)者廣泛關(guān)注[1]。截至2022 年3 月已確定了HAdVs 的111 種型別，分屬7 個不同的亞屬（A～G）。HAdVs 屬于腺病毒科、哺乳動物腺病毒屬，外部蛋白外殼呈規(guī)則的二十面體結(jié)構(gòu)，主要由240 個六鄰體、12 個五鄰體基底和12 個從五鄰體處垂直延伸的纖維蛋白組成。腺病毒可造成全身感染，近年來暴發(fā)愈發(fā)頻繁，而且不同型別有不同的組織嗜性和臨床表現(xiàn)，不同時間和地區(qū)優(yōu)勢型別也有所差異，并仍以重組的方式進(jìn)化，從而導(dǎo)致組織嗜性改變，形成高致病力、高傳染性的新型毒株，這給全球公共衛(wèi)生事業(yè)帶來極大的挑戰(zhàn)。針對其暴發(fā)流行，目前無特效抗病毒藥物，疫苗是降低感染最有效的措施。流行病學(xué)調(diào)查顯示，人4 型腺病毒（human adenovirus type 4，HAdV-4）和 人7 型腺病毒（human adenovirus type 7，HAdV-7）是呼吸道疾病暴發(fā)的常見原因[2]，因此主要的疫苗研究方向集中在這兩種型別。

1 滅活疫苗

最早的HAdVs 疫苗誕生于美國，是一種用福爾馬林殺死的二價4 型和7 型疫苗，從受感染的猴子腎組織培養(yǎng)中制備而成[3]。沃爾特里德陸軍研究所選擇12 名志愿者，每人上臂三頭肌注射1 ml該滅活疫苗，比較免疫前后血清中和抗體滴度。結(jié)果顯示志愿者對4 型、7 型和3 型產(chǎn)生的中和抗體數(shù)量都有所增加，滴度增加與自然感染疾病后基本相同，但重復(fù)注射并未優(yōu)于一次注射。隨后對疫苗的有效性進(jìn)行評估，將624 名新兵進(jìn)行隨機(jī)分組，A 組肌內(nèi)注射1 ml 疫苗，B 組為對照組，接受安慰劑，1 周后進(jìn)行第二次注射，進(jìn)行為期8 周的觀察。第1 周A 組和對照組呼吸道疾病發(fā)病率無明顯區(qū)別，到第2 周至第5 周，A 組接種者呼吸道疾病預(yù)期發(fā)病率減少了87%，之后兩組發(fā)病率相同。此試驗也發(fā)現(xiàn)接種者對3 型抗體滴度與4 型和7 型病毒的一樣高，也就是接種者不僅產(chǎn)生了4型和7 型病毒中和抗體，對3 型病毒也產(chǎn)生了一定的交叉保護(hù)[4]。然而，由于批次間變異、猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）的污染以及3 型和7 型致癌性，該疫苗在1963 年被停用。

2 減毒口服活疫苗

20 世紀(jì)60 年代，美國國防部和美國國立衛(wèi)生研究院與惠氏實驗室合作生產(chǎn)針對4 型和7 型的口服、腸道活疫苗片。在1971—1996 年在軍事基礎(chǔ)訓(xùn)練中心得到廣泛使用[5-6]。1996 年，惠氏停止生產(chǎn)該疫苗。隨后幾年腺病毒暴發(fā)水平恢復(fù)到疫苗前。2001 年由Barr 實驗室用惠氏生產(chǎn)技術(shù)繼續(xù)研究口服疫苗。2004 年對該口服疫苗進(jìn)行隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照試驗，以評估其安全性和免疫原性。30 名志愿者口服疫苗，28 名志愿者接受安慰劑藥物，隨后觀察8 周。第28 天4 型和7 型血清轉(zhuǎn)化率分別是73%和63%[6]。試驗證明該疫苗是安全的，且在研究人群中誘導(dǎo)了良好的免疫反應(yīng)。一項針對4040 名新兵的第3 期多中心隨機(jī)雙盲安慰劑對照研究中，疫苗（兩種腸溶片劑）效力為99.3%。4 型和7 型疫苗接受者的血清轉(zhuǎn)換率分別為94.5%和93.8%，結(jié)果表明該疫苗耐受性良好，且安全有效[7]。2011 年3 月新型口服4 型和7 型腺病毒活疫苗獲得美國食品和藥品管理局的許可，重新實施普遍對新兵接種[8]。2020 年，沃爾特里德陸軍研究所針對口服4 型和7 型疫苗的受試者6 年內(nèi)收集的血清樣本進(jìn)行了評估，沒有受試者表現(xiàn)出針對病毒的中和抗體滴度減弱，甚至有些受試者在接種疫苗后4 型和7 型的抗體滴度增加了4 倍，證明口服4 型和7 型活疫苗可以誘導(dǎo)長期免疫[9]。

3 重組HAdVs疫苗

2012 年，廣州醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊構(gòu)建了3 型和7 型的二價候選疫苗rAdMHE3[10]。2018 年該團(tuán)隊[11]在rAdMHE3 的E3 區(qū)表達(dá)55 型的六鄰體蛋白，構(gòu)建了重組三價人腺病毒疫苗（rAdMHE3-h55）。體外中和測定的結(jié)果表明，rAdMHE3-h55 可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對3、7 和55 型的中和抗體。此外，與未接種疫苗的小鼠相比，該疫苗的免疫完全保護(hù)了受3、7 或55 型攻擊的小鼠，顯示出較低的肺病毒載量和較少的肺部病理變化。同時，他們分別將7 型、14 型、55 型的六鄰體與3 型的進(jìn)行替換，得到四種重組體rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14 和rAd3H55。采用β-丙內(nèi)酯滅活技術(shù)將重組體等量濃度混合rAdMix，誘導(dǎo)小鼠對3、7、14 和55 型的平衡高滴度的中和抗體反應(yīng)，與野生型誘導(dǎo)的抗體滴度相差不大，并且沒有相互的免疫干擾，由此證明rAdMix 是一種針對3、7、14 和55 型新型四價候選疫苗[12]。2018 年，李瀟[13]在HAdV-3載體六鄰體蛋白的高變5 區(qū)中，插入了7 型六鄰體主要中和抗原表位，構(gòu)建了rAdMH5 重組體。在其基礎(chǔ)上，將55 型完整六鄰體插入rAdMH5 的E3區(qū)構(gòu)建了rAdMH5-h55 三價重組體。該重組體表面組合了3、7、55 型的六鄰體蛋白，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生這三種腺病毒中和抗體，同時攻毒實驗顯示rAdMH5-h55 免疫小鼠，其肺內(nèi)病毒滴度低，病理變化輕。該結(jié)果表明，rAdMH5-h55 是良好的三價疫苗候選。

研究表明HAdVs 中E1 基因與腫瘤基因有關(guān)，該區(qū)域缺失會降低或者消除致癌性[14]。2018 年，Tian 等[12]研究構(gòu)建了缺失E1 基因的復(fù)制缺陷型人3 型腺病毒。HEp-2/E1 可以補充E1 缺失突變體的功能。將人3 型腺病毒（human adenovirus type 3，HAdV-3）的部分基因組克隆到pPolyII 載體中，成為骨架質(zhì)粒；同時構(gòu)建了攜帶eGFP 基因的穿梭載體。將質(zhì)粒和穿梭載體分別共轉(zhuǎn)染HEp-2/E1 和293 細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染2 周后HEp-2/E1細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），而293 細(xì)胞未出現(xiàn)；野生型HAdV-3 被重組HAdV-3 免疫小鼠的血清中和。實驗結(jié)果表明，重組腺病毒3 型有可能作為HAdV-3 疫苗的候選疫苗。

研究表明E3 基因與宿主免疫系統(tǒng)相互作用有關(guān)，對病毒組裝、復(fù)制和感染并不是必需的，因此作為載體時可刪除E3 基因可增加外源基因插入[15]。2021 年，Guo 等[16]研究構(gòu)建了兩種E3 缺失的重組腺病毒ΔE3-HAdV4 和ΔE3-HAdV7，E3 基因缺失后病毒致病力和復(fù)制效率降低。此外，該二價減毒活疫苗單次免疫分別保護(hù)小鼠免受野生型HAdVs-4 和HAdVs-7 的攻擊。與對照組相比，接種疫苗的小鼠的肺部病毒載量顯著降低，肺部病理減少，證明了ΔE3-rAdVs 作為腺病毒減毒活疫苗的潛力，并為腺病毒疫苗的開發(fā)提供了一種新的策略。

4 核酸疫苗和基因工程疫苗

與傳統(tǒng)疫苗相比，新型疫苗的安全性和有效性等方面不斷提升，發(fā)展?jié)摿Ω?，必然替代傳統(tǒng)的疫苗形式[17]。2018 年，Tian 等[18]研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達(dá)的重組HAdV-11 纖維旋鈕三聚體被證明在小鼠中誘導(dǎo)針對11、7、14 和55 型的中和抗體。2019 年，Bullard 等[19]開發(fā)了一種單周期HAdV-7病毒（single-cycle Adenovirus type 7 virus，scAd7），該病毒比復(fù)制缺陷病毒更具免疫原性，它保留了復(fù)制其gDNA 的能力，從而增加了HAdV-7 蛋白的表達(dá)，大大提高了這種疫苗的安全性，使其成為預(yù)防HAdV-7 感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病的理想候選者。2020 年，Lu 等[20]從HAdV-7 感染患者的外周血單核細(xì)胞中獲得特異性人單克隆抗體（human monoclonal antibody，HMAb）。結(jié)果顯示HMAb 3-3E僅與完整7 型六鄰體蛋白或重組六鄰體蛋白結(jié)合，與其他完整的病毒粒子未結(jié)合；HMAb 3-3E 在體外以低濃度有效中和HAdV-7；HMAb 3-3E 在小鼠模型中可免受HAdV-7 感染。因此，HMAb 3-3E有望成為HAdV-7 感染的安全有效的預(yù)防和治療的手段。

5 流感減毒疫苗

2018 年，Gu 等[21]開發(fā)了一種冷適應(yīng)減毒流感病毒，利用反向遺傳學(xué)方法在冷適應(yīng)流感疫苗神經(jīng)氨酸酶基因主干中攜帶六鄰體的表位。實驗結(jié)果顯示，免疫后的小鼠對流感和腺病毒有特異性、較強的抗體反應(yīng)，且呈劑量依賴性。此外，有效的體液、黏膜和細(xì)胞免疫反應(yīng)可以抵御野生型HAdV-3和HAdV-7 的攻擊。研究表明該疫苗可作為一種潛在的抗腺病毒感染的候選疫苗，但有待進(jìn)一步臨床研究。

6 展望

近幾年來，HAdVs 感染暴發(fā)愈發(fā)頻繁，尤其以55型最為突出，其致病力和毒力明顯高于其他型別[22]。腺病毒作為其他病毒疫苗載體而被熟知，但本身感染疾病并未得到太多關(guān)注。腺病毒種內(nèi)和種間傳播、不同宿主中的潛伏時間以及容易重組和逃避群體免疫的能力[23]，給疾病監(jiān)測和防控帶來極大的挑戰(zhàn)。2011 年以來，美國軍方一直使用針對4 和7 型的口服疫苗，美國新兵呼吸道感染急劇下降，但是還未向公眾開放使用。我國一直在探索開發(fā)用于公眾和軍隊的腺病毒疫苗[24]，研究方向集中于重組腺病毒疫苗，還在初步發(fā)展階段；減毒疫苗針對腺病毒的減毒方法、質(zhì)量控制等仍然有待探究；腺病毒不同型別感染細(xì)胞受體有所不同[25]，受體表達(dá)在人和動物體內(nèi)有較大差異，因此疫苗研究中缺乏科學(xué)有效的動物模型進(jìn)行有效性和穩(wěn)定性評價。這些問題限制疫苗的研究，亟須解決。社會在關(guān)注腺病毒作為載體的同時，需要把關(guān)注點轉(zhuǎn)移到腺病毒本身疫苗的研究中。