袁柔剛，趙曉麗，張欣文*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,西安 712046;2.西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院婦女保健中心,西安 710004)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是婦產(chǎn)科常見的妊娠并發(fā)癥之一,也是婦產(chǎn)科生殖免疫相關(guān)的常見疾病,嚴重威脅廣大女性的身心健康。雖然RSA發(fā)病大多有明確的病因,但臨床上仍然有許多RSA的觸發(fā)因素仍未被發(fā)現(xiàn),其中大部分被認為與免疫異常有關(guān)。在正常妊娠過程中,各種免疫細胞和細胞因子共同作用,形成一種免疫耐受性,使胚胎能夠成功地逃避母體免疫系統(tǒng)。自然殺傷細胞(NK細胞)是近年來免疫學(xué)家所關(guān)注的熱點,這些細胞在負責(zé)識別/殺死異常分化、形態(tài)學(xué)發(fā)生異常改變及受到感染的細胞的過程中發(fā)揮重要作用。在妊娠過程中,蛻膜自然殺傷細胞(dNK細胞)數(shù)量持續(xù)增加,且保持與滋養(yǎng)層細胞的密切接觸,因而dNK細胞與滋養(yǎng)層細胞在母胎界面的相互作用可以看做是母體對胎兒的同種抗原識別存在免疫耐受從而達到對胎兒免疫保護的細胞基礎(chǔ)[1]。埃及亞蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院的El-Badawy等[2]在對RSA婦女外周血殺傷免疫球蛋白樣受體的研究中發(fā)現(xiàn),根據(jù)CD16和CD56的相對表達,NK細胞主要包括兩種不同的亞群,即CD56dimCD16bright亞群和CD56brightCD16dim亞群。外周血中CD56brightNK細胞占17.5%,蛻膜中CD56brightNK細胞占17.3%;血液和蛻膜中CD56dimNK細胞均高于CD56brightNK細胞。而對于這些細胞的功能,研究發(fā)現(xiàn)dNK細胞既可以在母胎界面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[3],同時也在滋養(yǎng)層細胞侵襲和血管重塑的調(diào)節(jié)中也起著關(guān)鍵作用[4-5]。

這些NK細胞在識別/殺傷靶細胞的過程中,需要依賴NK細胞表面的抑制性受體和激活性受體同靶細胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子相互作用,使得抑制性信號和激活性信號之間的平衡發(fā)生改變所產(chǎn)生的組合信號去識別體內(nèi)的異常。NK細胞表面受體豐富多樣,這些受體與其配體在自然流產(chǎn)的發(fā)病過程中可能存在不同的調(diào)控作用。NK細胞表面受體主要分為兩個家族:免疫球蛋白超家族[包括殺傷免疫球蛋白樣受體(KIRs)家族、天然細胞毒受體(NCR)和LIR(白細胞Ig樣受體)/ILT(免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄本)LIR受體)]和C型凝集素家族[CD94/NKGs和CD94/NKG2受體(自然殺傷基因)、NKG2D受體][6]。在妊娠過程中,它們通過各種免疫調(diào)節(jié)機制促進母體對胚胎的接受。NK細胞表面受體(Natural killer cell receptor,NKR)是NK細胞活性的中樞調(diào)節(jié)因子[7]。但是對于各類受體具體的調(diào)節(jié)機制仍未研究清楚。本文將針對以上所提及的受體及其配體在自然流產(chǎn)中的發(fā)病、調(diào)控機制的相關(guān)研究進展進行綜述。

一、殺傷性免疫球蛋白樣受體(killer immunoglobulin-like receptor,KIR)

多數(shù)調(diào)節(jié)dNK細胞功能的激活和抑制受體都屬于高度多態(tài)性的KIR家族。識別人類白細胞抗原HLA-I類分子的KIRs對NK細胞功能尤為重要,在母胎界面只有絨毛外滋養(yǎng)層(EVT)表達選擇性HLA-I類分子,所有其他類型的滋養(yǎng)層細胞都沒有HLA表達[8]。由于KIR和HLA基因的變異性,每次妊娠都會有一個獨特的KIR和HLA-I的組合,這與NK細胞直接與滋養(yǎng)層相互作用的事實相結(jié)合,表明KIR和HLA可能在RSA中發(fā)揮作用。EVT表達HLA-C、HLA-E及HLA-G[9-10],如果抑制性KIR與自身HLA-I類分子之間相互作用,它們就會抑制dNK細胞的激活,從而損害滋養(yǎng)層細胞[11-12]。

KIRs可以根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)和功能進行分類。每個KIR分子由兩個或三個胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(分別為2D和3D分子)、一個跨膜區(qū)和一個短(S)或長(L)的胞內(nèi)尾巴組成[11-13]。KIRs在NK細胞亞群上表達,可能影響該細胞的活化,要么通過抑制性KIRs[帶有長(L)細胞質(zhì)尾巴的KIR2DL和KIR3DL,包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMs)]來抑制細胞激活,要么通過激活性KIRs[KIR2DS和KIR3DS,短(S)細胞質(zhì)尾巴沒有信號基序,但與適配分子DAP12同源二聚體相關(guān),具有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAMs)]來激活細胞。

KIR是表達在NK細胞和T淋巴細胞膜上的跨膜糖蛋白,在與靶細胞表面配體識別相關(guān)的NK細胞胞外片段上具有特征性的免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域。所有KIR基因都編碼在19號染色體(19q14.3)的白細胞受體復(fù)合體(LRC)中,LRC包括KIR家族的15個基因,編碼KIR的基因具有多態(tài)性;LRC中存在的KIR基因除了具有多態(tài)性,其數(shù)量還存在很強的單倍型變異性;兩種類型的KIR單倍型(A和B),可以被KIR家族的15個基因所定義[11-15],即KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3D、KIR3DL3和KIR3DS1[10-16]。

目前鄭州大學(xué)附屬人民醫(yī)院蘇寧教授團隊進行了關(guān)于KIR基因和HLA-C配體影響漢族人口復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的研究[16],該研究檢測了110例原因不明的RSA漢族女性和105例健康漢族女性的KIR和HLA-C基因,探究是否某些基因型更容易發(fā)生流產(chǎn),結(jié)果表明:與對照組相比,RSA患者組KIR3DL1基因頻率明顯降低,KIR2DS1基因頻率明顯更高,但是兩組KIR基因頻率及不同KIR單倍型差異無統(tǒng)計學(xué)意義;抑制基因的減少和激活基因的增加可能誘導(dǎo)子宮蛻膜自然殺傷細胞(dNK細胞)的激活,從而降低胎兒存活的概率導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。這項研究提示母系KIR和HLA-C基因與中國漢族女性RSA之間存在關(guān)聯(lián),但是并未對其機制進行更加深入的研究。無論如何,這些研究結(jié)果對我們關(guān)于KIR受體基因在RSA發(fā)生中機制的探索有一定的啟示。

二、天然細胞毒受體(natural cytotoxicity receptors,NCR)

NCR隸屬于免疫球蛋白超家族,包括自NCR-1(即NKp46)、NCR-2(即NKp44)、NCR-3(即NKp30)[16],這些受體在識別幾乎不表達主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的靶細胞中發(fā)揮重要作用。NCR在NK細胞胞外部分也具有免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域,因此將之歸屬于免疫球蛋白超家族。這類受體識別的配體包括應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白(NKG2D的配體)、病毒蛋白(如血凝素)、pp65(NKp44、NKp46和NKp30的配體)及一些尚未鑒定的腫瘤配體[17-18]。

由于NCR缺乏免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAMs),因此它們只能通過含有ITAM的相關(guān)分子向胞內(nèi)傳遞激活信號[19]。NKp46和NKp30可以在靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)的NK細胞上表達,而NKp44僅在激活的細胞上表達。NKp30可以轉(zhuǎn)錄成不同的變異體,其中NKp30a、NKp30b和NKp30c是最豐富的異構(gòu)體,每個異構(gòu)體都有不同的功能,NKp30a和NKp30b傳遞激活信號,而NKp30c傳遞免疫抑制信號;NKp46和NKp44可以轉(zhuǎn)錄成幾種異構(gòu)體,但NKp46沒有發(fā)現(xiàn)剪接變異體的功能差異,且NKp44存在抑制性異構(gòu)體[20];此外,3種NCR都被多次證明可以誘導(dǎo)子宮NK細胞的細胞毒作用和細胞因子的產(chǎn)生,但其中只有NKp46能誘導(dǎo)dNK細胞的細胞毒作用[21];另NKp30可以促進細胞因子的分泌,而NKp44在dNK細胞中具有抑制功能[22]。

日本Fukui教授團隊[23]對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或著床失敗婦女子宮內(nèi)膜NK細胞上NCR和細胞因子的表達進行了研究,主要研究了復(fù)發(fā)性妊娠丟失(RPL)婦女子宮內(nèi)膜NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表達和NK細胞的產(chǎn)生,采用流式細胞術(shù)檢測子宮內(nèi)膜NK細胞中NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表達,實驗收集了34例著床失敗婦女和74例對照組的分泌中期子宮內(nèi)膜的NK細胞,分析孕婦外周血NK細胞NCR的表達狀況;結(jié)果顯示NCR表達及細胞因子產(chǎn)生發(fā)生了改變,特別是dNK細胞NKp46表達降低,這提示了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性可能存在NK細胞調(diào)控異常。但是這項研究也只是探究了幾種NCR在RSA患者中的表達情況,并未對之具體的機制進行深入研究。

NKp46又可細分為NKp46dim和NKp46bright。Mai等[24]研究了NKp46受體在決定生殖結(jié)果中的作用,通過收集流產(chǎn)婦女的子宮內(nèi)膜,根據(jù)妊娠反應(yīng)試驗結(jié)果將子宮內(nèi)膜分為妊娠組和妊娠失敗組,采用多色流式細胞術(shù)分析NKp46受體及NK細胞上表達的其他激活或抑制受體及NK細胞產(chǎn)生的細胞內(nèi)因子;結(jié)果發(fā)現(xiàn)根據(jù)與NK細胞相關(guān)的不同熒光強度,NKp46受體在生殖中發(fā)揮不同的作用,即NKp46dimNK細胞參與殺死細胞,而NKp46brightNK細胞參與細胞因子的產(chǎn)生;這表明NKp46可能是觀察胚胎耐受條件的預(yù)測標記,說明該受體在RSA患者發(fā)生過程中扮演重要的角色。此項研究并未對NK細胞受體與各自的HLA抗原在RSA患者中的相互作用進行深層次的探討,但對于我們?nèi)蘸笤贜K細胞受體與各自的HLA抗原在不明原因RSA(URSA)中的相互作用的研究有一定的啟示意義。

三、白細胞免疫球蛋白樣受體(leukocyte immunoglobulin receptor,LILR)/免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄體(Immunoglobulin-like transcript,ILT)

白細胞免疫球蛋白樣受體(LILR)家族的一些成員,也被稱為免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄體(ILT),其存在于人類胎盤中;白細胞免疫球蛋白樣受體家族B成員1(LILRB1,即ILT2)主要在基質(zhì)細胞上被發(fā)現(xiàn),而白細胞免疫球蛋白樣受體家族B成員2(LILRB2,即ILT4)除了基質(zhì)細胞外,也在平滑肌層的血管周圍發(fā)現(xiàn);LILR是一種含有細胞外配體結(jié)合免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)的I型跨膜糖蛋白,因此被歸類為免疫抑制性受體[24]。這些受體類似于KIR,編碼在19號染色體(19q14.3)上,且LILR比KIR分布更廣。

HLA-G隸屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子,由 HLA-G基因編碼,最初在滋養(yǎng)層細胞被發(fā)現(xiàn)。滋養(yǎng)層細胞屬于蛻膜侵入細胞,對于母體而言屬于同種異體移植物,HLA-G在滋養(yǎng)層細胞中高表達,而HLA-G能夠直接抑制NK細胞的殺傷作用,從而保護胎兒細胞免受NK細胞的攻擊[25]。HLA-G四聚體的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)是由ILT受體介導(dǎo)的,主要由ILT4介導(dǎo),ILT2也有一定的貢獻,但只有當后者高水平表達時才能介導(dǎo),ILT2在所有女性dNK細胞中的表達率為20%～25%。ILT2和ILT4均存在于所有蛻膜巨噬細胞上,當ILT2和ILT4與滋養(yǎng)層細胞上的HLA-G結(jié)合時,ILT2和ILT4的抑制功能可能會抵消KIR2DL4的激活信號;LILRB1在細胞質(zhì)區(qū)域含有一個酪氨酸的免疫受體開關(guān)基序,既可以作為激活受體發(fā)揮作用,也可以發(fā)揮抑制功能,LILRB1與HLA-G的結(jié)合比與經(jīng)典的HLA-I類分子結(jié)合更強,并且HLA-G四聚體比單體形式更有效地誘導(dǎo)LILRB1信號[26]。

近年來,對于母胎界面蛻膜NK細胞表面抑制性受體LILR/ILT與其配體HLA-G在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中表達及作用的研究少之又少,因而對母胎界面這兩者之間關(guān)系深層次的探究也可以作為對流產(chǎn)機制探索的新方向[27]。

四、分化決定簇抗原94(Cluster of differentiation 94,CD94)/自然殺傷細胞凝集素樣受體亞家族C成員1(NK cell lectin-like receptor subfamily C member-1,NKG2A)

CD94/NKG2A是一種存在于NK細胞和某些T細胞上的受體,由CD94與NKG2分子家族其他成員通過共價鍵結(jié)合而成;這兩種分子都是C型凝集素超家族的糖基化成員,CD94/NKG2A受體是HLA-E與特定MHC I類分子信號序列特異性衍生而來的肽分子,信號序列衍生肽的位置在決定HLA-E/肽復(fù)合物是否對NK細胞介導(dǎo)的裂解作用具有抗性方面至關(guān)重要[28]。針對這一點,美國國家過敏和傳染病研究所的Brooks等[29]證實CD94/NKG2A特異性與HLA-E相互作用,并證明這種相互作用依賴于HLA-E與上述衍生肽的結(jié)合;此外,通過對CD94/NKG2A+ NK細胞的功能分析,并沒有觀察到CD94/NKG2A與經(jīng)典HLA I類分子之間的相互作用,他們還評估了HLA-E相關(guān)肽在HLA-E和CD94/NKG2A相互作用中的功能,發(fā)現(xiàn)所有I類先導(dǎo)序列多肽均需要與HLA-E結(jié)合,并被CD94/NKG2A所識別?？梢哉fHLA-E對CD94/NKG2A的特異性識別是由肽在兩個水平上控制的:首先,肽必須穩(wěn)定HLA-E,促進其在細胞表面表達;另外,HLA-E/肽復(fù)合物必須形成CD94/NKG2A的配體[29]。由于NK細胞表面受體主要通過其抑制性受體發(fā)揮其細胞毒作用,而CD94/NKG2A作為這樣的受體,在體內(nèi)NK細胞剛開始發(fā)育就開始緩慢合成表達,白細胞介素-15可以與其他多種細胞因子可以共同促使祖細胞的分化和增強CD94的表達[29]。

在妊娠過程中,NK細胞對胎盤的形成至關(guān)重要,而胎盤是一種能夠控制生長中的胎兒所需氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供給的關(guān)鍵器官。dNK細胞不會攻擊不相匹配的胎兒及其胎盤,相反,它們幫助局部血管耐受滋養(yǎng)胎兒所需的變化?？刂芅K細胞功能取決于HLA-I類與抑制性NK細胞受體的相互作用[30];人類首先進化出HLA-E與CD94/NKG2A的相互作用,HLA-E在滋養(yǎng)層細胞表面作為CD94/NKG2A的配體,在CD94/NKG2A抑制受體和HLA的驅(qū)動下,子宮dNK細胞促使它們在母胎界面?zhèn)鬟f這些關(guān)鍵功能,其次才逐漸建立了HLA-A、HLA-B和HLA-C與KIR的多種相互作用[31]。

五、自然殺傷細胞凝集素樣受體亞家族B成員2(NK cell lectin-like receptor subfamily B member-2,NKG2D)

NKG2D免疫受體在大多數(shù)NK細胞上表達[3],孕早期dNK細胞NKG2D表達降低,在孕中期NKG2D表達增加[32]。NKG2D屬于C型凝集素受體家族,其配體為MHCⅠ類同系物MICA和MICB。人應(yīng)激誘導(dǎo)的MHC Ⅰ類鏈(MIC)相關(guān)蛋白A和B(MICA/B)分子與其同源受體NKG2D的相互作用,是一種免疫逃逸機制;MIC分子是表達于人dNK細胞表面的NK細胞激活受體NKG2D的配體,在體內(nèi)可以作為細胞應(yīng)激信號,并觸發(fā)一系列免疫效應(yīng)功能;MIC分子能夠與NKG2D受體相互識別并交聯(lián)使得免疫細胞能夠?qū)ν庾R別和攻擊出現(xiàn)的應(yīng)激細胞,同時不需要MHC I類表達或抗原識別;據(jù)此可以說MIC/NKG2D相互作用是一種有效的免疫監(jiān)測機制[33-34]。此外,磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3)的激活是形成NKG2D免疫突觸所必需的;在人體NK細胞上,NKG2D受體的刺激信號可以通過相關(guān)的DNAX相關(guān)蛋白10(DAP10)適配器介導(dǎo),NKG2D本身參與刺激NK細胞形成免疫突觸,并可以把NKG2D招募到中心突觸,在這過程中PIK3的結(jié)合位點是必不可少的,且在刺激新號傳遞前足以將DAP10招募到NK細胞免疫突觸的位置[35]。

在女性妊娠期間,母體對胎兒的免疫耐受與胎盤產(chǎn)生的許多免疫抑制因子有密切關(guān)系。胎盤源性外泌體作為一種新的免疫調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)在母體免疫耐受中,外泌體是形態(tài)明確的膜狀納米大小的囊泡,是由內(nèi)泌體多囊體(MVB)與質(zhì)膜融合而成后分泌而來,通過代理傳遞細胞與細胞之間的接觸,在接觸過程中,外泌體轉(zhuǎn)移相關(guān)分子,使之具有新的特性并且重新編程受體細胞。人胎盤滋養(yǎng)層細胞在整個妊娠過程中能夠不斷地分泌外泌體,這些外泌體直接在胎盤絨毛膜周圍的母體血液中傳遞,發(fā)揮其免疫抑制功能[36-37]。MICA和MICB在妊娠期間由胎盤表達,與合胞滋養(yǎng)細胞的內(nèi)泌體多囊體分選,通過攜帶MIC的外泌體釋放[38]。

NKG2D在母胎界面針對胎兒的母體免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)。dNK細胞聚集在母體-胎兒界面,在妊娠期間發(fā)揮重要作用;在dNK細胞表面,NKG2D配體通過與相應(yīng)受體結(jié)合激活細胞。在孕婦正常妊娠過程中,合體滋養(yǎng)細胞能夠?qū)ICA和MICB分泌到血清中,干擾NKG2D介導(dǎo)的母體對抗胎兒的免疫反應(yīng);MICA和MICB水平的降低與dNK細胞上NKG2D水平的增多相關(guān),這個過程可能參與了RSA的發(fā)病[39]。Sondes等[40]對RSA中NK細胞受體NKG2D及其配體MICA的基因多態(tài)性進行了實驗探究,目的是探討NKG受體基因多態(tài)性和MICA基因多態(tài)性與RSA的可能關(guān)系;此項實驗通過等位基因鑒別檢測患者和對照組女性NKG2D基因的7個單核苷酸多態(tài)性(rs1049174、rs2255336、rs2617160、rs2617161、rs2246809、rs2617169和rs2617170)、NKG2A基因的1個單核苷酸多態(tài)性(rs1983526)和MICA基因的1個單核苷酸多態(tài)性(MICA129);實驗結(jié)果也提示NKG2D基因多態(tài)性可能影響婦女的妊娠成功率。

根據(jù)查閱文獻,發(fā)現(xiàn)目前在婦產(chǎn)科學(xué)中對于NKG2D的研究多集中于卵巢腫瘤及病毒感染機體的免疫層面,而對其在反復(fù)自然流產(chǎn)的母胎界面方面的研究少之又少。這也可以為我們對于自然流產(chǎn)的免疫機制相關(guān)研究提供新方向。

六、結(jié)語

RSA婦女受孕前后NK細胞數(shù)量與其細胞膜表面受體的增加是一個重要的臨床問題,dNK細胞被認為是胚胎被母親“排斥”(同種異體免疫流產(chǎn))的主要細胞群。根據(jù)目前已有的對于dNK細胞表面受體的研究,胚胎排斥反應(yīng)可能是NK細胞同種異體識別系統(tǒng)缺陷的結(jié)果。即自然流產(chǎn)患者dNK細胞的毒性與母胎界面各種NK細胞表面受體與其相關(guān)配體缺乏表位匹配密切相關(guān),通過受體-配體之間的匹配減弱或缺失,dNK細胞的激活沒有被阻斷,從而NK細胞的殺傷作用占據(jù)主導(dǎo)地位,使其獲得殺傷許可,從而無阻礙地破壞滋養(yǎng)層,導(dǎo)致妊娠失敗。由于NK細胞相關(guān)的免疫識別系統(tǒng)的復(fù)雜性使研究人員對于分析其對妊娠結(jié)局的影響變得十分棘手,也因此生殖過程中的免疫或免疫遺傳機制的研究對我們研究自然流產(chǎn)仍然是一個挑戰(zhàn)。增加對KIR/HLA-C復(fù)合體、NCR的幾種亞型NKp44/NKp46/NKp30、LIR/ILT/HLA-G復(fù)合體、CD94/NKG2A復(fù)合體和NKG2D的研究,有助于更好地理解母胎界面NK細胞表面免疫受體及其配體相互識別發(fā)揮作用的妊娠模型,有助于對不明原因的自然流產(chǎn)患者進行病因分析,甚至于在將來為不明原因的自然流產(chǎn)患者的治療提供思路,如研究針對相關(guān)受體和/或其相關(guān)配體的靶向治療藥物等[1]。