黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院

高 山 張佩青 楊 光△ 李長見△(哈爾濱 150036)

提要 目的：觀察加減地黃飲子對衰老小鼠睪丸組織沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因3(SIRT3)表達(dá)的影響。方法：選取2月齡雄性ICR小鼠作為青年組，20月齡小鼠作為老年組、維生素E組和加減地黃飲子組。青年組、老年組以生理鹽水灌胃，維生素E組、加減地黃飲子組以對應(yīng)藥物灌胃。干預(yù)60 d后計算睪丸器官指數(shù)，觀測睪丸組織病理學(xué)變化，檢測各組小鼠血清睪酮和肝腎功能，檢測睪丸組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平，以RT-PCR和Western-blot法檢測SIRT3基因的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：與老年組比較，加減地黃飲子組小鼠睪丸器官指數(shù)無差異(P>0.05)；睪丸組織結(jié)構(gòu)清晰穩(wěn)定，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞增多；血清睪酮水平升高，肝腎功指標(biāo)正常，SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，SIRT3基因mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：加減地黃飲子可能影響SIRT3基因表達(dá)，減少小鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷而延緩睪丸衰老。

衰老是所有生物都會出現(xiàn)的自然現(xiàn)象，從細(xì)胞到組織，從器官到系統(tǒng)，隨時間出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能衰退[1]。在各個系統(tǒng)衰老中，生殖系統(tǒng)的變化對人體影響較大。老年男性性腺睪丸的功能不斷下降，引起肌肉、骨骼、精神、心理、性功能等一系列變化[2]。延緩睪丸衰老可以提高男性肌體狀態(tài)，改善生理功能，意義深遠(yuǎn)。

中醫(yī)中藥在補(bǔ)腎抗衰老方面優(yōu)勢獨(dú)到，加減地黃飲子源于金代名方地黃飲子。地黃飲子是補(bǔ)腎的經(jīng)典方，在前期研究中發(fā)現(xiàn)此方具有良好的延緩衰老作用[3]。課題組根據(jù)當(dāng)代人體質(zhì)和發(fā)病譜的變化，依據(jù)臨床反饋，進(jìn)行了配方的加減[4]。臨床應(yīng)用中去掉附子、肉桂等過熱藥物，強(qiáng)化抗衰老作用，加入薄荷、桂枝、酸棗仁等，化裁形成加減地黃飲子。在男性早衰、男性功能下降等疾病治療中體現(xiàn)出良好療效。沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因3(SIRT3)基因發(fā)現(xiàn)與人類長壽關(guān)系密切[5]，對肌體內(nèi)環(huán)境氧化、自噬、凋亡和能量代謝起重要調(diào)節(jié)作用[6-9]，具有減少氧化應(yīng)激誘發(fā)的功能性和器質(zhì)性損傷的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控SIRT家族可以干預(yù)泌尿系統(tǒng)衰老。在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)觀察加減地黃飲子對小鼠睪丸的抗衰老作用，試圖從抗衰老基因SIRT3分析內(nèi)在作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動物 雄性ICR小鼠60只，訂購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號為scxk黑2012-001。2月齡15只，體質(zhì)量25～30 g；20月齡45只，體質(zhì)量40～45 g。在20℃～25℃、自然照明、自由飲水進(jìn)食條件下飼養(yǎng)[4]。此次實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研倫理委員會批準(zhǔn)開展，動物實(shí)驗(yàn)編號DW20221005。

1.2 藥物與試劑 血清睪酮試劑盒：武漢華美公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號2001360)：上海秋博公司；β-action鼠單克隆抗體(批號063257)：廣州博歐特公司；SIRT3單克隆抗體(批號080731)：日本Anathia公司。維生素E(批號53188 0701)：西安海斯夫公司；加減地黃飲子水煎液：黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制備，藥劑濃度260 mg/mL[4]。

1.3 儀器 BK-280全自動生化分析儀：山東博科公司；超聲碎裂儀：上海靜信公司；多功能酶標(biāo)儀：山東恒美公司；DNA電泳儀：Bj Liuyi Biotechnology。

2 方法

2.1 分組及干預(yù) 按月齡劃分小鼠年齡組，2月齡為青年期，20月齡為老年期。設(shè)定2月齡小鼠為青年組，20月齡小鼠隨機(jī)分為老年組、維生素E組、加減地黃飲子組。每組動物均為15只，以灌胃形式給藥。青年組、老年組灌注生理鹽水，每日10 mL/kg。維生素E組和加減地黃飲子組分別按0.25 g/kg、2.6 g/kg灌注對應(yīng)藥物[4]。各組均給藥60 d。

2.2 標(biāo)本采集與處理 標(biāo)本采集前以乙醚吸入方式麻醉小鼠，起效后稱重。先用眼球取血法收集血液標(biāo)本，離心后取上清液備用。取小鼠腹部手術(shù)切口，進(jìn)入腹腔后充分顯露兩側(cè)睪丸并取出，生理鹽水沖洗后稱重備用。

2.3 睪丸器官指數(shù)測算 稱量睪丸重量和小鼠體質(zhì)量。睪丸指數(shù)計算公式為睪丸重量(g)/體質(zhì)量(mg)×100%。

2.4 睪丸組織病理學(xué)觀測 石蠟包埋小鼠睪丸標(biāo)本，制作病理切片。以HE染色法觀察睪丸結(jié)構(gòu)及精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞的數(shù)量形態(tài)。

2.5 睪酮、肝功能、腎功能檢測 ELISA法檢測血清睪酮水平。全自動生化分析儀檢測血清尿素氮、肌酐、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平。

2.6 睪丸組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測 睪丸標(biāo)本經(jīng)過充分裂解，離心得到上層清液。以硫代巴比妥酸法檢測MDA活性，以酶學(xué)方法檢測SOD、GSH-Px活性[4]。

2.7 測定SIRT3基因mRNA表達(dá) 分離純化提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR法檢測。反應(yīng)條件：90℃下預(yù)變性1 min，90℃下變性15 min，60℃下退火1 min，70℃下延伸20 s，30個循環(huán)[4]。反應(yīng)體系：總反應(yīng)容積25 μL，cDNA2 μL，上下游引物均為2.5 μL。PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.8 測定SIRT3基因蛋白表達(dá) Western blot法定量測定睪丸組織蛋白表達(dá)。配制工作液，提取標(biāo)本蛋白。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，先后經(jīng)過一抗、二抗，曝光[4]。圖像以Med8.0數(shù)碼系統(tǒng)分析。

3 結(jié)果

3.1 各組睪丸器官指數(shù)比較 青年組睪丸器官指數(shù)最高，其余3組顯著下降(P<0.05)。比較老年組，維生素E組和加減地黃飲子組器官指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組器官指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組睪丸器官指數(shù)比較

3.2 各組睪丸病理學(xué)比較 HE染色后，在10×20倍光鏡下閱片觀察。青年組小鼠睪丸結(jié)構(gòu)飽滿，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子數(shù)量豐富，排列整齊有序，組織間隙支持細(xì)胞含量較多。老年組睪丸結(jié)構(gòu)變形，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子數(shù)量減少，排列雜亂，組織間隙支持細(xì)胞含量減少。與老年組比較，維生素E組和加減地黃飲子組睪丸組織結(jié)構(gòu)清晰穩(wěn)定，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞增多。與維生素E組比較，加減地黃飲子組精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞數(shù)量更為豐富。見圖1。

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加減地黃飲子組圖1 各組睪丸組織病理學(xué)比較

3.3 各組睪酮、肝功能、腎功能水平比較 青年組睪酮水平最高，老年組下降(P<0.05)；比較老年組，維生素E組睪酮差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，加減地黃飲子組升高(P<0.05)；比較維生素E組，加減地黃飲子組睪酮升高(P<0.05)。詳見表3。青年組肝腎功能指標(biāo)數(shù)值最低，其余3組指標(biāo)升高(P<0.05)，但均在正常值范圍內(nèi)；3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表3 各組睪酮水平比較

表4 各組BUN、Scr、ALT、AST水平比較

3.4 各組睪丸組織MDA、SOD、GSH-Px水平比較 青年組MDA水平最低，SOD、GSH-Px水平最高。老年組MDA上升，SOD、GSH-Px下降(P<0.05)。比較老年組，維生素E組SOD上升(P<0.05)，GSH-Px和MDA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；加減地黃飲子組MDA降低，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組MDA下降，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組SOD、GSH-Px、MDA水平比較

3.5 各組睪丸組織SIRT3基因mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 青年組SIRT3基因mRNA及蛋白表達(dá)水平最高。老年組小鼠睪丸組織SIRT3基因mRNA及蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。比較老年組，維生素E組SIRT3基因mRNA及蛋白表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；加減地黃飲子組mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組SIRT3基因表達(dá)升高，mRNA及蛋白表達(dá)一致(P<0.05)。詳見表6、圖2。

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加減地黃飲子組圖2 各組睪丸組織SIRT3基因蛋白表達(dá)水平比較

表6 各組SIRT3基因mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

睪丸是男性生殖系統(tǒng)的重要器官，既是生殖功能的核心，也是雄性內(nèi)分泌功能的關(guān)鍵。男性從出生到成熟，從強(qiáng)壯到衰老，從生精到雄激素分泌，睪丸的生理作用伴隨終生。人體進(jìn)入老齡后，所有系統(tǒng)都在衰老，生殖系統(tǒng)也不例外。但生殖系統(tǒng)衰老對男性具有特殊意義。一方面人體失去繁衍生殖的能力，另一方面睪酮缺乏出現(xiàn)疲倦、乏力、焦慮、抑郁和性功能下降一系列身心紊亂的表現(xiàn)。而后者給生活帶來的影響更大，對衰老的恐懼，對性功能和強(qiáng)壯肌體的喪失，讓男性產(chǎn)生巨大心理壓力。因此如何干預(yù)睪丸衰老，什么時間、什么方式干預(yù)衰老，及時有效的干預(yù)睪丸衰老具有現(xiàn)實(shí)研究意義[10]。

目前研究表明中藥具有延緩衰老的確切作用，尤其是補(bǔ)腎的方劑千百年來層出不窮，通過補(bǔ)腎填精來延年益壽已成為歷代醫(yī)家的共識。腎藏精，主生殖。《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載腎精貫穿男性生殖始終。男子“二八，腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉”，腎精充盈出現(xiàn)遺精射精，為生殖初始?！拔灏耍I氣衰，發(fā)墮齒槁”，腎精不足而開始肌體衰老?！捌甙耍旃锝?，精少……形體皆極”，腎精虛損而生殖枯竭。如何補(bǔ)腎精？不同醫(yī)家認(rèn)識不一、方藥各異，常見湯方以溫補(bǔ)腎陽治則居多。對于生殖衰老的男性，需認(rèn)識到滋補(bǔ)腎陰和腎陽同樣重要，不宜厚此薄彼。腎陰是生殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎陰虛損發(fā)生于內(nèi)，緩慢而隱匿。腎陽是生殖的功能體現(xiàn)，腎陽虛形之于外，明顯易于識別。腎陰與腎陽兩者互根互用，相互交感，水火既濟(jì)。兩者的虛損多同時發(fā)生，若只溫補(bǔ)腎陽，則孤陰不生、獨(dú)陽不長，導(dǎo)致太過溫燥而腎精不充。所以填精宜腎陰腎陽雙補(bǔ)，兼顧陰陽平衡的補(bǔ)腎方劑，以達(dá)“陰平陽秘、精神乃至”。

地黃飲子首載于《宣明論方》，選取滋腎陰、補(bǔ)腎陽的藥物，如熟地黃、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、石斛、遠(yuǎn)志等。可以補(bǔ)益下元虛衰，是治療腎虛喑痱的主方。熟地黃是方中君藥，具有延緩人體衰老的作用。其特有的活性成分熟地黃多糖具有體外抗氧化性[11]。巴戟天補(bǔ)腎強(qiáng)筋骨，可以提高皮質(zhì)醇水平，從而保護(hù)生殖系統(tǒng)、促進(jìn)生精和改善腎虛證等作用[12-14]，用于治療腎虛陽痿不育、宮寒不孕、遺精滑精等證[12-15]。肉蓯蓉補(bǔ)五勞七傷，肉蓯蓉多糖可以提高細(xì)胞核內(nèi)P-CREB水平，增加環(huán)腺苷酸及cAMP依賴蛋白激酶活性[16-18]。地黃飲子具有提高大鼠SOD、CAT、GSH，降低MDA的作用，清除自由基而對抗氧化損傷[19]。

維生素E具有公認(rèn)的抗氧化應(yīng)激作用，因此是抗衰老實(shí)驗(yàn)最常選擇的對照藥物。維生素E作為抗氧化劑，長久以來應(yīng)用于男科生殖疾病。對于精子活力不足的弱精子癥，維生素E一直是專家共識的推薦藥物。本實(shí)驗(yàn)中維生素E組睪丸的病理結(jié)構(gòu)明顯改善，SOD活性升高表明維生素E作為對照藥物的正確性和有效性。但在睪酮改善方面未看到顯著作用。

病理學(xué)顯示老年組睪丸組織整體出現(xiàn)萎縮、結(jié)構(gòu)雜亂，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞排列松散、數(shù)量減少，精子細(xì)胞、精子較青年組明顯減少。表明老年組小鼠生精功能進(jìn)入衰退期。加減地黃飲子組睪丸組織結(jié)構(gòu)相對清晰穩(wěn)定，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和支持細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)多于老年組。表明睪丸結(jié)構(gòu)的衰老得到了延緩，生精功能的細(xì)胞基礎(chǔ)得到了保護(hù)。

睪酮是雄激素最主要的成分，在男性血液中按晝夜節(jié)律不停地分泌。對維持性欲、性征、性功能，促進(jìn)精子成熟，對中樞系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和免疫功能都有著重要的作用。某種程度上男人是雄激素的“作品”。本研究中與青年組比較，老年組睪酮明顯降低，這與睪丸病理學(xué)改變相一致。而加減地黃飲子組無明顯降低，表明本方對小鼠雄激素分泌產(chǎn)生了干預(yù)作用。對于延緩睪丸衰老，睪酮是干預(yù)的靶點(diǎn)，也是療效評定的指標(biāo)。由于衰老因素，用藥干預(yù)60 d后老年鼠肝腎功指標(biāo)高于青年鼠，但老年組、維生素E組、加減地黃飲子組間無差異；且均在正常值范圍內(nèi)，證明藥物及療程的動物安全性。

關(guān)于解釋生物衰老原因，以及如何干預(yù)衰老，氧化應(yīng)激理論是經(jīng)典的衰老研究路徑。課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加減地黃飲子對海馬組織、腎臟組織都有對抗氧化應(yīng)激損傷，提高SOD等生物酶活性而延緩衰老的作用[4，20-21]。SOD等酶是抗衰老研究常用的指標(biāo)，具有代表意義。因此本實(shí)驗(yàn)試圖探索加減地黃飲子對睪丸組織是否具有同樣的抗衰老作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組睪丸組織SOD、GSH高于對照組，MDA低于對照組，表明氧化應(yīng)激損傷減少。SOD、GSH活性升高增加了對氧自由基的清除，MDA活性降低可以減少細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能破壞而引發(fā)的老化。在對活性酶的雙重調(diào)節(jié)下，加減地黃引子起到了減少氧化應(yīng)激損傷的作用，保留了睪丸性激素分泌功能，延緩了小鼠睪酮下降。

SIRT是Sirtuin基因家族成員，從T1到T7分布在不同的細(xì)胞器上。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)與加減地黃飲子藥效成分相關(guān)的梓醇通過調(diào)控SIRT1基因的表達(dá)，干預(yù)大鼠腎臟衰老[21]。SIRT3與人類長壽有一定相關(guān)性[22]，增強(qiáng)氧自由基清除酶的活性，減少氧自由基的蓄積，可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘發(fā)的功能性損傷和器質(zhì)性損傷。因此SIRT3與抗衰老關(guān)系密切，在動物模型中敲除該基因的小鼠迅速衰老[23]。能否影響該基因的表達(dá)來延緩睪丸衰老，這是我們重點(diǎn)關(guān)注的，因此選擇SIRT3作為重要的觀測指標(biāo)。結(jié)果顯示與睪酮、抗氧化酶升高相一致，實(shí)驗(yàn)組小鼠SIRT3基因mRNA和蛋白表達(dá)升高。根據(jù)結(jié)果分析，可能在加減地黃飲子影響下，SIRT3基因表達(dá)升高，睪丸組織SOD、GSH活性上升，減少了局部氧化應(yīng)激損傷，改善了睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能，從而影響了小鼠雄激素分泌，延緩睪丸衰老。綜上分析加減地黃飲子具有一定的延緩小鼠睪丸衰老作用，對SIRT3基因的影響可能是其內(nèi)在機(jī)制。