張洪欽 江 裕 陳子凌 何文慧 鄭伯仁

福州市第二醫(yī)院藥劑科（福建福州 350007）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是世界上最常見的死亡原因之一，患病率為萬分之二。AS主要由低密度脂蛋白膽固醇升高引起，其主要癥狀是內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞過度增殖和淋巴細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的內(nèi)膜增生［1］，使管腔變窄并減少流向靶組織的血流量［2］。外泌體在細(xì)胞間通信中非常有效，因?yàn)樗鼈兡軌蛞员Ｗo(hù)性方式傳輸可生物降解的分子。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，不同細(xì)胞分泌的旁分泌外泌體通過其蛋白質(zhì)和非編碼RNA成分在AS中起著至關(guān)重要的作用，這可能成為AS的治療方法［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后受損心肌細(xì)胞釋放高表達(dá)糖蛋白 Ib 血小板亞基α（glycoprotein Ib platelet subunit alpha，GP1BA）的外泌體，觸發(fā)了血管生成。GP1BA是GPIb-Ⅸ-V復(fù)合物最重要的亞基，充當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙標(biāo)志物血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和凝血酶受體，通過與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等信號(hào)途徑相互作用，誘導(dǎo)血小板黏附和活化，加速血栓形成［5］。敲除GPIBA基因則能減輕小鼠AS。GPIBA被認(rèn)為是血栓治療靶點(diǎn)之一，并研發(fā)了相關(guān)抗血小板制劑。既往對(duì)免疫細(xì)胞、干細(xì)胞外泌體調(diào)節(jié)和治療心血管疾病進(jìn)行了大量研究［4］。但是，外泌體攜帶及運(yùn)輸GP1BA對(duì)AS的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)：2021023），納入本院2022年1月—2023年1月收治的選取30例心電圖提示ST-T改變及冠狀動(dòng)脈造影顯示有AS斑塊的患者為動(dòng)脈粥樣硬化組，其中男19例、女11例，年齡（65.3±10.8）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①有完整、詳實(shí)病例資料，如出入院記錄及所需檢查資料等：②具有血脂基線數(shù)據(jù)資料；③年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝功能不全；②入院前1個(gè)月發(fā)生過心肌梗死，心功能分級(jí)大于Ⅲ級(jí)者；③患有腎病綜合征或慢性腎臟病≥4期；④患有甲狀腺功能亢進(jìn)或減退；⑤感染性疾病急性期；⑥惡性腫瘤、結(jié)核等全身消耗性疾?。虎呖梢鹬|(zhì)代謝異常的疾病，如庫欣病等；⑧長期采用糖皮質(zhì)激素治療者。收集同期體檢無上述異常的志愿者30例為對(duì)照組，其中男19名、女11名，年齡（59.0±13.8）歲。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無心腦血管疾病史且臨床三大常規(guī)檢查均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：有精神意識(shí)障礙、不愿配合本研究或意識(shí)交流等困難者。2組一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究均經(jīng)患者或家屬同意并自愿簽署知情同意書。

1.2 外泌體提取與鑒定

收集血清樣本，500×g離心10 min后，用0.22 μm無菌過濾器過濾細(xì)胞碎片和大囊泡；轉(zhuǎn)移至裝有超濾膜的超濾儀，氮?dú)饧訅哼^濾；100 000×g離心40 min，收集沉淀。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：外泌體置于pH 7.4的2%甲醛+ 1.5%戊二醛磷酸鈉，4 ℃固定2 h，蛋白質(zhì)印跡雜交膜清洗液（Tris-buffered saline，TBS）漂洗；1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀固定2.5 h，TBS漂洗。梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片。3%醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，電鏡觀察。外泌體粒徑分析：ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體濃度粒徑，ZetaView 8.04.02 SP2軟件獲取外泌體粒徑直徑及濃度。蛋白質(zhì)提取，加入載樣緩沖液，95 ℃水浴加熱5 min；雙吡啶甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量；上樣，SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育一抗（標(biāo)志蛋白跨膜四蛋白-29（the cluster of differentiation 9，tetraspanin-29，CD9）、跨膜四蛋白-28（the cluster of differentiation 81，tetraspanin-28，CD81）、鈣連接蛋白（Calnexin）和腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101，TSG101）（均購于北京索萊寶科技有限公司），稀釋倍數(shù)均為1∶1 000），過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光成像，凝膠圖像分析。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量（real time quantitative，RTqPCR）

樣本中加入NucleoZol提取總RNA，cDNA合成，PCR擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法分析GP1BA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 蛋白免疫印跡

提取樣本中的外泌體后，BCA法定量；上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育一抗（β-actin，購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司）］，1∶1 000，GP1BA （購于北京索萊寶科技有限公司），1∶500）過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光成像，凝膠圖像分析。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

根據(jù)試劑盒（均購于武漢博士德生物工程有限公司）說明書操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、高敏肌鈣蛋白（high sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，正態(tài)性分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示。數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Pearson分析相關(guān)性。P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體提取與鑒定

納入30例動(dòng)脈粥樣硬化患者為動(dòng)脈粥樣硬化組和30例健康者為對(duì)照組。電鏡結(jié)果和粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示，血清外泌體平均粒徑大小在100 nm，符合外泌體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（圖1A、B）。蛋白免疫印跡檢測(cè)標(biāo)志蛋白CD9、CD81和TSG101結(jié)果顯示均檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白，Calnexin為外泌體陰性標(biāo)志蛋白，均檢測(cè)不到，表明外泌體提取成功（圖1C）。

圖1 外泌體鑒定

2.2 外泌體中GP1BA表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)RT-qPCR結(jié)果可得在動(dòng)脈粥樣硬化組中的GP1BA的表達(dá)量高于對(duì)照組（圖2A，P＜0.05），蛋白免疫印跡結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化組中的GP1BA的蛋白水平高于對(duì)照組（圖2B，P＜0.05）。

圖2 外泌體GP1BA 表達(dá)量檢測(cè)

2.3 血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hscTnT、vWF含量檢測(cè)

通過ELISA法檢測(cè)2組受試者血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ及血管和心肌損傷標(biāo)志物hs-cTnT、vWF含量發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及血管和心肌損傷標(biāo)志物hs-cTnT、vWF含量均高于對(duì)照組（圖3，P＜0.05）。

圖3 ELisa 檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF 含量

2.4 GP1BA與血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF的相關(guān)性

對(duì)外泌體中的G P 1 B A 的表達(dá)量與血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，GP1BA與TNF-α（r=0.632）、IL-1β（r=0.549）、IFN-γ（r=0.572）、hs-cTnT（r=0.533）、vWF（r=0.597）均存在相關(guān)性（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 GP1BA 與TNF-α、IL-1β、IFN-γ、hs-cTnT、vWF 含量的相關(guān)性分析

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化涉及動(dòng)脈壁中纖維脂肪病變或斑塊的形成。動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程包括內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成和斑塊形成。本研究收集動(dòng)脈粥樣硬化患者與健康志愿者檢測(cè)炎癥因子發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中的炎癥因子水平升高。有研究表明在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中，動(dòng)脈內(nèi)膜中的脂質(zhì)積聚是炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的根本原因。同時(shí)，血管和心肌損傷標(biāo)志物hs-cTnT、vWF也升高，表明動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管和心肌受到脅迫。而在動(dòng)脈粥樣硬化部位的脆弱斑塊破裂導(dǎo)致原位血栓形成和壁內(nèi)出血，導(dǎo)致缺血和中風(fēng)［6］。這與hscTnT、vWF表達(dá)量升高與動(dòng)脈粥樣硬化可造成血管損傷的結(jié)論相吻合。

細(xì)胞通信對(duì)于幾乎所有生理和病理過程都是必不可少的，包括動(dòng)脈粥樣硬化。除了廣泛接受的神經(jīng)傳遞和內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)外，細(xì)胞外囊泡還被認(rèn)為是細(xì)胞間通信的新參與者［7］，分為外泌體、凋亡體、微囊泡和其他囊泡。外泌體（直徑40~160 nm）［8］由幾乎所有細(xì)胞類型分泌，并攜帶生物分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物。我們提取的外泌體從電鏡結(jié)果看出是雙層膜結(jié)構(gòu)，且直徑約為70 nm，大小形態(tài)均符合外泌體特征，鑒定為外泌體。外泌體在跨越生物屏障方面也顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，并參與短距離和長距離的細(xì)胞間通訊［9］。因此，外泌體作為診斷和治療應(yīng)用的生物標(biāo)志物和藥物載體已被深入研究。在梗死后外泌體蛋白質(zhì)組中富集的功能，包括蛋白質(zhì)代謝，蛋白酶抑制劑活性，細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和細(xì)胞通信、生長、維持，以及血小板脫顆粒、止血和血液凝固的途徑。先前研究已經(jīng)表明，血小板是梗死心肌內(nèi)最早積累的炎癥細(xì)胞群之一［10］，在心肌梗死血漿外泌體中，發(fā)現(xiàn)GP1BA蛋白含量升高9.18倍，而在本研究中，動(dòng)脈粥樣硬化組的血清外泌體中的GP1BA含量也高于對(duì)照組，這可能與血管損傷相關(guān)。GP1BA能與vWF和纖維蛋白原有效結(jié)合，形成復(fù)合物并參與血小板聚集，動(dòng)脈粥樣硬化與血小板、巨噬細(xì)胞以及這些細(xì)胞釋放的物質(zhì)（包括生長因子）之間的相互作用有關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防的方法也包括：保護(hù)內(nèi)皮，特別是與維持其非血栓形成特征有關(guān)：抑制血小板相互作用［11］。通過相關(guān)性分析，我們結(jié)果也表明二者呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)。血小板還可以釋放促炎介質(zhì)并形成促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的血小板-白細(xì)胞復(fù)合物［12-13］，研究結(jié)果TNF-α、IL-1β、IFN-γ炎癥因子顯著升高與前人研究結(jié)果相似。由此猜測(cè)，TNF-α、IL-1β、IFN-γ炎癥因子增多促進(jìn)GP1BA與vWF形成復(fù)合體，加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

綜上所述，血清外泌體中的GP1BA的表達(dá)水平與動(dòng)脈粥樣硬化存在相關(guān)性，可作為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在標(biāo)志物。