循環(huán)腫瘤細(xì)胞在前列腺癌中的應(yīng)用

韓明帥 武英欣 金訊波，2

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)研究生部，山東 濟(jì)南 250024；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)南 250021

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是全球癌癥新發(fā)的第3大腫瘤，2020年全球有新發(fā)病例1 414 259人，新增死亡病例375 304 人［1］。在男性中，PCa 是112個(gè)國家最常診斷出的癌癥，在死亡率方面，位于前三位的是肺癌、 PCa和肝癌。

前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）篩查在各級醫(yī)院的廣泛應(yīng)用，使得部分患者在診斷時(shí)腫瘤還較為局限，部分患者可以選擇根治性手術(shù)或根治性放射治療，得到令人滿意的臨床預(yù)后，其五年生存率接近100%，但仍有一部分患者腫瘤會(huì)繼續(xù)進(jìn)展，甚至出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性病例的五年生存率為29.8%［2］。即使在初期經(jīng)過雄激素剝奪療法（androgen deprivation therapy， ADT）治療得到了很好地控制，隨著時(shí)間的延長，很大一部分患者還是會(huì)進(jìn)展到轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）階段，這一階段是PCa 患者死亡的最主要階段。前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）雖然是唯一批準(zhǔn)的指導(dǎo)PCa 治療決策的生物標(biāo)志物，由于敏感性和特異性不足［3］，且無法區(qū)分病理階段［4］，因此迫切地需要尋找可靠的替代標(biāo)志物，指導(dǎo)PCa的診療。

液體活檢由于其具有簡單微創(chuàng)等特點(diǎn)，近年來受到了廣大臨床醫(yī)生及研究者的關(guān)注。在PCa這個(gè)領(lǐng)域，最具代表的就是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell， CTC）檢測，CTC 是來源于腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落而進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，與原發(fā)腫瘤具有一致性，具有一定原發(fā)腫瘤的特征。近年來眾多研究者試圖通過研究CTC的特性，探究原發(fā)腫瘤的特征，使用CTC 等生物標(biāo)志物指導(dǎo)PCa 的個(gè)性化治療，為患者進(jìn)行更加精準(zhǔn)的治療提供了可能性［5］。眾所周知，PCa 是一種高度異質(zhì)性的疾?。?］，一些患者腫瘤表現(xiàn)為惰性，另一些則表現(xiàn)為高度侵襲性，在這種情況下確定預(yù)后轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要，需要更全面的風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后標(biāo)志物，改善局限性PCa患者的管理，確定進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)高的病例，也要確定對特定療法有益的預(yù)測生物標(biāo)志物，以幫助醫(yī)生在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間為患者選擇最合適的治療方案［3，6］。CTC 代表擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞，并在監(jiān)測轉(zhuǎn)移、評估治療效果和促進(jìn)早期檢測、治療耐藥性方面為個(gè)體患者的治療提供重要的臨床信息［7］。

1 CTC檢測平臺

CTC 是通過基于血液的液體活檢獲得的，由于侵入性最小，因此可以實(shí)時(shí)監(jiān)測癌癥［8］。近年來，已經(jīng)涌現(xiàn)出眾多的CTC檢測的技術(shù)平臺，主要是依據(jù)CTC 的免疫親和力及物理特性（腫瘤細(xì)胞的大小、密度）來進(jìn)行CTC檢測。依據(jù)CTC的物理特性進(jìn)行CTC 檢測的平臺，因其可靠性和廉價(jià)性使其成為一種廣泛使用的CTC分離方法，但其消除白細(xì)胞污染的能力有限，導(dǎo)致純度低于1%。因此，研究人員通常使用其系統(tǒng)作為初始富集步驟，然后再使用其他策略進(jìn)行額外處理［9］。

基于免疫親和力進(jìn)行檢測的平臺種類眾多，應(yīng)用最廣泛，其中最具代表性的是CellSearch 系統(tǒng)，CellSearch 系統(tǒng)是唯一獲得美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration， FDA）授權(quán)的CTC 檢測系統(tǒng)，也是在該領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)。研究表明，使用CellSearch 系統(tǒng)捕獲的CTC 計(jì)數(shù)增高與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)［10］。CTC 檢測可以基于物理和生物學(xué)特性來實(shí)現(xiàn)。目前，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)個(gè)平臺來檢測CTC，每種平臺都利用CTC 的特征進(jìn)行敏感選擇和捕獲，重點(diǎn)是如何在保持微創(chuàng)的同時(shí)快速、高靈敏度、高特異性地檢測CTC［11］。該系統(tǒng)應(yīng)用上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）包被的鐵磁流體納米顆粒來選擇EpCAM陽性細(xì)胞，然后通過CK8、CK18、CK19 免疫熒光染色（immunofluorescence， IF）陽性和CD45 陰性來確認(rèn)捕獲的細(xì)胞為CTC，但該平臺捕獲的CTC 純度低，靈敏度為27% ～ 70%，特異度89% ～ 93%。目前該平臺已廣泛用于監(jiān)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌或PCa［12，13］。AdnaTest 系統(tǒng)是基于CellSearch系統(tǒng)改良的平臺，應(yīng)用涂有抗體混合物（EpCAM、MUC-1 等）的磁珠，然后通過多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）基因組分析捕獲CTC［14-15］，是從腫瘤中分離出的CTC 中檢測癌癥相關(guān)基因的代表性方法，AdnaTest 對基因檢測比CellSearch 系統(tǒng)更敏感［16］。CellCollector 系統(tǒng)是一種特殊類型磁性納米粒子平臺，該平臺是一種侵入性檢測方法，在患者靜脈內(nèi)放置EpCAM涂層線用于收集CTC，該平臺可檢測處理大量的血液，可提高CTC檢出率［17］。近年來涌現(xiàn)了很多微流控平臺，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)CTC檢測、分離，更重要的是能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)［18］。

Ephesia系統(tǒng)屬于最新一代捕獲平臺，將免疫磁珠與微流體的優(yōu)勢相結(jié)合，同時(shí)也結(jié)合CTC的免疫親和力及物理特性（腫瘤細(xì)胞的大小、密度）來進(jìn)行CTC 檢測，解決了單一平臺的缺點(diǎn)［19］。該平臺具有高特異度（100%）、高靈敏度（99.1%）、高活性（被捕獲細(xì)胞的活力保持在98%）的特點(diǎn)，應(yīng)用前景巨大［20］。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，未來會(huì)出現(xiàn)更加優(yōu)越的平臺，重點(diǎn)也將從量化轉(zhuǎn)向分子分析［21］。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在PCa中的應(yīng)用

2.1 CTC在早期局限性PCa中的應(yīng)用

PSA雖然是唯一批準(zhǔn)指導(dǎo)PCa治療決策的生物標(biāo)志物，但通常不代表當(dāng)前腫瘤狀態(tài)［4］，需要尋找其他可靠的替代標(biāo)志物，指導(dǎo)PCa的診療，許多研究者在此方向付出努力。Meyer 等［22］研究共納入152 例局限性PCa 患者，僅在17 例（11%）患者中檢測到CTC，并發(fā)現(xiàn)CTC的檢測與PSA、生化復(fù)發(fā)沒有顯著相關(guān)性。Mandel 等［23］研究納入33 例局限性PCa 患者，共16例（48.5%）患者在PCa 根治性切除術(shù)前檢測到存在CTC，也未發(fā)現(xiàn)其與臨床參數(shù)之間存在顯著相關(guān)性?？傊谠缙诰窒扌訮Ca階段，多數(shù)研究者認(rèn)為，CTC 陽性與否與臨床病理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)參數(shù)、PSA、生化復(fù)發(fā)等沒有顯著相關(guān)性［22，24-25］，目前尚不清楚是否因CTC 的陽性檢出率（11% ～ 48.5%）較低［22-26］，或是因早期患者體內(nèi)CTC 較少以至于不適合CTC檢測，還需要更多研究證明。

隨著檢測平臺的進(jìn)步，情況正在發(fā)生變化。Theil 等［27］研究納入16 例局限性PCa 患者，比較了CellSearch 和CellCollector 2 種CTC 檢測平臺。CellCollector 和CellSearch 的陽性率分別為43.75%和12.5%。CellCollector系統(tǒng)的CTC檢出率較高，未來可能為非轉(zhuǎn)移性PCa患者的診斷及治療提供較大的作用。Kuske 等［28］又創(chuàng)新性地將CellSearch 與CellCollector 和EPISPOT 測定（基于白細(xì)胞消耗對CTC 富集）進(jìn)行比較，研究表明，只有EPISPOT 檢測到的CTC 與臨床參數(shù)［如PSA 值（P＜ 0.001）］和臨床腫瘤分期（P= 0.04）顯著相關(guān)。但是相關(guān)研究較少，納入樣本少，還有待進(jìn)一步深入研究。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，會(huì)涌現(xiàn)出更加先進(jìn)的檢測平臺，可以使得CTC 檢測在早期PCa 階段的研究更加深入，將可能給這一階段的患者提供更加精準(zhǔn)的疾病監(jiān)測及治療指導(dǎo)。

2.2 CTC在mCRPC中的應(yīng)用

對于轉(zhuǎn)移性PCa 的治療，初期階段主要以ADT治療為主，但最終患者都不可避免地進(jìn)入mCRPC階段，該階段是患者死亡的最主要原因。雖然CTC在早期PCa 中的意義較小，但是對于mCRPC 來說，是有前途的生物標(biāo)志物，已經(jīng)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、PCa和結(jié)直腸癌等多種疾病中顯示出預(yù)后相關(guān)性［29-30］，CTC 計(jì)數(shù)為 ≥ 5 個(gè)/7.5mL 與較短的總生存期（overall survival， OS）顯著相關(guān)［25-26，31］。Stott 等［26］研究顯示，CTC 陽性率為64%［中位數(shù)為32 CTCs/mL；范圍為14 ～ ＞ 5 000；平均值為（116 ± 35）］。6例先前未治療的轉(zhuǎn)移性PCa患者在開始ADT治療之后，CTC 計(jì)數(shù)明顯下降，與治療引起的PSA 濃度下降一致。在隨訪期間，通過單個(gè)細(xì)胞的PSA染色鑒定的CTC 數(shù)量與血清PSA 蛋白濃度高度一致，因此該研究認(rèn)為，CTC 數(shù)量和血清PSA 濃度這2 種生物標(biāo)志物都反映了腫瘤細(xì)胞對有效治療的反應(yīng)。該研究還觀察到，術(shù)后CTC 降低存在快速和緩慢2 種模式的CTC 半衰期，認(rèn)為緩慢降低的患者體內(nèi)可能在PCa 病程早期就已經(jīng)存在微轉(zhuǎn)移灶，但大多數(shù)前列腺外腫瘤沉積物的長期生存能力有限，所以CTC最終在切除原發(fā)腫瘤后緩慢消退。如果這一假設(shè)得到證實(shí)，還將支持在轉(zhuǎn)移性病變建立前將CTC監(jiān)測作為侵襲性標(biāo)志物應(yīng)用。

大多數(shù)研究者都是使用EpCAM 抗體篩選CTC細(xì)胞，但不是所有CTC 都高表達(dá)EpCAM，有研究試圖將低表達(dá)EpCAM CTC 也納入研究，以提高CTC的檢出率。Wit 等［32］研究納入了108 例mCRPC 患者 ，共 91 例（70%）患 者 EpCAM高 CTC +EpCAM低CTC ≥ 5個(gè)細(xì)胞，EpCAM高 CTC的陽性率約為53%（56/108）。研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM高CTC ≥ 5的去勢抵抗性PCa患者與EpCAM高CTC ＜ 5的患者相比，OS 較短（P= 0.001），然而EpCAM低CTC 的存在與OS無關(guān)。Kozminsky等［31］研究納入41例轉(zhuǎn)移性PCa患者，其CTC 陽性率為100%，CTC 數(shù)量范圍為3 ～166（中位數(shù)：20） CTC/mL。CTC 的陽性檢出率不斷提高顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。CTC 提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，可以通過液體活檢研究PCa 的潛在生物學(xué)和疾病軌跡，是PCa最具前景的無創(chuàng)檢測技術(shù)之一。

2.3 CTC 衍生的雄激素受體剪接變體7（androgen receptor splice variant 7， AR-V7）檢測作為晚期PCa的預(yù)后和預(yù)測生物標(biāo)志物。

隨著研究的深入，CTC 在風(fēng)險(xiǎn)評估、治療功效監(jiān)測、耐藥性監(jiān)測、轉(zhuǎn)移預(yù)測、預(yù)后預(yù)測等多個(gè)方面顯示出巨大的潛力［28，33-35］，研究的重點(diǎn)也轉(zhuǎn)向CTC表型特征方向，在所有PCa 表型特征中最受關(guān)注的是雄激素受體（androgen receptor， AR）［36］，預(yù)后和預(yù)測標(biāo)志物最重要的例子之一是CTC 中AR-V7 的檢測［37］，研究證明CTC 中AR-V7 陽性與預(yù)后不良有關(guān)［38］。

Cattrini 等［39］研究納入39 例 mCRPC 患者，其中24 例接受了mCRPC 一線治療（A 組），15 例接受了至少兩線治療（B 組）。在B 組中發(fā)現(xiàn)的CTC+患者比例高于A 組（73.3%vs.41.7%；P= 0.054）。2/24（8.3%）例患者在A 組中被檢測到了AR-V7 陽性，5/15（33.3%）例患者在B 組中被檢測到了ARV7 陽性（P= 0.08）。與A 組相比，CTC 和AR-V7 在B 組中富集。CTC+患者的中位OS 為15.0 個(gè)月，而CTC-患者未達(dá)到（HR：7.40，95%CI：1.53 ～ 35.82；P= 0.01），AR-V7+患者的OS 估計(jì)值為4.7 個(gè)月，而AR-V7-患者未達(dá)到（HR：20.31，95%CI：5.54 ～74.49；P＜ 0.001）。證實(shí)了CTC 及AR-V7 的預(yù)后預(yù)測作用，AR-V7似乎是對ARSi治療反應(yīng)預(yù)測的最有希望的生物標(biāo)志物。Antonarakis 等［40］的研究招募了更多的患者，202例男性中有53例（26.2%） 為CTC-，113 例（56.0%）為CTC+/AR-V7-，36 例（17.8%）為CTC+/AR-V7+。該研究劃分3 個(gè)獨(dú)立的預(yù)后類別，在PSA 反應(yīng)、PSA-PFS、無進(jìn)展的生存期(progression-free-survival， PFS）和OS 方面，CTC-患者有最佳結(jié)果，CTC+/AR-V7-患者具有中間結(jié)果，而CTC+/AR-V7+患者顯示出最差的結(jié)果。研究進(jìn)一步證實(shí)了基于CTC 的AR-V7 mRNA 檢測在預(yù)測預(yù)后方面的重要性。Nimir 等［41］對來源的CTC 樣本、ctRNA 樣本和外泌體中的AR-V7 和AR-FL 檢測進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)顯示來源于CTC樣本的生物標(biāo)志物檢測是最可靠的。Re 等［42］研究納入73 例 CRPC 患者所有患者均檢測到全長雄激素受體(AR-FL)，而基線時(shí) 22%的患者為AR-V7+。AR-V7+與AR-V7-患者相比，AR-FL 表達(dá)顯著升高。按AR-FL 表達(dá)的三分位數(shù)對患者進(jìn)行分層， PFS 分別為22 個(gè)月、18 個(gè)月和4 個(gè)月。發(fā)現(xiàn)對AR 導(dǎo)向治療的抵抗與AR-V7 的存在有關(guān)，AR-FL 表達(dá)可能有助于更好地改善患者對AR 導(dǎo)向治療的反應(yīng)和生存。這2 種生物標(biāo)志物都可用于最佳治療策略的選擇。這顯示了CTC及ARV7檢測在mCRPC患者預(yù)后預(yù)測及治療選擇等方面的巨大作用。

Scher等［43］研究顯示，接受紫杉烷類藥物治療的AR-V7+患者的總生存期優(yōu)于接受ARS 抑制劑治療的患者（中位總生存期，14.3vs.7.3 個(gè)月，P=0.25）。接受ARS 抑制劑治療的AR-V7-患者的OS優(yōu)于接受紫杉醇藥物治療的患者（中位OS，19.8個(gè)月vs.12.8個(gè)月，P= 0.05）。這為需要在ARS抑制劑或紫杉醇之間選擇來改變治療方式的mCRPC 患者提供重要的依據(jù)。有效延長了患者的生存時(shí)間，為臨床工作提供了指導(dǎo)。

3 總結(jié)與展望

CTC 與早期局限性PCa 和局部進(jìn)展性高危PCa的相關(guān)性不強(qiáng)，還有待進(jìn)一步研究。在早期局限性PCa階段，大多數(shù)研究者認(rèn)為，CTC計(jì)數(shù)與臨床變量沒有顯著相關(guān)性。但隨著CTC 檢測由簡單的計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)向表型特征等更加深入研究方向以及檢測平臺的進(jìn)步，這一情況可能會(huì)發(fā)生變化。

在去勢抵抗性PCa 階段，將CTC 計(jì)數(shù)與基因檢測（AR、AR-FL、AR-V7等）、表型分析、核酸測序等相結(jié)合，可以為患者提供無創(chuàng)的連續(xù)監(jiān)測，為給予患者個(gè)性化、精確的治療提供了可靠依據(jù)。在幾項(xiàng)單中心研究中證明，在CTC中檢測到AR-V7與預(yù)后不良有關(guān)。接受紫杉烷治療的 AR-V7 陽性CTC 的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)低于使用ARS 抑制劑的患者。隨著更多的研究發(fā)現(xiàn)，對于指導(dǎo)PCa 的診斷及治療有著極其重要的意義。

未來，關(guān)于CTC的研究重點(diǎn)將從量化計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)向分子分析。根據(jù)分子特征識別可以接受特定治療的患者亞群，徹底改變了人們對PCa的理解和治療。CTC 檢測可以預(yù)測PCa 的進(jìn)展和預(yù)后，并更有效地確定合適的精準(zhǔn)治療方案，在PCa 診斷和治療中發(fā)揮重要作用，是PCa最具前景的無創(chuàng)檢測技術(shù)之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突