嵌合抗原受體T細(xì)胞治療女性高發(fā)惡性腫瘤的研究進(jìn)展和挑戰(zhàn)

張 露 趙樂樂 解思凱 李海鵬 王俊杰 李正紅

蚌埠醫(yī)學(xué)院1. 生命科學(xué)院；2.公共衛(wèi)生學(xué)院；3.精神衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蚌埠 233030

宮頸癌的相關(guān)病因是人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染，隨著HPV 疫苗的面世及推廣應(yīng)用，宮頸癌可以從病因?qū)W的角度加以預(yù)防和控制。卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的病因尚不明確，可能涉及個(gè)體、環(huán)境、遺傳等多方面的因素。由于生理結(jié)構(gòu)的差異性，乳腺癌在女性群體中的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性。從現(xiàn)狀來看，傳統(tǒng)手段對(duì)于醫(yī)治中晚期腫瘤患者收效甚微，生存率方面沒有明顯改善，腫瘤復(fù)發(fā)率高。通過基因工程改造患者的T細(xì)胞獲得嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CART）細(xì)胞，再回輸患者體內(nèi)，既可以獲得更強(qiáng)的殺傷效應(yīng)，又可以避免免疫排斥。該療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤方向取得的巨大成功促使研究者將目光轉(zhuǎn)向?qū)嶓w瘤方向，進(jìn)行了關(guān)于CAR-T療法針對(duì)女性高發(fā)惡性腫瘤治療的一系列探索。

1 CAR-T的結(jié)構(gòu)

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）是一種可移植到免疫效應(yīng)細(xì)胞（如T細(xì)胞、NK細(xì)胞）上的蛋白分子。CAR由胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域3部分組成。CAR分子發(fā)展至今已有4代。縱觀其發(fā)展史，可以發(fā)現(xiàn)第1代、第2代、第3代的區(qū)別是在前一代的基礎(chǔ)上增加與T細(xì)胞激活信號(hào)區(qū)CD3ζ 鏈融合的共刺激因子，常見的主要有CD28、CD134、CD137和0X40等［1-2］，激活T細(xì)胞內(nèi)JNK、ERK 等信號(hào)通路；最新誕生的第4 代CAR-T細(xì)胞，更多的是針對(duì)CAR-T在實(shí)際應(yīng)用中面臨的問題來設(shè)計(jì)，如在CAR-T構(gòu)建時(shí)添加不同類型的細(xì)胞因子分泌型基因序列，改變CAR-T細(xì)胞易耗竭、浸潤腫瘤組織困難等問題；設(shè)計(jì)雙抗體靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞是為了避免CAR-T療法的脫靶效應(yīng)，解決了腫瘤相關(guān)抗原特異性不足的問題。

2 關(guān)于女性高發(fā)惡性腫瘤的CAR-T療法研究

2.1 宮頸癌

有學(xué)者研究靶向E7 蛋白的CAR-T 細(xì)胞［3］。統(tǒng)計(jì)顯示約90%的宮頸癌與HPV持續(xù)感染相關(guān)［4］，相關(guān)性最大的為HPV16［5-6］。HPV16 E7： HLA CAR-T對(duì)宮頸癌細(xì)胞Ca Ski有顯著殺傷效應(yīng)；但是對(duì)HeLa殺傷效果不明顯。檢測CAR-T細(xì)胞與2種宮頸癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)上清液中γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）和白介素-2（interleukin， IL-2）等細(xì)胞因子的變化，結(jié)果同樣說明，CAR-T 對(duì)HeLa 細(xì)胞的殺傷效果更小。這提示我們，CAR-T療法應(yīng)用應(yīng)視患者自身情況而定，不能一概而論。

另一款針對(duì)宮頸癌細(xì)胞上的細(xì)胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1， PD-L1）的PD1 CAR-T 在設(shè)計(jì)上較普通三代CAR-T 更為復(fù)雜［7］。根據(jù)法國居里研究所的科學(xué)家們發(fā)表的研究結(jié)果，敲除細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling-1， SOCS1）基因可顯著改善CD4+T細(xì)胞的持久性和CD8+T細(xì)胞的作用功效［8］。為了增強(qiáng)抗原性和降低轉(zhuǎn)化活性，采用修飾的HPV16 E7 加載沉默SOCS1 的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），將DCs與PD1 CAR-T共培養(yǎng)。與對(duì)照組相比，由DCs 激活的PD1 CAR-T顯著增加了IL-2、IFN-γ 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，同時(shí)提高了抗腫瘤活性。這對(duì)改善宮頸癌免疫治療方向有很重要的啟發(fā)作用。

間皮素（mesothelin， MESO）和NK 細(xì)胞活化型受體（natural killer group 2D protein， NKG2D）的配體是過繼細(xì)胞免疫療法應(yīng)用較多的靶點(diǎn)。針對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的MESO CAR-T 和NKG2D CAR-T 也被開發(fā)出來［9-10］，它們對(duì)MESO 和NKG2D 配體陽性宮頸癌細(xì)胞系展現(xiàn)高效抑制能力；選擇免疫缺陷小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠腫瘤的生長速度和大小，MESO CAR-T和NKG2D CAR-T對(duì)不同類型宮頸癌治療效果符合預(yù)期。

2.2 子宮內(nèi)膜癌

Alba Rodriguez-Garcia 團(tuán)隊(duì)成員通過建立高表達(dá)苗勒管抑制物質(zhì)Ⅱ型受體（Müllerian inhibiting substance type 2 receptor，MISIIR）的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA 的腫瘤模型評(píng)估靶向MISIIR 的GM7 CAR-T細(xì)胞的功能［11］。研究發(fā)現(xiàn)，與空載組和對(duì)照組相比，GM7 CAR-T治療組小鼠的腫瘤體積分別減少1.8 倍和2.2 倍，體現(xiàn)了GM7 CAR-T 細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性MISIIR的抗原特異性反應(yīng)。

關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的CAR-T 治療相關(guān)基礎(chǔ)研究報(bào)道很少。2020 年11 月13 日，重慶新橋醫(yī)院和TCRCure 生物制藥有限公司合作啟動(dòng)了一項(xiàng)I/II 期臨床試驗(yàn)（NCTO4627740）［12］，目的是評(píng)估抗胎盤堿性磷酸酶（alkaline phosphatase placental，ALPP）嵌合抗原受體修飾的T 細(xì)胞治療ALPP 陽性轉(zhuǎn)移性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的安全性和有效性。主要通過出現(xiàn)不良反應(yīng)的人數(shù)，抗ALPP CAR-T細(xì)胞在ALPP陽性患者中的無進(jìn)展生存率以及輸注6 個(gè)月后ALPP 陽性患者外周血中ALPP CAR-T 細(xì)胞的數(shù)量和百分比等作為評(píng)估指標(biāo)。

2.3 卵巢癌

在卵巢癌靶向PD-L1 和粘蛋白16（mucoprotein 16， MUC16）抗原的CAR-T細(xì)胞研究中，Li等［13］構(gòu)建了PD1-anti-MUC16 dual-CAR，PD1 single-CAR，和anti-MUC16 single-CAR 的串聯(lián)片段，獲得了單、雙CAR-T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，同時(shí)靶向兩種抗原的CART細(xì)胞較靶向1種抗原的CAR-T細(xì)胞針對(duì)性更強(qiáng)。

異常血管使腫瘤生長，為免疫浸潤提供屏障，并作為促腫瘤信號(hào)的來源。Santoro 等［14］的團(tuán)隊(duì)研究靶向腫瘤血管破環(huán)或腫瘤血管破裂來提高治療效益。使用抗前列腺特異性膜抗原（anti-prostate specific membrane antigen，Anti-PSMA）的單鏈抗體J591和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域：CD3ζ，CD28和CD137來生成P28BBζ CAR-T 細(xì)胞。該細(xì)胞的效應(yīng)功能和持續(xù)性依賴于其設(shè)計(jì)中包含的信號(hào)域，CD28 和CD137 的共刺激增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的功能，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)［15］。這種同時(shí)攜帶2種共刺激因子的三代CAR-T 細(xì)胞能夠識(shí)別并殺死從婦科腫瘤中分離出的原始人類內(nèi)皮細(xì)胞。此外，它介導(dǎo)小鼠中表達(dá)hPSMA的血管腫瘤的消退。最后，在小鼠卵巢癌模型中，P28BBζ CAR-T細(xì)胞能夠消融PSMA+血管，引起腫瘤細(xì)胞二次衰竭。

5T4 滋養(yǎng)層糖蛋白（trophoblast glycoprotein，TPBG）是一種腫瘤相關(guān)抗原，在包括卵巢癌在內(nèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤的細(xì)胞表面表達(dá)。Owens等［16］評(píng)估了5T4在卵巢癌的CAR-T細(xì)胞治療中的作用。他們合成了2 種第2 代CAR 結(jié)構(gòu)體：H8-CAR 和2E4-CAR（H8 單抗對(duì)5T4 的親和力比2E4 單抗更高），發(fā)現(xiàn)H8 CAR-T或2E4 CAR-T在與卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3或OVCAR-3共培養(yǎng)時(shí)均可產(chǎn)生較高水平的 IFN-γ，并且，親和性較高的H8 CAR-T 比2E4 CAR-T 產(chǎn)生更多的IFN-γ。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與2E4 CAR-T 相比，H8 CAR-T處理的荷瘤小鼠的生存期顯著增加。

盡管CAR-T細(xì)胞有定位于腫瘤的能力，但其輸入體內(nèi)后的激活過程可被腫瘤微環(huán)境抑制。為了克服這一限制，研究人員開發(fā)出一種共表達(dá)MUC16ecto CAR 和IL-12 的構(gòu)建體（4H11-28z/IL-12）［17］。與4H11-28z CAR-T細(xì)胞相比，4H11-28z/IL-12 CAR-T 的增殖能力更強(qiáng)，分泌的干擾素-γ（interferon-γ， IFN-γ）量也更多。在重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency， SCID）小鼠上建立腫瘤模型，分泌IL-12 的4H11-28z/IL-12CAR-T 可以提高小鼠的生存率、延長T 細(xì)胞作用時(shí)間。

2.4 乳腺癌

粘蛋白28z（mucoprotein 28z，MUC28z）是一種嵌合抗原受體，包含TAB004的單鏈抗體與CD28和CD3ζ偶聯(lián)。TAB004能識(shí)別乳腺癌中異常糖基化的腫瘤形式tMUC1。研究人員用MUC28z 轉(zhuǎn)導(dǎo)人T 細(xì)胞［18］，證實(shí)MUC28z CAR-T 細(xì)胞對(duì)一組tMUC1 陽性的患者三陰性乳腺癌細(xì)胞具有特異殺傷效果，檢測發(fā)現(xiàn)MUC28z CAR-T分泌顆粒酶B、IFN-γ、其他Th1型細(xì)胞因子和趨化因子的量顯著增加。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和CAR-T安全性評(píng)估也符合預(yù)期。因此，靶向tMUC1 的MUC28z CAR-T 細(xì)胞對(duì)tMUC1 陽性三陰乳腺癌具有很高的治療潛力。

同樣是靶向粘蛋白1（Mucoprotein 1，MUC1），Bajgain 等［19］利用HMFG2 單鏈抗體構(gòu)建第一代（（1G-CD3ζ））和第二代（2G-41BB.CD3ζ）MUC1特異性CAR-T 細(xì)胞，研究利用腫瘤環(huán)境驅(qū)動(dòng)T 細(xì)胞活化。為了保護(hù)CAR-T 免受腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細(xì)胞因子的影響，將IL-4受體外域與IL-7受體內(nèi)域（4/7ICR）連接共表達(dá)，以期在富含IL-4 的腫瘤環(huán)境中，強(qiáng)化CAR-T 的遷移、增殖能力。1G CAR.MUC1 T 細(xì)胞在應(yīng)對(duì)MUCI 陽性乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出以PD-1 和T 細(xì)胞免疫球蛋白-3（T cell immunogbulin-3，TIM3）上調(diào)為特征的耗盡表型，而在富含IL-4 的背景下，2G CAR. MUC1 和4/7ICR 的共表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞T 細(xì)胞選擇性擴(kuò)增，并在體內(nèi)和體外產(chǎn)生有效和持久的腫瘤控制。這證明了使用能夠在復(fù)雜腫瘤微環(huán)境中生長的優(yōu)化設(shè)計(jì)的T細(xì)胞靶向乳腺癌的可行性。

細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor， c-Met）具有酪氨酸激酶活性，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。當(dāng)CAR-T療法應(yīng)用于臨床病人，一項(xiàng)0 期臨床試驗(yàn)（NCT01837602）評(píng)估了瘤內(nèi)注射c-Met CAR-T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的安全性和可行性［21］。乳腺癌因其病灶位置淺表，成為極少數(shù)能試驗(yàn)瘤內(nèi)注射方式的癌癥之一，瘤內(nèi)注射省去了CAR-T 細(xì)胞遷移到腫瘤組織內(nèi)部的過程，同時(shí)減少了CAR-T細(xì)胞攻擊正常組織的概率?；颊呓邮軉未瘟鰞?nèi)注射3 × 107或者 3 × 108個(gè)細(xì)胞，分別在2 例和4 例患者的外周血和注射后的腫瘤組織檢測到CAR-T mRNA，部分患者發(fā)生不良反應(yīng)未達(dá)1 級(jí)。在乳腺腫瘤內(nèi)注射c-Met CAR-T 細(xì)胞具有良好的耐受性并在腫瘤內(nèi)引發(fā)炎癥反應(yīng)。

3 CAR-T細(xì)胞用于治療婦科惡性腫瘤的挑戰(zhàn)

3.1 趨向困難

女性高發(fā)惡性腫瘤歸類于實(shí)體瘤，在基礎(chǔ)研究中，可以簡單將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)以獲得良好的殺傷效應(yīng)。但是臨床實(shí)際應(yīng)用，CAR-T需要在人體內(nèi)突破重重障礙，轉(zhuǎn)運(yùn)到癌細(xì)胞所在的位置與其表面的靶抗原結(jié)合才能發(fā)揮作用。這些障礙往往是由免疫抑制微環(huán)境所主導(dǎo)［22］。實(shí)體瘤會(huì)分泌一些趨化因子，T細(xì)胞上缺乏趨化因子受體，無法與實(shí)體瘤分泌的趨化因子，如趨化因子配體1（chemokine ligand1，CXCL1）、趨化因子配體12（chemokine ligand12，CXCL12）和趨化因子配體5（chemokine ligand5，CXCL5）［23-24］等結(jié)合，造成向腫瘤病灶的轉(zhuǎn)移過程愈發(fā)困難。國內(nèi)有學(xué)者成功制備CXCL13趨化型NKG2D-CAR-T細(xì)胞，研究其對(duì)骨肉瘤的治療應(yīng)用［25］，趨化因子CXCL13 存在于骨肉瘤細(xì)胞上，可以促進(jìn)腫瘤的侵襲與發(fā)展，趨化因子受體5（chemokine receptor，CXCR5）是CXCL13 的受體，CXCL13 可以趨化CXCR5 陽性的T 細(xì)胞歸巢到腫瘤組織發(fā)揮作用。與NKG2D-CAR-T 細(xì)胞相比，CXCL13-NKG2D-CAR-T 細(xì)胞向CXCL13 的趨化能力和對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力明顯增強(qiáng)；與靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，抗腫瘤細(xì)胞因子的分泌量和效應(yīng)細(xì)胞的體外增殖能力都有顯著提高。同時(shí)，攜帶了趨化因子受體的CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間更長，血液中CD8+T 細(xì)胞的比例升高，實(shí)現(xiàn)更好的腫瘤趨化效果和對(duì)腫瘤的抑制能力。

3.2 浸潤過程復(fù)雜

實(shí)體瘤上血管密集［26］，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和髓樣細(xì)胞形成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。這些特征成為CAR-T浸潤腫瘤微環(huán)境的阻礙［27］，即使部分浸潤，也會(huì)逐漸被浸潤的免疫細(xì)胞抑制，引發(fā)CAR-T細(xì)胞無能和耗竭。Adachi等［28］設(shè)計(jì)并構(gòu)建了表達(dá)IL-7 和趨化因子配體19（chemokine Ligand 19，CCL19）的CAR-T 細(xì)胞（7*19 CAR-T細(xì)胞），應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)機(jī)體的樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤增加，比傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞在抗腫瘤方面更具優(yōu)勢。針對(duì)免疫缺陷小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣展現(xiàn)7*19 CAR-T細(xì)胞抗腫瘤優(yōu)異的一面。

3.3 抗原特異性

腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen， TSA）的缺少也是限制CAR-T 療法在婦科惡性腫瘤上的臨床應(yīng)用的一個(gè)很重要因素。CAR-T 細(xì)胞靶向的腫瘤靶標(biāo)特異性越低，產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)——脫靶效應(yīng)的可能性就越高。CD19 CAR-T在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤取得突破性的成功，CD19就是B細(xì)胞譜系起源的惡性腫瘤中特異性相對(duì)比較高的抗原。因此，CD19 是B 細(xì)胞相關(guān)惡性腫瘤非常理想的靶標(biāo)。但是大多數(shù)正在進(jìn)行的CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)都使用的是腫瘤相關(guān)抗原［29］。

4 CAR-T治療的主要不良反應(yīng)

4.1 細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome， CRS）

CAR-T 治療后CRS 總發(fā)生率高達(dá)78.3%［30］，不得不引起重視。免疫細(xì)胞增殖后，大量細(xì)胞因子和炎癥標(biāo)志物（IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、T 淋巴細(xì)胞巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α（T lymphocyte macrophage inflammatory protein 1 α，MIP1α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-5 等）釋放入血［31］。CRS 可以導(dǎo)致機(jī)體各系統(tǒng)的功能障礙［32］。陳丹等［33］研究小劑量地塞米松預(yù)防CD19 CAR-T細(xì)胞治療后嚴(yán)重CRS的臨床應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用小劑量地塞米松進(jìn)行預(yù)防的組別，在用CD19 CAR-T 細(xì)胞治療后，嚴(yán)重CRS 反應(yīng)的發(fā)生率顯著下降。同時(shí)觀察到，這種預(yù)防性的用藥措施對(duì)CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增及治療結(jié)果無明顯影響。

4.2 溶瘤綜合征

溶瘤綜合征，顧名思義與腫瘤細(xì)胞破裂相關(guān)。CAR-T細(xì)胞引起大量腫瘤細(xì)胞死亡裂解后，細(xì)胞內(nèi)容物包括尿酸、電解質(zhì)等，會(huì)以較高的濃度釋放到血液中，超出了肝臟的代謝能力和腎臟的排泄能力，出現(xiàn)惡心嘔吐、嗜睡和心悸等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)各種危及生命的并發(fā)癥，如嚴(yán)重心律失常、急性腎功能衰竭、肌肉痙攣等［34］。

4.3 免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome， ICANS）

ICANS 表現(xiàn)為廣泛的神經(jīng)和認(rèn)知障礙，從輕微頭痛、書寫變化到失語癥、癲癇、腦水腫，甚至昏迷需要機(jī)械通氣［35-38］。Holtzman 等［39］收集了用axicabtageneciloleucel 藥物（CD19 CAR-T 細(xì)胞療法）治療復(fù)發(fā)性/難治性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者45 例，其中25 例患者出現(xiàn)ICANS，其中18 例患有嚴(yán)重ICANS。這說明ICANS的發(fā)生率和傷害性足以引起重視。同時(shí)，研究人員的一個(gè)關(guān)鍵新發(fā)現(xiàn)是基線纖維蛋白原作為ICAN 預(yù)測性生物標(biāo)志物的作用，高纖維蛋白原的患者經(jīng)過CAR-T 治療后罹患ICANS的風(fēng)險(xiǎn)更高，并且治療后纖維蛋白原的水平會(huì)有較大幅度的下降。

5 展 望

從技術(shù)手段上來說，應(yīng)該致力于設(shè)計(jì)改造單一的CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)，克服CAR-T療法治療惡性腫瘤面臨的一系列困難；從治療效果看，應(yīng)該著力于提高CAR-T療法的有效性和安全性，規(guī)避CAR-T療法帶來的毒副作用。或許隨著雙特異性CAR-T 細(xì)胞［40］、多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞［41］以及CAR-T與其他傳統(tǒng)或新興的抗腫瘤療法的聯(lián)合應(yīng)用的發(fā)展，CAR-T在女性高發(fā)惡性腫瘤乃至實(shí)體瘤方向的治療水平會(huì)進(jìn)入更廣闊的領(lǐng)域。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突