基于機器學習方法篩選IgA腎病鐵死亡關鍵基因

楊柏新,付少杰,閆 冀,賈 冶,徐弘昭*

(1.武警吉林省總隊醫(yī)院 腎病科,吉林 長春130052;2.吉林大學第一醫(yī)院 腎病科,吉林 長春130021;3.德惠市人民醫(yī)院,吉林 德惠130300)

IgA腎病是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎病理類型之一,病理生理過程復雜,預后多變,治療也大多基于經(jīng)驗,臨床上缺乏防止IgA腎病進展為終末期腎病的手段,給個人和社會帶來沉重經(jīng)濟負擔。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的由氧化還原反應驅(qū)動的細胞死亡程序,它構(gòu)成了一種在遺傳、形態(tài)和生化上都不同于凋亡和自噬的細胞死亡途徑,包括脂質(zhì)過氧化、氧化還原途徑受損和鐵過載。鐵死亡處于新陳代謝、脂質(zhì)過氧化和鐵調(diào)節(jié)機制的交叉處,被定義為由脂質(zhì)過氧化介導的鐵依賴的細胞死亡形式,作為器官損傷的驅(qū)動因素存在于多種生物學系統(tǒng)中。鐵死亡參與多種腎臟疾病,包括急性腎損傷、腎臟纖維化、多囊腎、糖尿病腎病等。本研究擬采用機器學習方法,探索IgA腎病鐵死亡的關鍵基因,從鐵死亡的角度為IgA腎病的防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 識別IgAN腎組織中差異表達的基因

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載IgAN患者和對照組腎小球組織的微陣列數(shù)據(jù)集(GSE93798,GSE104948),兩組共包含47例IgA腎病及48例正常對照組腎小球組織的芯片數(shù)據(jù),通過FerrDb數(shù)據(jù)庫獲取全部鐵死亡相關基因數(shù)據(jù),將研究中的鐵死亡相關基因篩選出來,從而獲得IgA腎病和對照組中鐵死亡相關基因的表達情況,對鐵死亡相關基因在IgA腎病和對照組進行差異分析,從而獲得IgAN組和對照組中有差異表達的鐵死亡相關基因(P<0.05)。

1.2 差異表達基因的富集分析

為了解獲得的IgAN腎小球組織的差異表達基因分析(DEGs)可能與哪些生物過程(Biological Process,BP)、細胞成分(Cellular Component,CC)以及分子功能(Molecular Function,MF)相關,對這些DEGs進行了基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析。GO富集分析是通過R語言中的“clusterProfiler”包來實現(xiàn),矯正后的P值<0.05被認為富集出的結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

1.3 篩選潛在的診斷性生物標志物

為了確定IgA腎病鐵死亡診斷生物標志物,使用最小絕對收縮和選擇算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator,LASSO),支持向量機遞歸特征消除(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination,SVM-RFE),以及隨機森林(Random Forests,RF)三種機器學習算法來預測樣本的疾病狀態(tài)。LASSO是一種回歸分析算法,又稱之為套索回歸,它通過執(zhí)行變量選擇和正則化來提高預測的精度和結(jié)果統(tǒng)計模型的可解釋性,本研究中LASSO回歸是通過使用R語言中的“glmnet”包來實現(xiàn)的。SVM是一種監(jiān)督下的機器學習算法,廣泛被應用于回歸和分類研究,RFE算法經(jīng)常被應用于避免過擬合的出現(xiàn),在本研究中SVM-RFE是通過R語言中的“e1071”包實現(xiàn)的,其中交叉驗證的參數(shù)設置為5倍。RF是一種有監(jiān)督的,以決策樹為基學習器的集成學習算法,本研究使用R語言中的“randomForest”包來實現(xiàn),將重要性得分大于2.0為標準對基因進行篩選。最后,將三種分類模型均鑒定出的基因挑選出來作為潛在的基因生物標志物進行進一步的分析。

1.4 評估鑒定出的生物標志物對IgAN的診斷效能

為了評估所鑒定的基因生物標志物對IgAN的診斷效能,利用訓練集中的47個IgAN患者樣本和48個對照組樣本的mRNA微陣列數(shù)據(jù),根據(jù)每個基因標志物的表達量分別繪制了它們的接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲線。然后將GSE99339數(shù)據(jù)集作為驗證集,再次繪制每個鑒定的基因生物標志物的ROC曲線,以更進一步的評估它們的診斷功效。計算每個ROC曲線下的面積(Area Under Curve,AUC)以對診斷功效進行定量評估。ROC曲線是用R語言中的“pROC”包繪制的,雙側(cè)P值<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

1.5 鑒定出的生物標志物的基因集變異分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)

為了進一步探究與鑒定出的生物標志物相關的生物學過程,根據(jù)鑒定出的生物標志物基因表達量的中位值,將IgAN樣本分別劃分為高表達組和低表達組,并進行GSVA和 GSEA。從分子特征數(shù)據(jù)庫MSigDB中下載“c5.go.bp.v7.4.symbols”的基因集,GSVA和GSEA算法分別被用來分析數(shù)據(jù)集,以探究與標志物可能相關的生物學過程,以找到樣品間有顯著差異的生物過程通路。矯正后的P值<0.05被認為富集出的結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

1.6 免疫細胞浸潤分析

CIBERSORT算法被用來分析IgAN和對照組腎組織中免疫細胞浸潤的特征。CIBERSORT是目前最廣泛使用的免疫細胞浸潤算法,它使用線性支持向量回歸的方法對組織表達矩陣進行解構(gòu),可以準確地量化每個樣本的22種免疫細胞的豐度分數(shù)。使用R語言中的“ggplot2”包進行免疫細胞浸潤矩陣的主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)聚類研究,使用“pheatmap”包繪制了不同分析方法獲得的免疫細胞浸潤矩陣的熱圖,以顯示不同免疫細胞在各個樣本腎組織中的浸潤情況。還使用“pheatmap”包以熱圖的形式繪制了識別出的浸潤的免疫細胞之間的相關性。R語言中的 “vioplot”包被用來繪制小提琴圖,以幫助將DKD患者和對照組樣本腎組織之間免疫細胞浸潤的差異可視化。

2 結(jié)果

2.1 識別IgAN腎組織中差異表達的基因

本研究的流程圖見圖1。對從兩個GEO數(shù)據(jù)集(GSE93798,GSE104948)中獲得的47個IgAN患者和48個對照組的腎小球組織的微陣列數(shù)據(jù)進行了回顧性分析,并通過FerrDb數(shù)據(jù)庫獲取全部鐵死亡相關基因數(shù)據(jù)。在去除了批次效應后,最終共鑒定出了157個IgAN組中的DEGs;其中64個基因上調(diào),93個基因下調(diào)(P<0.01,見圖2)。IgAN組和對照組中有統(tǒng)計學意義的差異表達的鐵死亡相關基因52個(P<0.0001,見圖3、圖4)。

圖1 本研究流程示意圖

圖2 獲得IgA腎病組和對照組中有差異表達的鐵死亡相關基因157個(P<0.05)

圖3 IgAN組和對照組中有特別顯著差異表達的鐵死亡相關基因52個(P<0.0001)

圖4 IgAN組和對照組中有統(tǒng)計學意義的差異表達的鐵死亡相關基因之間表達的相關性分析(P<0.0001)

2.2 差異表達基因的富集分析

通過對DEGs進行GO功能富集分析來探究IgAN可能的發(fā)病機制。GO功能富集分析確定出了DEGs最相關的10個生物學過程、細胞成分和分子功能(見圖5)。

圖5 IgAN與對照組間有差異表達的鐵死亡基因的GO功能富集分析

2.3 IgAN診斷標志物的鑒定

三種不同的機器學習算法被用來鑒定IgAN的潛在診斷標志物。DEGs中共有12個基因被LASSO回歸算法構(gòu)建的診斷模型納入進來(見圖6A);共有3個基因被SVM-RFE算法構(gòu)建的診斷模型納入進來(見圖6B);共有1個基因被隨機森林構(gòu)建的診斷模型納入進來(圖6C)。而只有鋅指蛋白36(ZFP36)是被3種算法都納入診斷模型之中(見圖6D),因此ZFP36被鑒定為IgAN的潛在診斷標志物。

圖6 通過機器學習方法篩選關鍵鐵死亡基因(A:LASSO回歸;B:SVM-RFE;C:隨機森林模型;D:3種方法取交集)

2.4 IgAN診斷標志物診斷效能的驗證

如圖7A所示,在訓練集中這兩個基因的表達能夠有效地將IgAN和對照組樣本區(qū)分開來,ZFP36的AUC為0.874(95%CI 0.795～0.945)。為了進一步評估這兩個生物標志物的診斷效能,GSE99339數(shù)據(jù)集為驗證集,其中包括11個IgAN患者樣本和26個對照組樣本。如圖7B所示,驗證集中也繪制了ZFP36的ROC曲線,ZFP36的AUC為0.874(95%CI 0.793～0.940)。這些結(jié)果表明,ZFP36的表達在診斷IgAN方面顯示出良好的潛力。

圖7 關鍵鐵死亡基因的診斷效能評價及驗證(A:以ZFP36的表達量為參數(shù)在訓練集中構(gòu)建診斷模型;B:以ZFP36的表達量為參數(shù)在驗證集中構(gòu)建診斷模型)

2.5 生物標志物的GSVA和GSEA分析

利用GSVA和GSEA探索與ZFP36相關的生物學過程的結(jié)果見圖8;GSEA分析結(jié)果如圖8A所示,ZFP36參與細胞死亡、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性等生物過程。ZFP36參與調(diào)節(jié)趨化因子信號通路,細胞因子-細胞因子受體相互作用,利什曼原蟲感染,MAPK信號通路和NOD樣受體信號通路(圖8B)。GSVA分析結(jié)果顯示,ZFP36負調(diào)控成纖維細胞生長因子,Toll樣受體4結(jié)合,細胞肝素反應以及轉(zhuǎn)錄因子AP1等生物過程(圖8C)。ZFP36下調(diào)哺乳動物晝夜節(jié)律,NOD樣受體信號通路等,且上調(diào)?；撬岷痛闻；撬岽x(圖8D)。

圖8 GSEA和GSVA分析探究關鍵鐵死亡基因相關的生物過程和信號通路

2.6 免疫細胞浸潤的分析

基于CIBERSORT算法探究IgAN和對照組腎組織間差異浸潤的免疫細胞,見圖8。在CIBERSORT算法中,不同浸潤的免疫細胞的小提琴圖顯示,激活的NK細胞、靜止的樹突細胞在IgAN樣本中的浸潤數(shù)量顯著大于對照組樣本,而靜止的CD4記憶T細胞,靜止的自然殺傷(Natural Killer,NK)細胞和中性粒細胞的浸潤數(shù)量則較少(見圖9A)。22種免疫細胞亞型浸潤的相關性熱圖顯示,靜止樹突細胞浸潤正相關,而中性粒細胞、單核細胞和靜止的NK細胞這三種免疫細胞的浸潤負相關(見圖9B)。ZFP36表達與中性粒細胞、靜止的NK細胞浸潤呈正相關,與靜止的樹突細胞、激活的NK細胞、巨噬細胞M1浸潤呈負相關(見圖9C)。

圖9 IgA腎病和對照組腎小球組織中差異浸潤的免疫細胞情況

3 討論

目前IgAN的病理機制還未完全明確,但是被廣泛接受的理論認為,IgA腎病是多種機制共同導致的,被稱為“多重打擊假說”,包括4個環(huán)節(jié):①異常糖基化IgA1,進而生成半乳糖缺乏IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)[1];②被循環(huán)系統(tǒng)中抗聚糖的自身抗體識別[2];③導致腎炎的免疫復合物沉積在系膜區(qū)[3];④激活系膜細胞,導致補體激活、進一步的免疫反應和腎損傷。IgA腎病患者的循環(huán)系統(tǒng)中,異常糖基化IgA1水平較高。異常糖基化IgA1與基因缺陷或遺傳特征有關,但不足以導致疾病的發(fā)生;IgA腎病患者有血緣關系的人,也可能出現(xiàn)異常糖基化IgA1水平升高,但是他們不一定都會罹患IgA腎病[4]。因此,異常糖基化IgA1如何導致IgA腎病仍然值得研究。異常糖基化IgA1可能會產(chǎn)生Gd-IgA1。高水平的Gd-IgA1一般認為是由扁桃體淋巴細胞、骨髓和腸黏膜的漿細胞產(chǎn)生[5-6]。Gd-IgA1的大量合成是IgA腎病中IgA1免疫復合物形成的基礎,而IgA1免疫復合物是IgA腎病發(fā)病的關鍵因素。在IgA腎病患者中,可檢測到這些免疫復合物。雖然單獨的IgA通常不能激活補體,但這些復合物卻可通過自聚化形成聚合體,并被補體特異性識別、結(jié)合,形成循環(huán)免疫復合物,在腎小球系膜區(qū)異常沉積,最終導致IgA腎病[7]。而最近的研究表明,黏膜和補體免疫系統(tǒng)在IgA腎病中發(fā)揮重要作用。血尿的出現(xiàn)和黏膜免疫相關,而循環(huán)免疫復合物中常?？梢园l(fā)現(xiàn)補體,例如C3補體和補體因子H[8]。IgAN是一種慢性炎癥性疾病,其發(fā)病和進展與許多鐵代謝指標相關[9-10],此外,IgAN以血尿和蛋白尿為主要臨床特征,腎小管上皮細胞可以吞噬和降解紅細胞產(chǎn)生二價鐵,與H2O2相互作用產(chǎn)生活性氧(ROS)導致腎臟細胞損傷[11-12]。

腎臟影響鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),而鐵失衡會加重腎損傷[13-15]。鐵死亡是2012年發(fā)現(xiàn)的一種獨特的內(nèi)源性修復和保護系統(tǒng)控制的古老細胞死亡形式[16]。鐵死亡作為器官損傷的驅(qū)動因素存在,與多種生物學過程密切相關,包括發(fā)育、衰老、免疫與癌癥等。細胞代謝機制、ROS的調(diào)控和鐵的調(diào)節(jié)在鐵死亡中交叉錯集,構(gòu)成了鐵死亡的機制和生物學意義。鐵死亡的并不是一般類型的氧化應激,而是發(fā)生于細胞膜的致命脂質(zhì)過氧化物積累。PUFA活化并將其摻入膜脂(如PLs)中,以便產(chǎn)生致命性的過氧化物,最終驅(qū)動鐵死亡。鑒于ACSL4參與活化和整合 PUFA,如花生四烯酸(AA)進入膜定位的脂質(zhì),說明PUFA需要存在于其膜結(jié)合環(huán)境中以表現(xiàn)過氧化后的殺傷力。ACSL4 失活是一種在不同情況下抑制鐵死亡的關鍵機制,ACSL4的過表達對鐵死亡敏感[17]。此外,ACSL4還積極參與正反饋循環(huán)以執(zhí)行鐵死亡[18]。因此,ACSL4可能更類似于細胞凋亡的caspase-3,它是細胞死亡的執(zhí)行者,而不是管家蛋白。GPX4和谷胱甘肽抑制脂質(zhì)ROS的積累,是一種鐵死亡的中樞抑制因子[19]。GPX4的降解,而非抑制可以促進鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)/(A:與ZFP36相關的生物過程的GSEA分析;B:與ZFP36相關的信號通路的GSEA分析;C:與ZFP36相關的生物過程的GSVA分析;D:與ZFP36相關的信號通路的GSVA分析)CoQ10、二氫乳清酸脫氫酶(DHODH) 和環(huán)GTP水解酶1(GCH1)/四氫生物蝶呤(BH4),通過獨立于GPX4的方式來抑制鐵死亡[20-22]。顧名思義,鐵死亡依賴于鐵。非酶催化的、鐵依賴的Fenton鏈式反應可能對于鐵死亡是必要的:PLOOHs在GPX4被抑制時會持續(xù)存在更長時間,從而起始Fenton反應,使鐵死亡標志物PLOOHs的含量迅速增加,PLOOHs能夠與亞鐵離子和鐵離子反應,分別產(chǎn)生自由基PLO·和PLOO·引發(fā)破壞性的過氧化鏈式反應[23]。此外,LOXs和POR發(fā)揮催化活性需要鐵的參與,鐵對于許多與細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生相關的基于氧化還原的代謝過程也是必不可少的。由于鐵在控制細胞生存和死亡中占據(jù)中心地位,細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)受到精細調(diào)控,許多胞內(nèi)通路通過改變細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵的含量改變細胞對于鐵死亡的敏感性[24]。IgAN時鐵代謝和轉(zhuǎn)運、ROS的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)也受到影響。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)介導的鐵輸入和自噬介導的鐵蛋白(ferritin)降解等過程都促進鐵死亡[25]。一項隊列研究顯示與健康對照組相比,IgAN患者中Gd-IgA1更傾向于與TfR結(jié)合,表明免疫復合物的形成有利于系膜 TfR-IgA1相互作用,同時可以通過正反饋增加TfR的表達[10,26]。此外,TfR與IgAN疾病進展顯著相關并可能在IgAN中發(fā)揮生物學作用[27]。在一項納入514例IgAN患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,Tf)與IgAN系膜細胞增生、內(nèi)皮細胞增生以及間質(zhì)纖維化相關。與對照組相比,IgAN患者有更低的SOD活性和更高的MDA水平[28]。GPX4表達在IgAN大鼠腎臟組織中表達明顯降低[29]。鑒于大量的研究表明IgAN與鐵死亡有關,可以通過調(diào)控鐵死亡來治療IgAN。通過機器學習,發(fā)現(xiàn)ZFP36可作為IgAN鐵死亡新的診斷標記物,對診斷IgAN表現(xiàn)出良好潛力。

ZFP36轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與了許多炎癥基因的調(diào)控,而IgAN時循環(huán)免疫復合物在系膜區(qū)的沉積可以刺激細胞外基質(zhì)聚積、促炎性和促增殖因子的釋放,從而導致系膜細胞增殖和促炎性細胞進入腎小球。此外,促炎性介質(zhì)同時改變足細胞、腎小管上皮細胞和內(nèi)皮細胞的基因表達,從而導致細胞損傷,說明IgAN是一種慢性炎癥性疾病[30-32]。ZFP36家族蛋白是參與信使RNA(mRNA)代謝途徑的RNA結(jié)合蛋白。ZFP36家族由ZFP36(也稱為tristetraprolin,TTP)、ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3(僅在嚙齒動物中)組成。ZFP36家族蛋白包含兩個串聯(lián)重復的CCCH型鋅指基序,結(jié)合到特定mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)中富含腺嘌呤尿苷的元件,并導致目標mRNA的衰變。雖然ZFP36家族成員在結(jié)構(gòu)上相似,但已知它們發(fā)揮不同的功能并調(diào)節(jié)不同的靶mRNA,這可能是由于它們的細胞類型特異性表達模式所致。例如,ZFP36在全身炎癥性疾病的小鼠模型中,通過下調(diào)各種促炎細胞因子(包括TNF-α)的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎調(diào)節(jié)劑的作用。

目前,免疫浸潤細胞被認為在IgAN的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。因此,揭示IgAN腎臟組織中免疫細胞的浸潤情況,并探討所發(fā)現(xiàn)的新的生物標志物與免疫浸潤細胞之間的關系,具有重要意義。ZFP36表達與中性粒細胞、靜止的NK細胞浸潤呈正相關,與靜止的樹突細胞,激活的NK細胞,巨噬細胞M1浸潤呈負相關。研究表明IgAN患者的樹突細胞誘導IgA產(chǎn)生的能力受損[33]。NK淋巴細胞亞群在IgAN中的重新分布可能在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的損傷中起重要作用,可引起血尿[34-35]。中性粒細胞可引起IgAN腎小球損傷[36]。盡管本研究發(fā)現(xiàn)IgAN部分免疫細胞的失調(diào),但相關免疫細胞的詳細功能與IgAN的確切聯(lián)系仍不清楚。

綜上,鐵死亡與IgAN發(fā)生、發(fā)展密切相關。ZFP36作為IgAN鐵死亡的診斷標志物,將為IgAN的診斷、治療及預防提供新的靶點。