袁 婷，魏 群，馬湘蒙，姚金潔，何潤瀅

（廣西大學資源環(huán)境與材料學院，廣西 南寧 530004）

目前，人類社會對燃料的需求日益增加，而常用的傳統(tǒng)燃料存在二次污染、成本高和不可再生等問題，故尋找替代燃料逐漸成為研究熱點[1]。以微藻為原料所生產(chǎn)的第三代生物柴油是極具發(fā)展?jié)摿Φ奶娲剂希蚓哂信囵B(yǎng)成本低、可再生等優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注[2]。微藻具有生長快、適應性強及脂質(zhì)含量高的特點[3]，其生長及生理特性會直接影響到生物柴油的質(zhì)量，故為獲得高質(zhì)量的生物柴油，要保持微藻良好的生長狀態(tài)。氮是藻細胞蛋白質(zhì)、葉綠素等重要組成元素之一，同時也對調(diào)控微藻脂質(zhì)的合成起到關(guān)鍵的作用[4]。多種形式的氮源均能被微藻吸收利用，但不同氮源對微藻的生長、生理特性的影響有所差異，研究表明，新綠藻（Neochlorisoleoabundans）在硝酸鹽培養(yǎng)下生長及脂質(zhì)積累效果最好[5]；而二形柵藻（Scenedesmus dimorphus）更傾向于利用尿素[6]。此外，氮濃度也會影響微藻的生長及脂質(zhì)積累，氮充足的條件有利于微藻的生長及脂質(zhì)積累，同時也能保證微藻較好的生長狀態(tài)[7]。在氮缺乏或氮過量條件下，微藻的生長會受到抑制，但在氮限制下微藻的脂質(zhì)等儲能物質(zhì)含量較高[8-9]。目前氮源對微藻的研究主要集中在生長及脂質(zhì)積累效果的影響方面，而對其他重要的生理指標的影響研究相對較少。因此，為更好地了解氮源及氮濃度對微藻的生長及生理特性之間的關(guān)系，需對此開展進一步的探究。

斜生四鏈藻（Tetradesmus obliquus）擁有優(yōu)良的脂質(zhì)生產(chǎn)性能，其在氮脅迫條件下脂質(zhì)含量可達47.70%，具有一定的發(fā)展?jié)摿10]。實驗以斜生四鏈藻為研究對象，探究其在不同氮源及濃度條件下的生長及生理特性的影響，分析斜生四鏈藻的脂質(zhì)含量、脂肪酸組成、蛋白質(zhì)及葉綠素a等指標情況，進而優(yōu)選出斜生四鏈藻最佳培養(yǎng)條件，保證微藻的高質(zhì)量生長。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的藻種為斜生四鏈藻，編號：FACHB-12，曾用名斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

改良BG11培養(yǎng)基[11]（僅改變氮源及氮濃度）；硝酸鈉（NaNO3）、尿素（CH4N2O）、氯化銨（NH4Cl）、無水乙醇、硫酸、甲醇、氯仿、正己烷、丙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；考馬斯亮藍（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BXM-75型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；AR124CN型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Smart2pure12型超純水儀（美國賽默飛世爾公司）；UV-8000型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機；JY92-II超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 微藻培養(yǎng)

微藻均培養(yǎng)于1 L的錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25±1 ℃，使用熒光燈進行持續(xù)光照，光照強度60 μmol/m2/s并持續(xù)通入純凈的空氣，曝氣量為200 mL/min。實驗所用的培養(yǎng)基為改良的BG11培養(yǎng)基，除了氮源與氮濃度之外，其余成分均與常規(guī)BG11培養(yǎng)基相同。

在無氮BG11培養(yǎng)基中，設(shè)置硝酸鈉、氯化銨及尿素3種氮源，每個氮源均各設(shè)置3個氮濃度，分別為3.53、8.82及17.65 mmol/L（換算成N濃度相同）。將處于對數(shù)生長期的斜生四鏈藻離心，洗滌3次后，再將藻泥重懸于裝有不同氮源及氮濃度的改良BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，保持初始的生物量相同，并保持相同的培養(yǎng)條件。

1.3.2 微藻生物量

微藻生物量用干重（DW）表示。取適量藻液離心10 min后用去離子水清洗3次，然后將藻泥轉(zhuǎn)移至稱量皿中在65 ℃下干燥至恒重。通過測定稱量皿前后的差值得到微藻的DW。DW計算見式（1），生物量生產(chǎn)力（Pbiomass）計算見式（2）。

式中：DW為生物量干重(g/L），Pbiomass為生物量生產(chǎn)力（mg/L/d），W1和W2分別為稱量皿烘干前后的重量（g）；V為樣品的體積（L）；DW2和DW1分別為第t2天和第t1天的生物量（g/L）。

1.3.3 脂質(zhì)含量(Clipid）和脂質(zhì)生產(chǎn)力（PLipid）

采用重量法[12]測定微藻脂質(zhì)。利用氯仿/甲醇（2∶1）混合溶液提取微藻細胞中的脂質(zhì)，將提取液置于錫紙盒中烘干后冷卻稱重，計算公式見式（3）。脂質(zhì)生產(chǎn)力PLipid（mg/L/d）按照式（4）進行計算。

式中：Clipid為脂質(zhì)含量（%）；PLipid為脂質(zhì)生產(chǎn)力（mg/L/d）；Q1和Q2分別為錫紙盒提取脂質(zhì)前后的重量（g）；DW為微藻生物量（g/L）；DQx和DQ1分別為Tx和T1天的生物量（g/L）；Cx和C1分別為Tx和T1天的脂質(zhì)含量（%）。

1.3.4 脂肪酸組成（FAME）

脂肪酸組成通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)測定[13]。向50 mg藻粉中添加3 mL的4%硫酸-甲醇溶液，然后在90 ℃下水浴1 h，待樣品冷卻至室溫后再添加1 mL的正己烷，充分震蕩后進行離心，取上層含有有機相進行測定。利用氣質(zhì)聯(lián)用儀、火焰電離檢測器和高效毛細管柱對脂肪酸組成進行分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍比色法測定[14]。取5 mL藻液超聲破碎10 min后，以4 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，往1 mL上清液后加入5 mL考馬斯亮藍試劑，將其混合靜置2 min，最后在595 nm波長下測定混合物的吸光值。

1.3.6 葉綠素a

葉綠素a（Chl-a）采用乙醇-丙酮超聲破碎法測定[15]。取5 mL藻液于離心管后在4 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min，移除上清液后往離心管中加入5 mL的丙酮乙醇混合溶液（v∶v=1∶1）。繼續(xù)超聲破碎10 min，在4 ℃的溫度下避光浸泡24 h。最后將樣品以4 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，利用分光光度計在645 nm和663 nm波長處測量上清液的吸光度，葉綠素a的計算見式（5）。

式中：Chl-a為葉綠素a 濃度（mg/L）；A645、A663分別為645 nm和663 nm處的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2021b軟件作圖，并使用相關(guān)性分析插件進行相關(guān)性分析。使用Excel 與OriginPro 2021b軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理及分析，所有數(shù)據(jù)均為3組平行樣的平均值來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響

不同氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響如圖1所示。由圖1（a）可知，經(jīng)過1 d的適應期后，斜生四鏈藻在不同氮源及氮濃度條件下，生物量呈現(xiàn)出不同的生長趨勢。尿素培養(yǎng)環(huán)境下的斜生四鏈藻生長效果最好，其次為硝酸鈉，最后為氯化銨。當以尿素、硝酸鈉為氮源時，微藻的干重隨著氮濃度的增加而增加，在2～5 d時微藻生長速度最快，在第8天時干重均達到最大值。而以氯化銨為氮源時，微藻的干重隨氮濃度增加而降低，微藻在0～3 d時呈現(xiàn)出明顯的生長趨勢，但在4～6 d時微藻干重才得到緩慢的提升，隨后生長趨向于平衡，且生物量干重始終低于其他組（P<0.05）。在第8天時，當?shù)獫舛确謩e為3.53、8.82及17.65 mmol/L時，尿素組的微藻干重分別為0.72、0.79及0.96 g/L，硝酸鈉組的微藻干重分別為0.66、0.67及0.88 g/L，而氯化銨組的微藻干重僅為0.32、0.26及0.24 g/L。

圖1 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生長的影響

實驗結(jié)果表明，斜生四鏈藻更傾向于利用尿素與硝酸鈉，適當增加此類氮源的濃度可有效促進斜生四鏈藻的生長，而氯化銨并不利于其生長，這可能與氮源的代謝途徑緊密相關(guān)。已有研究表明，NH4+通過轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞后能直接被微藻利用，轉(zhuǎn)化途徑相對簡單，因此通常被認為是微藻最優(yōu)先吸收的氮源[16]。然而在研究中以氯化銨為氮源時斜生四鏈藻的生長卻受到抑制，這可能與藻液中游離的NH4+水解造成pH降低有關(guān)[17]。尿素通過轉(zhuǎn)運蛋白進入微藻細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為NH4+后被微藻吸收，而NO3-進入微藻細胞后需要轉(zhuǎn)化為NO2-后再轉(zhuǎn)化為NH4+才能被微藻直接利用，需要消耗較多的能量，這可能是斜生四鏈藻干重尿素組略高于硝酸銨組的原因[18]。

由圖1（b）可知，不同氮源及氮濃度下，8 d內(nèi)微藻的平均生物量生產(chǎn)力的變化趨勢與干重相似，以尿素為氮源培養(yǎng)的微藻平均生物量生產(chǎn)力整體最高，其次為硝酸鈉和氯化銨。以硝酸鈉與尿素為氮源時，微藻的平均生物量生產(chǎn)力隨氮濃度的增加而升高，而氯化銨與之相反。其中當?shù)獫舛葹?7.65 mmol/L時，氯化銨、硝酸鈉與尿素的平均生物量生產(chǎn)力分別為11.83、98.29及102.25 mg/L/d。綜上所述，當以尿素為氮源，氮濃度為17.65 mmol/L時，斜生四鏈藻的生長效果要優(yōu)于其他實驗條件。

2.2 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質(zhì)積累的影響

氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質(zhì)積累的影響如圖2所示，不同的氮源所培養(yǎng)的微藻脂質(zhì)積累能力存在一定的差距。研究發(fā)現(xiàn)，隨著氮濃度的升高微藻的脂質(zhì)含量反而降低。當?shù)獫舛?.53 mmol/L時，3種氮源所培養(yǎng)的微藻脂質(zhì)含量能達到最大值，尿素組、硝酸鈉組和氯化銨組分別為31.93%、29.48%和23.86%；而當?shù)獫舛?7.65 mmol/L時，尿素組、硝酸鈉組和氯化銨組的脂質(zhì)含量分別僅為24.70%、23.62%和22.10%。

圖2 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂質(zhì)積累的影響

通常在氮源將被耗盡的條件下，微藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及葉綠素的合成受到了限制，從而使得能量重新分配，向脂質(zhì)等具有儲能作用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，使得脂質(zhì)含量增加[19]。而當?shù)獫舛容^高時，所有實驗組的脂質(zhì)積累效果均較差，可能是在氮充足或氮過量的條件下，細胞內(nèi)的能量主要傾向于合成葉綠素以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，故導致脂質(zhì)含量較低[20]。此外，在脂質(zhì)生產(chǎn)力方面，以氯化銨為氮源所培養(yǎng)的微藻脂質(zhì)生產(chǎn)力隨著氮濃度的增加而降低，最低僅為2.81 mg/L/d，這可能是因為微藻的生長受到了抑制，從而使得脂質(zhì)含量較低。而以尿素為氮源的微藻脂質(zhì)生產(chǎn)力隨著氮濃度的增高出現(xiàn)先降低后上升的趨勢，在17.65 mmol/L時脂質(zhì)生產(chǎn)力高達25.90 mg/L/d，這與微藻的生物量有關(guān)。綜上所述，尿素有利于微藻的脂質(zhì)積累且能保證較高的脂質(zhì)生產(chǎn)力，當?shù)獫舛容^低時微藻的脂質(zhì)含量最高，氮濃度較高時脂質(zhì)生產(chǎn)力最高。

2.3 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂肪酸組成的影響

脂肪酸組成是一種用于衡量脂質(zhì)是否能生產(chǎn)生物柴油的重要指標，而不同種類的脂肪酸含量會隨著氮濃度的變化而發(fā)生改變[21]。研究中，氮源及氮濃度對微藻脂肪酸組成的影響如圖3所示。結(jié)果表明，斜生四鏈藻的脂肪酸主要為C16∶0（棕櫚酸）、C18∶1（油酸）和C18∶2（亞油酸），其他的脂肪酸含量較少。C18∶1是生物柴油的主要原料之一，會直接影響生物柴油的質(zhì)量[22]。尿素組的C18∶1含量相對于硝酸鈉組和氯化銨組最高，當?shù)獫舛葹?.53 mmol/L時，尿素組C18∶1含量高達55.49%而C16∶0僅為30.38%，C18∶1占整體脂肪酸的一半以上，表明在此條件下生產(chǎn)的生物柴油具有較好的性能。而當?shù)獫舛葹?7.65 mmol/L時，氯化銨組C18∶1含量最低而C16∶0含量最高，分別為40.26%和44.94%，表明在此條件下生產(chǎn)的生物柴油性能不穩(wěn)定。

圖3 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻脂肪酸組成的影響

此外，由圖3可知，氮源種類對斜生四鏈藻脂肪酸組成影響較小，在同一濃度下，不同氮源C18∶1的占比差異較小，尿素實驗組要略高于硝酸組和氯化銨組；而氮源濃度的影響更為明顯，C18∶1的含量隨氮濃度的升高而降低，具有明顯的遞減趨勢，而C16∶0的變化趨勢與其相反。這可能是由于在低氮濃度下，微藻的飽和脂肪酸逐漸轉(zhuǎn)換為單不飽和脂肪酸，從而使得所生產(chǎn)的生物柴油性能更加穩(wěn)定[23]。綜上所述，氮濃度是影響微藻脂肪酸組成的主要因素，在相同的氮濃度條件下，利用尿素培養(yǎng)的微藻所制備的生物柴油將具有更高品質(zhì)。

2.4 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)是微藻生長代謝中的主要成分之一，微藻的細胞質(zhì)、細胞核及酶都含有大量的蛋白質(zhì)[24]。氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質(zhì)的影響如圖4所示。由圖4可知，以硝酸鈉和尿素為氮源的培養(yǎng)環(huán)境，更利于微藻蛋白質(zhì)的合成，而尿素組的促進效果更為明顯。此外，不同濃度的氮源培養(yǎng)結(jié)果表明，相比于氮濃度，氮源種類更是微藻合成蛋白質(zhì)的重要影響因素，氯化銨實驗室組微藻蛋白質(zhì)含量隨著氮源濃度升高而降低，而尿素和硝酸鈉培養(yǎng)條件下的斜生四鏈藻蛋白質(zhì)含量隨氮源濃度的升高而升高。這可能是由于高濃度氯化銨會導致培養(yǎng)環(huán)境變?yōu)樗嵝?，從而抑制了微藻的生長，減少了蛋白質(zhì)的合成，并造成蛋白質(zhì)的破壞，從而導致蛋白質(zhì)含量降低，這與先前的影響斜生四鏈藻生長的因素類似[25]。而相比于硝酸鈉，尿素在進入微藻體內(nèi)后更易被轉(zhuǎn)化為NH4+，這可能是導致其有利于蛋白質(zhì)合成的原因之一[26]。

圖4 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻蛋白質(zhì)的影響

2.5 氮源及氮濃度對斜生四鏈藻葉綠素a的影響

葉綠素a（Chl-a）是一種重要的光合色素，反映了微藻的光合作用的效果[27]。氮源及氮濃度對斜生四鏈藻葉綠素a的影響如圖5所示。由圖可知，硝酸鈉組和尿素組的斜生四鏈藻Chl-a含量呈現(xiàn)較好的上升趨勢，而氯化銨組呈現(xiàn)出小幅波動的趨勢，且差異性顯著（P<0.05）。同時，3個濃度培養(yǎng)結(jié)果均表明，以硝酸鈉為氮源的Chl-a含量最高，當?shù)獫舛葹?7.65 mmol/L時，Chl-a含量在第8天時達到最高值9.32 mg/L，表明以硝酸鈉為氮源所培養(yǎng)的微藻有利于生成Chl-a。這與先前的研究結(jié)果類似，即適宜濃度的硝酸鈉更有利于微藻進行光合作用，其光合色素含量較高[28]。以尿素為氮源所培養(yǎng)的微藻葉綠素a含量相對硝酸鈉較低，當?shù)獫舛葹?7.65 mmol/L時，Chl-a含量在第8天時僅為6.51 mg/L，這可能是因為以尿素為氮源時微藻更傾向于將氮源合成蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等物質(zhì)而導致的。此外，氯化銨組的葉綠素量均較低，均在1～3 mg/L范圍內(nèi)波動，變化幅度較小，可能與在酸性條件下微藻細胞的光合色素發(fā)生了降解有關(guān)[29]。

2.6 氮源及氮濃度對微藻生理指標的相關(guān)性分析

通過Pearson相關(guān)系數(shù)，對不同氮源及氮濃度對斜生四鏈藻生理指標進行了相關(guān)性分析，當相關(guān)系數(shù)為正值時表明2個因素之間呈正相關(guān)，當相關(guān)系數(shù)為負值時則為負相關(guān)。如圖6所示，在3種氮源中氮濃度均與脂質(zhì)含量呈高度負相關(guān)，表明高氮濃度均不利于微藻的脂質(zhì)積累。氯化銨組的氮濃度僅與葉綠素a（0.75）呈正相關(guān)關(guān)系，和其他生理指標均為負相關(guān)，隨著氯化銨濃度的增加，微藻的生長及生理特性反而受到抑制，這表明氯化銨不適宜作為斜生四鏈藻的培養(yǎng)氮源。硝酸鈉組與尿素組的氮濃度與生物量、生物量生產(chǎn)力、蛋白質(zhì)及葉綠素a之間均呈高度正相關(guān)性，表明適當提升此類氮源的濃度有利于微藻的生長，但在脂質(zhì)生產(chǎn)力上二者呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性，硝酸鈉組的相關(guān)系數(shù)為0.76，而尿素組的相關(guān)系數(shù)僅為0.35，這可能與尿素組的脂質(zhì)生產(chǎn)力均在不同濃度下保持較高水平有關(guān)。因此，通過綜合分析可知尿素與硝酸鈉均有利于斜生四鏈藻的生長及脂質(zhì)積累，但尿素在促進生長上更具優(yōu)勢。

圖6 氮源及氮濃度與微藻生理指標之間的Pearson相關(guān)性

3 結(jié)論

（1）不同氮源培養(yǎng)的斜生四鏈藻的生長存在明顯差異。尿素最有利于斜生四鏈藻的生長，其次是硝酸鈉，氯化銨不利于斜生四鏈藻的生長。

（2）在適宜氮源（硝酸鈉及尿素）的培養(yǎng)下，斜生四鏈藻的生長及生理指標與氮濃度呈現(xiàn)不同相關(guān)性。脂質(zhì)含量與氮濃度呈負相關(guān)，低氮濃度（3.53 mmol/L）有利于微藻的脂質(zhì)積累及C18∶1（油酸）的合成，其中尿素組的脂質(zhì)及C18∶1的含量最高，分別為31.92%與55.49%；生物量及其他生理指標均與氮濃度呈正相關(guān)，高氮濃度（17.65 mmol/L）有利于微藻的生長及蛋白質(zhì)、葉綠素a的合成，尿素組的蛋白質(zhì)含量最高為25.11 mg/L，硝酸鈉組的葉綠素a最高為9.32 mg/L。

（3）尿素為斜生四鏈藻的最佳培養(yǎng)氮源，且最佳氮濃度為17.65 mmol/L，在此最佳條件下培養(yǎng)微藻，能獲得最大的干重、生物量生產(chǎn)力及脂質(zhì)生產(chǎn)力，分別為0.96 g/L、102.25 mg/L/d和25.90 mg/L/d，同時蛋白質(zhì)、葉綠素a的含量均保持較高水平。